专利名称:多组分核酸酶及其使用方法
技术领域:
本发明涉及多组分催化核酸及其使用方法。更具体地,本发明涉及包含自组装的多组分核酸酶的组合物,所述组合物的制备方法,和所述组合物的使用方法,包括通过检测所述多组分核酸酶对底物的催化修饰来检测、鉴定和/或定量诸如组装易化子和其它实体的靶。
背景技术:
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核酸分子能够采用可赋予酶促或催化活性的二级结构构型。体外演化技术已经促进了这种催化核酸的发现和开发,这种催化核酸通常被称为“DNA酶”或“核酶”,能够催化大范围的反应,包括核酸酶切(Carmi et al.,1996;Raillard and Joyce,1996;Breaker,1997;Santoro andJoyce,1998)、核酸的连接(Cuenoud and Szostak,1995)、卟啉金属化(Liand Sen,1996),以及形成碳碳键(Tarasow et al.,1997)、酯键(Illangasekare et al.,1995)或酰胺键(Lohse and Szostak,1996)。
具体地,已经表征出在通过Watson Crick碱基配对杂交之后特异性酶切不同核酸序列的DNA酶和核酶。DNA酶能够酶切RNA(Breaker and Joyce,1994;Santoro and Joyce,1997)或DNA(Carmi et al.,1996)分子。催化RNA分子(核酶)也能够酶切RNA(Haseloff and Gerlach,1988)和DNA(Raillard and Joyce,1996)两种序列。大多数核酸酶的催化酶切速率取决于二价金属离子如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+(Santoro and Joyce,1998;Brown et al.,2003)的存在和浓度。
催化核酸如锤头核酶和10:23和8:17DNA酶具有多个结构结构域。它们具有保守的催化结构域(催化核),其侧邻有两个非保守的底物结合结构域(“杂交臂”),即与所述底物特异结合的序列区域。Haseloff和Gerlach工程化了锤头核酶,其以将两个保守结构域合在一起形成催化核的茎环结构而命名(Haseloffhe and Gerlach,1988)。所述“10:23”和“8:17”DNA酶能够在特定的磷酸二酯键处酶切核酸底物(Santoroand Joyce,1997)。所述10:23DNA酶具有15个脱氧核苷酸的催化结构域,所述结构域侧邻两个底物识别臂。所述8:17DNA酶具有14个脱氧核苷酸的催化结构域,所述结构域也侧邻两个底物识别臂。
催化核酸能够酶切具有满足最低要求的靶序列的核酸底物。所述底物序列必须与所述催化核酸的所述杂交臂基本上互补,并且所述底物在酶切位点必须含有特定序列。酶切位点处特定的序列要求包括,例如由所述10:23DNA酶酶切的嘌呤:嘧啶核苷酸序列(Santoro andJoyce,1997)以及由所述锤头核酶切的序列尿苷X(Perriman et al.,1992),其中X能够是A、C、或U,但不能是G。
已经证实催化核酸在形成所述催化核的区域仅容许某些修饰(Perreault et al.,1990;Perreault et al.,1991;Zaborowska et al.,2002;Cruz et al.,2004;Silverman,2004)。负责DNA酶催化活性的序列的实例列于表1中。
表1某些活性DNA酶及其底物的代表性序列
已经尝试在某些条件下用某些脱氧核糖核苷酸取代已知的核酶中的某些核苷酸(McCall et al.,1992)。由于RNA和DNA的构象差异,已经完全转化成DNA的核酶没有活性(Perreault et al.,1990)。这些研究表明仅通过用脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸不能够将RNA酶修饰成工作DNA酶。
已有一些研究尝试开发应用于治疗用途的某些同二聚体或异二聚体核酶(Kuwabara et al.,1999;Kuwabara et al.,2000;Oshima et al.,2003)。在那些研究中,所述核酶的所述催化核只由核苷酸组成。此外,尚未考虑DNA酶在二聚体或多聚体形式中起作用的能力,也未提供关于如何根据二聚体DNA酶的可能结构从二聚体核酶推断出二聚体DNA酶和因而产生的活性的信息。
催化核酸已经作为产生可检测信号的手段用于与体外扩增程序组合,从而能够实时监测所扩增的核酸靶序列(Todd et al.,2000)(US6,140,055;US 6,201,113;WO 99/45146;PCT/IB99/00848;WO99/50452)。酶原检测(US 6,140,055;US 6,201,113;WO 99/45146;PCT/IB99/00848;WO 99/50452)在本领域也称为DzyNA检测(Todd etal.,2000),导致靶和信号扩增共存。产生这种情形是因为所述催化DNA酶或核酶与靶序列共扩增产生扩增子,所述扩增子具有能够多种折叠的真正酶的作用。这样,每一催化核酸扩增子酶切多个报告底物。通过使用具有5’标签的引物将所述DNA酶和核酶引入所述扩增子,所述引物是催化核酸的惰性、反义序列。在体外扩增期间复制这些序列时,所述催化活性有义序列与靶序列共扩增。所述酶原/DzyNA方法非常灵活,因为催化信号扩增能够与靶扩增方法联用,所述靶扩增方法包括产生DNA酶扩增子的PCR(聚合酶链反应)、单链置换扩增(“SDA”)、或滚环扩增(“RCA”);和产生核酶扩增子的扩增方法依赖核酸序列的扩增(“NASBA”)、自主序列复制(“3SR”)或转录介导的扩增(“TMA”)。另外,由于已经发现或离析出许多具有广泛催化活性的催化核酸分子,所述酶原方法能够使用报告底物而非核酸,其中检测的信息显示取决于核酸底物的化学修饰而非酶切。所述酶原/DzyNA(Todd et al.,2000)或NASBA方法/核酶(WO 00/58505)方法可以被视为灵敏有用,但由于扩增引物序列而可能有噪音。
已经使用NASBA制造RNA扩增子,所述扩增子含有靶核酸和所述锤头核酶的所述催化核的一个片段(GAArA),作为标记到引物上并然后复制的反义序列被引入(WO 00/58505)。将催化活性所需的另外的序列(CUrGANrGrA)作为有义序列引入到第二分子上,所述第二分子用荧光基团和淬灭基团标记,并且也用作报告底物。某些核苷酸碱基(上述的rN)必须作为核苷酸保留,否则将失去催化核酶活性。全部由DNA组成的两个分子被认为不能形成催化活性异二聚体酶(WO00/58505)。
也已将催化核酸用于检测单核苷酸多态性(“SNP”)。对所述催化核酸结合臂与所述底物之间Watson Crick碱基配对的严紧要求使得能够开发能区分十分相关的短序列的方法。已经证明DNA酶和核酶可以在差别小到单一碱基的两个序列之间进行区分。
DNA酶具有这样一些性质,即所述性质在某些体外应用方面与核酶相比具有优势。DNA固有地比RNA更稳定,因此更坚固、储存期更长。DNA能够在室温下长期储存,无论在溶液中还是以冻干形式。在某些应用中DNA酶也比大多数蛋白质酶更为优选,因为例如,在扩增期间暴露于高温时它们不会发生不可逆变性。
因此,本领域亟需检测、鉴定和定量核酸序列及其它实体的简单、快速并且划算的方法,所述方法优选提供基于DNA酶和/或核酶的催化核酸。
发明概述 根据本发明的第一方面,提供包含至少两种或更多种寡核苷酸组分的组合物,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在MNAzyme组装易化子的存在下自组装形成催化活性多组分核酸酶(MNAzyme),其中每一所述至少第一和所述第二寡核苷酸组分包含底物臂部分、催化核部分和感应臂部分;其中自组装时,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述感应臂部分用作所述MNAzyme的感应臂,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述底物臂部分用作MNAzyme的底物臂,并且所述第一和第二寡核苷酸组分的所述催化核部分用作所述MNAzyme的催化核; 并且其中所述MNAzyme的所述感应臂与所述MNAzyme组装易化子相互作用以便维持所述第一和第二寡核苷酸组分的邻近使得它们各自的催化核部分缔合形成所述MNAzyme的所述催化核,所述催化核能够修饰至少一种底物,并且其中所述MNAzyme的所述底物臂接合底物使得所述MNAzyme的所述催化核能够修饰所述底物。
所述寡核苷酸组分、组装易化子或底物的至少之一可以包含DNA或其类似物。
所述组装易化子可以是待鉴定、检测或定量的靶。所述靶可以包含核酸。所述核酸可以选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、短干扰RNA、短发夹RNA、转运RNA、信使RNA、核仁小分子RNA、小型临时RNA、调节性小RNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物、扩增子或上述的任意组合。所述核糖体RNA可以是16S核糖体RNA。
核酸的来源可以选自合成、哺乳动物、人类、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌(archael)或上述的任意组合。
可以扩增所述核酸。所述扩增可以包含下述的一种或多种聚合酶链反应(PCR)、单链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
所述组合物还可以包含至少第三寡核苷酸组分,所述第三核苷酸可稳定所述底物臂部分或感应臂部分的至少之一。
所述组装易化子、所述寡核苷酸组分或底物的至少之一或上述的组合可以由多于一个的分子组成。
所述第一核苷酸组分的所述催化核部分可以选自SEQ ID NO149-153、155-157、159和161,并且所述第二寡核苷酸组分的所述催化核部分可以选自SEQ ID NO 166-170和172。
所述组合物还可以包含所述MNAzyme的所述自组装的至少一种抑制因子。
所述寡核苷酸组分或组装易化子或底物或其组合还可以包含至少一种适体或其部分。所述适体或其部分可以由核酸、肽、多肽或蛋白的至少之一或其衍生物或其组合组成。
所述组合物可以还包含所述MNAzyme的所述自组装的至少一种抑制因子。
所述第一或所述第二寡核苷酸组分或所述组装易化子或所述底物的至少之一还可以包含能够形成发夹结构的至少一部分自互补序列。所述发夹结构可以抑制所述MNAzyme的所述自组装。自组装的所述抑制可以在适体与靶接触时被解除。所述适体或其部分可以与靶结合,所述靶选自核酸、蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合。
所述底物可以包含核酸或蛋白。所述核酸可以包含标记核酸、RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体中的至少之一或上述的任意组合。所述蛋白可以包含抗体、多肽、糖蛋白、脂蛋白中的至少之一或上述的任意组合。所述底物还可以包含纳米颗粒或微粒中的至少之一或上述的组合。所述底物可以附着到不溶性载体(support)上或在溶液中游离。所述底物可以包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。
所述底物臂可以通过互补碱基配对而接合所述底物。
所述MNAzyme对所述底物的所述修饰可以提供可检测的作用。所述底物的修饰选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键,或上述的任意组合。所述可检测作用的检测方法可以通过荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,NMR(核磁共振),电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,UV(紫外)、可见光或红外光谱,酶促方法,或上述的任意组合。可以测量所述可检测作用,其中所述测量的大小提示所述靶的量。
所述寡核苷酸组分、所述组装易化子或所述底物的至少之一可以选自DNA、RNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体或上述的组合。所述组装易化子和所述底物可以包含与至少部分所述第一或第二寡核苷酸组分全部或部分互补的核酸。所述寡核苷酸组分、所述组装易化子或所述底物的至少之一可以包含核苷酸取代或添加中的至少一种,所述核苷酸选自4-乙酰胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫基代尿苷、二氢尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β,D-半乳糖基Q核苷、2’-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、β,D-甘露糖基甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-硫代甲基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-硫代甲基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰)苏氨酸、尿苷-5-氧基乙酸甲基酯、尿苷-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷、βD-阿拉伯糖基尿苷、βD-阿拉伯糖基胸苷。
所述组合物还可以包含在至少一种另外的组装易化子的存在下自组装形成至少一种另外的催化活性MNAzyme的至少第三寡核苷酸组分和第四寡核苷酸组分,其中每一所述至少第三和第四寡核苷酸组分包含底物臂部分、催化核部分和感应臂部分; 其中当至少第三寡核苷酸组分和第四寡核苷酸组分自组装时,所述至少第三和所述至少第四寡核苷酸组分的所述感应臂部分形成所述至少一种另外的催化活性MNAzyme的感应臂,所述至少第三和所述至少第四寡核苷酸组分的所述底物臂部分形成所述至少一种另外的催化活性MNAzyme的底物臂,并且所述至少第三和所述至少第四寡核苷酸组分的所述催化核部分形成所述至少一种另外的催化活性MNAzyme的催化核; 并且其中所述至少一种另外的MNAzyme的所述感应臂与所述至少一种另外的组装易化子相互作用以便维持所述至少第三和所述至少第四寡核苷酸组分的邻近使得它们各自的催化核部分缔合形成所述至少一种另外的MNAzyme的所述催化核,所述催化核能够作用于至少一种另外的底物,并且其中所述至少一种另外的MNAzyme的所述底物臂接合至少一种另外的底物使得所述至少一种另外的MNAzyme的所述催化核能够作用于所述至少一种另外的底物。
每一所述另外的底物可以相同、不同或是其组合。
根据本发明的第二方面,提供了检测至少一种组装易化子存在的方法,其包括 (a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在组装易化子的存在下自组装形成至少一种催化活性多组分核酸酶(MNAzyme); (b)在允许下述情况的条件下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述组装易化子的样品接触 (1)所述至少一种催化活性MNAzyme的所述自组装,和 (2)所述MNAzyme的所述催化活性;和 (c)确定所述至少一种MNAzyme的所述催化活性的存在,其中所述催化活性的存在提示所述至少一种组装易化子的存在。
所述寡核苷酸组分或组装易化子的至少之一可以由DNA或其类似物组成。
所述组装易化子可以是待鉴定、检测或定量的靶。所述靶可以包含核酸。所述核酸可以选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、短干扰RNA、短发夹RNA、转运RNA、信使RNA、核仁小分子RNA、小型临时RNA、调节性小RNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物、扩增子或上述的任意组合。所述核糖体RNA可以是16S核糖体RNA。
所述核酸的来源可以选自合成、哺乳动物、人类、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或上述的任意组合。
该方法还可以包含扩增所述组装易化子的步骤。所述扩增步骤可以包含下述的一种或多种聚合酶链反应(PCR)、单链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
所述组装易化子、所述寡核苷酸组分或底物的至少之一或上述的组合可以由多于一个的分子组成。
该方法还可以包括在所述扩增期间或之后确定所述催化活性的存在。
所述MNAzyme的所述自组装可以需要所述组装易化子与所述第一和第二寡核苷酸组分之一接触或与两者都接触。
所述方法还可以包含与所述第一和第二寡核苷酸组分之一或两者的至少一部分接触以自组装MNAzyme的至少第三寡核苷酸组分。所述第三寡核苷酸组分可以由多于两个的分子组成。
根据本发明的第三方面,提供检测至少一种组装易化子的存在的方法,其包括 (a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在至少第一组装易化子的存在下自组装形成至少第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme); (b)提供至少第一底物,所述第一底物能够被所述第一MNAzyme修饰,其中所述MNAzyme对所述底物的所述修饰提供可检测作用; (c)在允许下述情况的条件下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述至少第一组装易化子的样品接触 (1)所述至少第一MNAzyme的所述自组装,和 (2)所述至少第一MNAzyme的所述催化活性;和 (d)检测所述可检测作用。
所述寡核苷酸组分、组装易化子或底物的至少之一可以由DNA或其类似物组成。
所述组装易化子可以是待鉴定、检测或定量的靶。所述靶可以包括核酸。所述核酸可以选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、短干扰RNA、短发夹RNA、转运RNA、信使RNA、核仁小分子RNA、小型临时RNA、调节性小RNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物、扩增子,或上述的任意组合。核糖体RNA可以是16S核糖体RNA。
核酸的来源可以选自合成、哺乳动物、人类、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或上述的任意组合。
该方法还可以包括扩增核酸的步骤。扩增步骤可以包括下述的一种或多种聚合酶链反应(PCR)、单链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
所述组装易化子或所述第一或所述第二寡核苷酸组分或底物的至少之一或上述的组合中可以由多于一个的分子组成。
该方法还可以包括在所述扩增期间或之后检测所述可检测作用。所述可检测作用可以提示所述组装易化子的存在。所述可检测作用可以定量或定性地测量。
所述底物可以是核酸或蛋白。所述核酸可以包括标记核酸、RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体中的至少之一或上述的任意组合。所述蛋白可以包括抗体、多肽、糖蛋白、脂蛋白中的至少之一或上述的任意组合。所述底物还可以包括纳米颗粒或微粒中的至少之一或上述的组合。所述底物可以附着到不溶性载体上或在溶液中游离。
所述底物可以包括核酸并且所述底物臂可以通过互补碱基对接合所述底物。
所述底物可以包括可检测部分和淬灭基团部分,其中MNAzyme修饰底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。所述可检测作用可以通过如下方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
该方法还可以包括通过使用可检测作用扩增级联扩增可检测作用。可检测作用扩增级联可以包括一个或多个核酶/连接酶级联、循环核酸酶级联、蛋白质酶级联或附着到载体上的一种或多种酶,或上述的任意组合。
所述底物的修饰可以选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。
该方法还可以包括提供至少第三和第四寡核苷酸组分,所述至少第三和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的组装易化子的存在下能够自组装形成至少一种另外的催化活性MNAzyme,和 其中样品中存在至少一种另外的底物,所述另外的底物能由所述另外的MNAzyme修饰,其中所述修饰提供所述另外的可检测作用。
所述至少一种另外的可检测作用可以独立地检测到。
各另外的底物中的至少之一可以附着到不溶性载体上使得在所述另外的MNAzyme修饰所述另外的底物时,所述另外的底物的可检测部分和淬灭基团部分中仅有一者仍附着在所述载体上。
一种另外的底物可以附着到至少一种不溶性载体上使得在其各自的MNAzyme修饰该底物时产生可检测作用。
根据本发明的第四方面,提供检测至少一种靶存在的方法,其包括 (a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和至少第二寡核苷酸组分在所述靶的存在下能够自组装形成催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);并且其中所述第一和所述第二寡核苷酸组分中的至少之一还包含至少一种适体的部分; (b)在允许下述情况的条件下,使所述寡核苷酸组分与推定含有所述至少一种靶的样品接触 (1)所述靶结合所述适体的部分和 (2)所述MNAzyme的催化活性;和 (c)确定所述MNAzyme的所述催化活性的存在,其中所述催化活性的存在提示所述靶的存在。
所述寡核苷酸中的至少之一可以附着到固体载体上。
所述寡核苷酸中的至少之一可以由DNA或其类似物组成。
所述靶可以被鉴定、检测或定量。
该方法还可以包含提供至少第三和第四寡核苷酸组分,所述至少第三和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的靶的存在下能够自组装形成至少一种另外的催化活性MNAzyme。
并且其中所述第三或第四寡核苷酸组分中的至少之一包含与所述至少一种另外的靶结合的至少一种另外的适体的部分。
根据本发明的第五方面,提供检测至少一种靶存在的方法,其包括 (a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在至少一种组装易化子和所述至少一种靶的存在下能够自组装形成至少一种催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);并且其中所述第一和所述第二寡核苷酸组分中的至少之一或所述至少一种组装易化子还包含至少一种适体或其部分,且其中所述靶能够与所述至少一种适体或其部分结合; (b)提供所述MNAzyme的所述自组装的至少一种抑制因子; (c)在允许下述情况的条件下,使所述寡核苷酸组分、组装易化子和所述抑制因子与推定含有所述至少一种靶的样品接触 (1)所述靶结合所述适体或其部分,和 (2)所述至少一种MNAzyme的催化活性;和 (3)解除所述催化活性MNAzyme的所述自组装的所述抑制;和 (d)确定所述MNAzyme的所述催化活性的存在,其中所述催化活性的存在提示所述靶的存在。
所述至少一种靶可以选自蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、核酸或上述的任何衍生物、部分或组合。
所述寡核苷酸组分、组装易化子或抑制因子的至少之一可以附着到不溶性体载体上。
所述寡核苷酸组分、组装易化子、适体或适体的部分的至少之一还可以包含所述抑制因子。
所述第一或所述第二寡核苷酸组分或组装易化子的至少之一还可以包含能够形成发夹结构的部分自互补序列。所述发夹结构可以抑制所述催化活性MNAzyme的自组装。
所述适体或其部分可以由核酸、肽、多肽或蛋白中的至少之一或其衍生物或组合组成。
所述催化活性MNAzyme的自组装的所述抑制可以在所述适体或适体的部分与所述靶接触时被解除。
所述抑制因子能够与所述适体或其部分中的至少之一结合。
所述抑制因子可以选自RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体或上述的组合。
所述方法还可以包括提供能够由所述MNAzyme修饰以提供可检测作用的底物。所述修饰可以选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。在缺少所述组装易化子和所述靶时,所述底物不被所述第一或第二寡核苷酸组分单独修饰或不被所述第一和第二寡核苷酸组分两者修饰。
所述底物可以包含核酸或蛋白。所述核酸包含标记核酸、RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体中的至少之一或上述的任意组合。所述蛋白可以包含抗体、多肽、糖蛋白、脂蛋白中的至少之一或上述的任意组合。
所述底物还可以包含纳米颗粒或微粒中的至少之一或上述的组合。
检测到所述可检测作用可以提示所述催化活性MNAzyme的所述催化活性,并且其中所述催化活性提示所述靶。所述可检测作用可以定量或定性地测量。所述可检测作用可以通过如下方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
所述底物可以包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。
根据本发明的第六方面,提供检测至少一种靶存在的方法,其包括 (a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在至少第一组装易化子和所述至少第一靶的存在下能够自组装形成至少第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme); (b)提供至少第一底物,所述至少第一MNAzyme能够修饰所述第一底物,其中所述MNAzyme对所述底物的所述修饰提供可检测作用; (c)其中所述第一或所述第二寡核苷酸组分或所述至少第一组装易化子或所述至少第一底物的至少之一还包含适体,并且其中所述靶能够与至少部分所述适体结合,提供至少第一抑制因子,所述第一抑制因子在缺少所述靶时能够抑制所述催化活性MNAzyme的所述自组装; (d)在允许下述情况的条件下,使所述寡核苷酸组分、所述组装易化子、所述底物和所述抑制因子与推定含有所述靶的样品接触 (1)所述靶结合所述适体,和 (2)解除所述催化活性MNAzyme的所述自组装的所述抑制 (3)所述MNAzyme的催化活性;和 (e)确定所述可检测作用的存在,从而检测所述靶的存在。
所述寡核苷酸组分或组装易化子的至少之一可以由DNA或其类似物组成。
所述适体或其部分可以与靶结合,所述靶选自核酸、蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合。
所述寡核苷酸组分、组装易化子、底物或抑制因子中的至少之一可以附着到不溶性载体上。
所述寡核苷酸组分、组装易化子、适体或适体的部分还可以包含所述抑制因子。
所述适体或其部分可以由核酸、肽、多肽或蛋白中的至少之一或其衍生物或组合组成。
所述第一和所述第二寡核苷酸组分、组装易化子或底物的至少之一还可以包含能够形成发夹结构的部分自互补序列。所述发夹结构可以抑制所述催化活性MNAzyme的自组装。所述催化活性MNAzyme的自组装的所述抑制可以在所述适体或适体的部分与所述靶接触时被解除。
所述抑制因子能够与所述适体或其部分中的至少之一结合。所述抑制因子可以选自RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体或上述的任意组合。
所述底物可以包含核酸或蛋白。所述核酸可以包含标记核酸、RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体中的至少之一或上述的任意组合。所述蛋白可以包含抗体、多肽、糖蛋白、脂蛋白中的至少之一或上述的任意组合。
所述底物还可以包含纳米颗粒或微粒中的至少之一或上述的组合。
检测所述可检测作用可以检测所述靶的存在。所述可检测作用可以定量或定性地测量。所述可检测作用可以通过如下方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
所述底物可以包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。所述修饰可以选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。
所述方法还可以包含提供至少第三和第四寡核苷酸组分,其中所述至少第三和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的组装易化子和至少一种另外的靶的存在下能够自组装形成至少一种另外的催化活性MNAzyme,和 其中所述样品中存在至少一种另外的底物,所述另外的MNAzyme能够修饰所述另外的底物,其中所述修饰提供另外的可检测作用; 并且其中所述第三或第四寡核苷酸组分或所述另外的组装易化子或所述另外的底物的至少之一还包含至少一另外的适体,所述适体与所述至少一种另外的靶结合; 其中至少一种另外的抑制因子分子与部分所述另外的适体接触,从而在缺乏所述另外的靶时抑制所述另外的催化活性MNAzyme的所述自组装;和 其中所述至少一种另外的组装易化子与至少部分所述另外的寡核苷酸组分接触。
所述至少一种另外的可检测作用可以独立地可检测。
每一所述另外的底物可以相同、不同或是其组合。
每一另外的底物中的至少之一可以附着到不溶性载体上使得在所述另外的MNAzyme修饰所述另外的底物时,所述另外的底物的可检测部分和淬灭基团部分中仅有一者仍附着在所述载体上。
根据本发明的第七方面,提供检测至少一种核酸的序列变异存在的方法,其包括 (a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在核酸的序列变异的存在下自组装形成催化活性多组分核酸酶(MNAzyme); (b)提供至少一种底物,所述第一MNAzyme能够修饰所述底物,其中所述MNAzyme对所述底物的所述修饰提供可检测作用; (c)在允许下述情况的条件下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述序列变异的样品接触 (1)所述催化活性MNAzyme的所述自组装,和 (2)所述MNAzyme的所述催化活性;和 (d)确定所述可检测作用的存在,从而检测所述至少一种序列变体的存在。
所述序列变异可以选自单核苷酸多态性、多核苷酸多态性、插入、缺失、复制、易位、移码序列变异、无义序列变异或上述的任意组合。所述序列变异可存在于DNA或RNA中。
所述第一寡核苷酸组分和所述第二寡核苷酸组分任一者或两者可以由多于一个的分子组成。
含有所述序列变异的样品可以选自亚硫酸氢盐修饰的甲基化或非甲基化DNA、亚硫酸氢盐修饰的甲基化或非甲基化RNA、亚硫酸氢盐修饰的甲基化或非甲基化DNA中的至少一种扩增子、亚硫酸氢盐修饰的甲基化或非甲基化RNA中的至少一种扩增子或上述的组合。
所述多组分核酸酶的所述自组装可以需要所述第一和第二寡核苷酸组分的任一者或两者的至少一部分与包含所述序列变异的所述核酸接触。
该方法还可以包括扩增含有所述序列变异的所述核酸的步骤。所述扩增步骤可以包括下述的一种或多种聚合酶链反应(PCR)、单链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。该方法还可以包括在所述扩增期间或之后确定所述核酸序列变异的存在。
所述可检测作用可以通过如下方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
所述底物可以包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。
所述底物可以附着到不溶性载体上或在溶液中游离。
所述修饰可以选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。
该方法还可以包括 (a)提供至少第三寡核苷酸组分和至少第四寡核苷酸组分,所述至少第三寡核苷酸组分和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的核酸的序列变异的存在下自组装形成至少一种另外的催化活性多组分核酸酶(MNAzyme); (b)在允许下述情况的条件下,使所述至少第三和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的底物的存在下与推定含有至少一种另外的核酸的序列变异的样品接触,所述至少一种另外的MNAzyme能够修饰所述至少一种另外的底物,其中所述至少一种另外的底物的所述修饰提供至少一种另外的可检测作用 (1)至少一种MNAzyme的所述自组装,和 (2)至少一种MNAzyme的所述催化活性;和 (c)检测所述至少一种另外的可检测作用,从而检测所述至少一种另外的序列变异的存在。
所述至少一种另外的可检测作用可以独立地检测到。
每一所述另外的底物可以相同、不同或是其组合。
该方法还可以包括提供其上附着有所述底物的不溶性载体。
每一另外的底物中的至少之一可以附着到不溶性载体上使得在所述另外的MNAzyme修饰所述另外的底物时,所述另外的底物的可检测部分和淬灭基团部分中仅一者仍附着在所述载体上。
根据本发明的第八方面,提供检测核酸的序列变异存在的方法,其包括 (a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其包含在核酸的存在下能够自组装形成至少第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme)的至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分; (b)在允许下述情况的条件下,在可由所述至少第一MNAzyme修饰的至少第一底物的存在下使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述核酸的样品接触,其中所述底物包含在所述至少第一MNAzyme修饰所述底物时能够提供至少第一可检测作用的可检测部分 (1)所述MNAzyme的所述自组装,和 (2)所述MNAzyme的所述催化活性;和 (c)其中没有所述催化活性提示所述核酸中存在序列变异。
根据本发明的第九方面,提供检测至少一种甲基化核酸存在的方法,其包括 (a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在甲基化核酸的存在下自组装形成至少一种催化活性多组分核酸酶(MNAzyme); (b)提供至少第一底物,所述第一MNAzyme能够修饰所述第一底物,其中所述MNAzyme对所述底物的所述修饰提供至少第一可检测作用; (c)在允许下述情况的条件下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述甲基化核酸的样品接触 (1)所述催化活性MNAzyme的所述自组装,和 (2)所述MNAzyme的所述催化活性;和 (d)确定所述至少一种可检测作用的存在,从而检测所述至少一种甲基化核酸的存在。
所述条件还可以包括促进所述MNAzyme与所述甲基化核酸杂交但不与非甲基化核酸杂交的温度。
该方法还可以包括通过使用可检测作用扩增级联扩增所述可检测作用。所述可检测作用扩增级联可以包括一个或多个核酶/连接酶级联、循环核酸酶级联、蛋白质酶级联或附着到载体上的一种或多种酶,或上述的任意组合。
所述甲基化核酸的来源可以选自合成、哺乳动物、人类、动物酸、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或上述的任意组合。
所述甲基化核酸可以选自甲基化RNA或甲基化DNA。
所述多组分核酸酶的所述自组装可以需要所述甲基化核酸与所述第一和第二寡核苷酸组分一者接触或与两者都接触。
该方法还可以包括提供其上附着有所述底物或所述第一或第二寡核苷酸组分中的至少之一或上述的组合的不溶性载体。
所述可检测作用可以通过如下方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
所述底物可以包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。
所述修饰可以选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。
该方法还可以包括提供至少第三和第四寡核苷酸组分,其中所述至少第三和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的甲基化核酸的存在下能够自组装形成至少一种另外的催化活性MNAzyme,和 其中所述样品中存在至少一种另外的底物,所述另外的MNAzyme能够修饰所述另外的底物,其中所述修饰提供所述另外的可检测作用。
所述至少一种另外的可检测作用可以独立地检测到。
每一所述另外的底物可以相同、不同或是其组合。
所述另外的底物中的至少之一可以附着到不溶性载体上使得在所述另外的MNAzyme修饰所述另外的底物时,所述另外的底物的另外的可检测部分和另外的淬灭基团部分中仅一者仍附着在所述载体上。
根据本发明的第十方面,提供使用扩增级联检测至少一种组装易化子的方法,其包括 (a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其包括在至少第一组装易化子的存在下自组装形成至少第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme)的至少第一寡核苷酸组分和至少第二寡核苷酸组分; (b)提供其上附着有至少第一底物的不溶性载体,所述MNAzyme能够修饰所述第一底物,其中所述第一底物包含至少第三分子,所述第三分子包含在所述第一MNAzyme修饰所述第一底物时被释放的至少第一催化活性酶; (c)在允许下述情况的条件下,在其上附着有所述第一底物的所述不溶性载体的存在下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述组装易化子的样品接触 (1)所述MNAzyme的所述自组装,和 (2)所述MNAzyme的所述催化活性;和 (d)提供其上附着有至少第二底物的不溶性载体,所述第二底物可由所述第一催化活性酶分解,其中所述第二底物包含含有至少可检测部分的至少第四分子,所述可检测部分在所述第一酶修饰所述第二底物时被释放; (e)其中所述第一催化活性酶修饰多个所述第二底物从而释放多个可检测部分; (f)其中所述可检测部分在所述第一催化活性酶修饰所述第二底物后能够检测到; (g)其中检测到所述可检测部分提示存在所述组装易化子。
所述可检测部分还可以包含能够修饰所述第一底物从而释放另外的催化活性酶的另外的第二催化活性酶。所述第一或所述第二催化活性酶中的至少之一可以选自MNAzyme、DNA酶、核酶、产生水解作用的酶(hydrolytic enzyme)、限制性内切酶、外切酶、蛋白酶(proteases)、蛋白酶类(proteinases)、水解酶(hydrolases)、溶细胞酶、肽酶、二肽酶、酯酶、半胱天冬酶(caspases)、组织蛋白酶(cathepsisns)、脱巯基酶、酰胺酶、糖苷酶。
所述组装易化子可以包含待鉴定、检测或定量的靶。所述靶可以选自核酸、蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、核酸或上述的任何衍生物、部分或组合。所述核酸可以选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、短干扰RNA、短发夹RNA、转运RNA、信使RNA、核仁小分子RNA、小型临时RNA、调节性小RNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物、其扩增子或上述的任意组合。
根据本发明的第十一方面,提供使用MNAzyme介导的信号扩增级联检测靶的方法,其包括 (a)提供在所述靶的存在下自组装形成第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme)的第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分; (b)提供其上附着有第一和第二底物的不溶性载体,所述第一MNAzyme能够修饰所述第一和第二底物,其中所述第一和第二底物各自包含能够形成第二催化活性MNAzyme的至少第三和第四寡核苷酸组分,其中所述第三和第四寡核苷酸组分在所述第一MNAzyme修饰所述第一和第二底物时被释放; (c)提供其上附着有第三和第四底物的所述不溶性载体,所述第二MNAzyme能够修饰所述第三和第四底物,其中所述第三和第四底物各自包含能够形成第三催化活性MNAzyme的至少第五和第六寡核苷酸组分,其中所述第五和所述第六寡核苷酸组分在所述第二MNAzyme修饰所述第三和第四底物时被释放,和; (d)提供能够促进所述第二和所述第三MNAzyme的所述组装的组装易化子,和; (e)提供能够被所述第二MNAzyme修饰以提供可检测作用的第五底物; (f)在允许下述情况的条件下,在所述组装易化子的存在下,和在其上附着有所述第一、第二、第三和第四底物的所述不溶性载体的存在下,使所述第一和第二寡核苷酸组分与推定含有所述靶的样品接触 (1)所述第一、第二和第三MNAzyme的自组装,和 (2)所述第一、第二和第三MNAzyme的催化活性;和 (g)其中所述第三MNAzyme修饰所述第一和第二底物从而进一步提供所述第二MNAzyme,其中所述第二MNAzyme进一步修饰所述第三、第四和第五底物中的至少之一,从而进一步提供所述第三MNAzyme,从而进一步提供所述可检测作用,和; (h)其中检测到所述可检测作用提示存在所述靶。
所述靶可以待鉴定、检测或定量。所述靶可以选自核酸、蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、核酸或上述的任何衍生物、部分或组合。所述核酸可以选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、短干扰RNA、短发夹RNA、信使RNA、转运RNA、核仁小分子RNA、小型临时RNA、调节性小RNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物、其扩增子或上述的任意组合。
所述第五底物可以与所述第一、第二、第三或第四底物中的任一者相同或不同。
每一所述第一、第二、第三或第四底物可以存在于相同固体载体上或不同固体载体上或上述的任意组合。
所述第一、第二、第三或第四底物中的至少之一的所述修饰还可以提供可检测作用。
根据本发明的第十二方面,提供各自识别至少一组装易化子并修饰底物的多种多组分核酸酶(MNAzyme)的制备方法,所述方法包括 (a)提供待鉴定、检测或定量的多种组装易化子, (b)设计两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在一种组装易化子的存在下自组装形成催化活性多组分核酸酶(MNAzyme),其中每一所述至少第一和第二寡核苷酸组分包含底物臂部分、催化核部分和感应臂部分, 其中当自组装时,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述感应臂部分形成所述MNAzyme的感应臂,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述底物臂部分形成所述MNAzyme的底物臂,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述催化核部分形成所述MNAzyme的催化核; 并且其中所述MNAzyme的所述感应臂与组装易化子相互作用以便维持所述第一和第二寡核苷酸组分的邻近使得它们各自的催化核部分缔合形成所述MNAzyme的所述催化核,所述催化核能够作用于至少一底物,并且其中所述MNAzyme的所述底物臂接合底物使得所述MNAzyme的所述催化核能够修饰所述底物; (c)改变所述两种或更多种寡核苷酸组分使得所述第一和第二寡核苷酸组分的所述底物臂部分和所述催化核部分恒定不变,并且所述第一和第二寡核苷酸组分中的至少之一的所述感应臂部分适合于识别所述多种组装易化子中的另一种,和 (d)对于所述多种组装易化子中的每一种重复所述改变步骤。
根据本发明的第十三方面,提供检测多种靶的存在的试剂盒,其包含多种被设计用于组装多种MNAzyme的多种寡核苷酸组分和至少一种底物,每一所述MNAzyme对应于多种靶中的至少之一。
根据本发明的第十四方面,提供组装多种MNAzyme的试剂盒,其包含多种组装易化子、被设计用于组装多种MNAzyme的多种寡核苷酸组分和至少一种底物,每一所述MNAzyme对应于所述多种组装易化子中的每一种。
根据本发明的第十五方面,提供检测靶的试剂盒,其包含多种寡核苷酸组分和底物,所述寡核苷酸组分被设计用于组装对应于所述靶的MNAzyme。
附图简述 现在将仅通过举例的方式参考附图描述本发明的优选实施方案, 其中
图1MNAzyme的设计图示为MNAzyme的代表性设计的描述,其中部件酶(partzyme)A和B的底物臂部分(A)结合报告底物,所述报告底物上附着有荧光标记(左)和淬灭基团(右)。催化核部分(C)位于底物臂部分(A)和感应臂部分(B)之间。当感应臂部分(B)结合靶时,所述报告底物在MNAzyme酶切位点酶切,从而使荧光增强。
图2MNAzyme介导的靶检测策略图示为显示使用MNAzyme的靶检测方法的代表性应用流程图。MNAzyme能够用于(1)直接检测;(2)通过例如PCR、SDA、LAMP、RCA、TMA、3SR或NASBA检测在扩增期间或之后产生的扩增子;和(3)启动信号扩增级联。
图3使用MNAzyme和锚定通用底物的靶检测方法图示为代表性MNAzyme和使用MNAzyme的靶检测方法,所述MNAzyme酶切附着在载体上的底物。在该实施方案中,所述MNAzyme仅在组装易化子(靶)的存在下形成。当所述MNAzyme在荧光基团和淬灭基团之间酶切所附着的底物时,信号产生。如在此显示的那样,在荧光基团F和淬灭基团Q之间酶切时,导致荧光增加。通常,可以将该方法设计成使得一旦酶切发生时荧光基团F或淬灭基团Q中任一者仍附着在所述载体上。插图(i)仅有一种底物附着到所显示的所述载体上。插图(ii)可以在不同位置附着多种底物。每一种底物仅能由在特定MNAzyme组装易化子分子的存在下形成的MNAzyme酶切-在这里,靶1和2分别促进MNAzyme 1和2的自组装。因此,在该实施例中MNAzyme 1仅在靶1的存在下自组装且仅酶切底物1。类似地,MNAzyme 2仅在靶2的存在下自组装且仅酶切底物2。所述信号可以通过定位表面上的所述底物来定位,从而能够特异性检测不同的组装易化子。
图4靶检测的代表性方法图示为用MNAzyme检测靶分析物(An)的方法的实施例,所述靶分析物例如包括但不限于蛋白或小分子。该实施例显示通过MNAzyme酶切底物产生信号,所述底物用荧光基团(F)和淬灭基团(Q)标记。通常的设计可以以其它形式使用,借此信号通过非酶切的修饰产生和/或其中读出信息显示不是荧光的,而是例如比色的、放射性的等。在该图中阐述了三个通常的策略。(i)将结合靶分析物的适体与一部件酶(partzyme)连接(适体-部件酶,apta-partzyme)。该分子有自互补性,而且在缺乏靶分析物时不能够促进活性MNAzyme组装。还提供第二部件酶、底物和组装易化子。当特定靶分析物结合适体结构域时,所述适体-部件酶(apta-partzyme)中的所述互补碱基分开,使得所述适体-部件酶采取能够促进活性MNAzyme组装的构象。所述活性MNAzyme能够酶切所述底物并产生荧光。(ii)将结合靶分析物的适体与组装易化子连接。该分子有自互补性,而且在缺乏靶分析物时不能够引导所述部件酶排列并组装活性MNAzyme。还提供两种部件酶和底物。当特定靶分析物结合所述适体结构域时,所述组装易化子中的所述互补碱基分开,使得所述组装易化子采取能够引导活性MNAzyme的所述组装的构象。所述活性MNAzyme能够酶切所述底物并产生荧光。(iii)在底物的存在下温育各自含有部分适体的两种适体-部件酶。在缺乏靶分析物时,所述两种适体-部件酶不能够组装形成活性MNAzyme。当特定靶分析物存在并结合含有部分所述适体的两个所述结构域时,导致所述两种适体-部件酶十分接近并能够组装成活性MNAzyme。所述活性MNAzyme能够酶切所述底物并产生荧光。
图5PCR扩增微小RNA并用MNAzyme检测图示为扩增并检测短序列如微小RNA(miR)的MNAzyme策略的描述。该方法使用在3’末端结合所述miR并且具有不相关的延伸序列(如虚线框所示)的3’引物,,所述延伸序列可以((i)和(ii)部分,环引物,左)或不可以((iii)和(iv)部分,标记引物,右)在5’末端形成茎环结构。在逆转录酶的存在下延伸所述3’miR引物((i)和(iii)部分),然后用5’和3’引物通过PCR进行扩增,其中miR特异性序列在3’末端,不相关的延伸序列在5’末端((ii)和(iv)部分)。所述扩增子可以通过与所述扩增子杂交的MNAzyme检测,包括所述5’和3’引物之间的区域。所述MNAzyme感应臂和所述靶核酸严紧的互补性要求使得能够区分十分相近的序列。F荧光基团;Q淬灭基团。
图6与酶介导信号扩增联用的MNAzyme检测图示是引发信号扩增级联的MNAzyme的描述。在该实施方案中MNAzyme引发信号产生的下游级联,其中(从左到右,上组)MNAzyme仅在靶的存在下形成并然后从载体上的附着位置释放酶。如下组所示,游离出来的酶然后酶切荧光底物分子。所述荧光底物很容易检测。F荧光基团;Q淬灭基团。
图7用MNAzyme和信号扩增检测分析物MNAzyme能够引发用空间分开的DNA酶产生的级联。如连续标号的步骤所示,仅在靶的存在下发生的初始MNAzyme酶切事件能够酶切固定的底物,从而释放第一附着的DNA酶A(“A”)(步骤1-3)。DNA酶A一旦游离,然后酶切并释放第二附着的DNA酶B(“B”)(用荧光基团标记)(步骤4-6),所述DNA酶B反过来又酶切并释放另外的DNA酶A(步骤7-8),导致级联的启动。由于具有荧光基团的DNA酶B在继发级联中释放,指数信号扩增使得测量很容易进行。F荧光基团;Q淬灭基团。
图8RPLPO靶的MNAzyme设计插图(i)MNAzyme设计1(上组)和2(下组)的代表性序列;插图(ii)通过MNAzyme设计1(上组)和2(下组)进行的报告底物的靶依赖酶切结果。N=A、G、C、T或任何类似物;N’=任何与N互补的核苷;(N或N’)x=任何数目的核苷酸或类似物;K=A、G或AA;W=A或T;rN=任何核糖核苷酸和/或任何数目的核糖核苷酸;*=摆动碱基(wobble base)。
图9RPLPO靶的MNAzyme设计插图(i)MNAzyme设计3的代表性序列;插图(ii)报告底物的靶依赖酶切结果。图示的对照反应包括无靶、杂交对照、两个脱靶对照和含有部件酶A或部件酶B寡核苷酸但不同时含有该两者的反应。N=A、G、C、T或任何类似物;N’=任何与N互补的核苷酸;(N或N’)x=任何数目的核苷酸或类似物;K=A、G或AA;W=A或T;rN=任何核糖核苷酸和/或任何数目的核糖核苷酸;*=摇摆碱基(wobble base)。
图10RPLPO靶的MNAzyme设计插图(i)MNAzyme设计4的代表性序列;插图(ii)设计3和4的靶依赖酶切的效率。显示了含有所述靶RPLPO寡核苷酸的反应的结果,以及缺乏靶的对照的结果。N=A、G、C、T或任何类似物;N’=任何与N互补的核苷酸;(N或N’)x=任何数目的核苷酸或类似物;K=A、G或AA;W=A或T;rN=任何核糖核苷酸和/或任何数目的核糖核苷酸;*=摇摆碱基(wobblebase)。
图11MNAzyme区分十分相近序列的用途插图(i)图示与hsa-miR-20和相关的miR序列同源的、在图11和12中用作靶序列的DNA序列。D-20和相关的D-miR之间的序列差异加有下划线。竖的黑体虚线将两个感应臂识别的寡核苷酸区域分开。插图(ii)描述用于检测miR-20的设计4的MNAzyme的代表性序列。插图(iii)报告底物的D-20MNAzyme靶依赖酶切结果。图示的对照反应“脱靶”寡核苷酸(D-17-5p、D-106a、D-106b、D-93),和“无靶”(dH2O)对照反应。
图12MiR-20MNAzyme系统的MgCl2优化使用用于miR-20检测的代表性设计4MNAzyme系统获得的结果。报告底物的靶(D-20)依赖酶切。图示了分别含有(i)5mM、(ii)25mM或(iii)100mM MgCl2的反应的对照反应,所述对照反应含有“脱靶”序列(D-17-5p、D-106a、D-106b、D-93)或“无靶”(dH2O)。
图13RPLPO靶的MNAzyme设计插图(i)MNAzyme设计5和6的代表性序列。插图(ii)使用MNAzyme设计5和6及其“无靶”对照进行的报告底物的靶依赖酶切结果。N=A、G、C、T或任何类似物;N’=任何与N互补的核苷酸;(N或N’)x=任何数目的核苷酸或类似物;R=A或G;Y=C或U;rN=核苷酸碱基。
图14PCR扩增的RPLPO的检测通过针对人类RPLPO基因的所述设计4MNAzyme系统进行的报告底物和多种对照反应的靶依赖酶切结果。RPLPO MNAzyme反应含有如下之一(i)对照RPLPO寡核苷酸,(ii)通过使用与所述RPLPO基因互补的引物扩增人类基因组DNA(100ng)制备的RPLPO PCR扩增子(5μl),(iii)缺少基因组DNA的“无靶”RPLPO PCR反应或(iv)未扩增的人类基因组DNA(500ng)。
图15所扩增的短(22mer)序列的检测插图(i)通过针对人类miR-20序列的设计4MNAzyme系统进行的报告底物的靶依赖酶切结果。MiR-20MNAzyme反应用如下之一进行(i)1012(1E+12)拷贝的对照D-20靶寡核苷酸(未扩增的);(ii)使用与所述MiR-20序列互补的引物扩增2×107(2E+7)拷贝的所述D-20靶寡核苷酸,(iii)缺少D-20靶寡核苷酸的“无靶”PCR反应;(iv)108(1E+8)拷贝的D-20靶寡核苷酸(未扩增的);和(v)“脱靶”对照D-17-5p靶(通过PCR扩增的2×107(2E+7)拷贝)。插图(ii)比较D-20靶序列与脱靶序列D-17-5p。D-17-5p寡核苷酸与D-20靶序列相比在PCR引物结合区域内有一处错配,并在被所述MNAzyme的感应臂识别(interrogate)的区域(位于所述引物之间)内有一处错配。
图16所扩增的miR-20扩增子的检测PCR扩增后使用MNAzyme进行的扩增子的端点检测实施例。用PCR扩增存在于来自人胸腺细胞的总RNA中的mir-20微小RNA,并用MNAzyme方法检测。图示了所扩增的样品和对照。
图17通过MNAzyme设计6进行RPLPO外显子5的定量实时PCR分析使用MNAzyme方法实时检测和定量的实施例,其中使用MNAzyme检测所述RPLPO基因以监测RPLPO的外显子5的累积。插图(i)MNAzyme设计6;插图(ii)指示所示的不同模板数的实时PCR的荧光信号;插图(iii)所扩增材料的标准曲线与定量。结果表明对于通过PCR扩增的人类基因组DNA的MNAzyme检测来说,荧光的时间依赖性增加。R2=0.995;斜率=-3.698。
图18多种靶的代表性复合分析的图示能够使用两种或更多种底物同时检测两种或更多种靶,每一种所述底物对一种MNAzyme具有特异性。优选用不同的荧光基团标记底物。在该实施例中,靶1能够通过监测FAM荧光的增加进行检测,靶2能够通过监测JOE荧光的增加进行检测。Q淬灭基团;FAM、JOE荧光基团。
图18RPLPO和D-20序列的单一和复合检测使用JOE-标记的底物监测RPLPO的检测,使用FAM-标记的底物监测D-20靶序列的检测。插图(i)MNAzyme设计6包含仅仅一种MNAzyme系统的部件酶,要么RPLPO(上组)要么D-20(下组)。插图(ii)MNAzyme设计6包含针对RPLPO和D-20两者的MNAzyme。
图20使用适体进行的靶的MNAzyme检测描述了靶检测的一代表性策略。在该策略中,适体序列在部件酶末端引入(适体-部件酶),所述部件酶的构型使其仅在所述靶的存在下形成活性MNAzyme。所阐述的MNAzyme检测策略要求的寡核苷酸组分包括(a)标准的部件酶;(b)适体-部件酶,是将适体引入其一个末端的部件酶;(c)与所述适体-部件酶和所述部件酶两者都结合的使得能够组装活性MNAzyme(在靶的存在下)的组装易化子;(d)报告探针底物;和(e)与所述适体-部件酶杂交的组装抑制因子,杂交区域跨越至少部分所述适体序列和部分所述部件酶序列的底物结合臂。在缺乏靶分析物时(插图(i)),所述组装抑制因子与所述适体-部件酶结合从而阻止所述报告探针底物的结合(及酶切)。在靶分析物的存在下(插图(ii)),所述靶结合所述适体-部件酶的适体序列,抑制组装抑制因子的结合并允许所述报告探针底物的结合及酶切。这样,MNAzyme仅在靶的存在下能够形成并引起荧光信号的产生。
图21使用适体的小分子的MNAzyme检测描述了使用MNAzyme检测靶尤其是ATP的实施例。用检测小分子ATP的实施例例证了图20中图解的策略。插图(i)图解了用来检测ATP的所述寡核苷酸组分的序列。这些序列包括部件酶、适体部件酶(其引入结合ATP的适体)、适体/MNAzyme组装抑制因子、报告底物和组装易化子。插图(ii)SubBi-1-FB酶切分析显示在存在或缺乏ATP及其它核苷酸时温育所述寡核苷酸组分后获得的结果。在存在ATP和dATP但不存在GTP或CTP时观察到荧光随时间增加。此外,在缺乏任何靶时(仅有水的对照)没有观察到荧光增加。
图22使用MNAzyme检测单一碱基错配描述了使用MNAzyme检测单一碱基错配的实施例。插图(i)图解了用来在RPLPO外显子5靶序列中检测单一碱基错配的所述寡核苷酸组分的序列。所图解的寡核苷酸包含基于MNAzyme设计7的两种部件酶(A5和B6)和报告底物。所述部件酶B感应臂中的第三碱基(X)与所述靶序列匹配或错配。当X=G时所述部件酶与靶完全匹配。当X=C时所述感应臂与所述靶RPLPO之间有错配。插图(ii)显示在含有与所述RPLPO靶完全匹配或错配的部件酶B的反应中PCR扩增并实时检测后获得的结果。
图23SNP检测的所述MNAzyme策略及结果该方法使用与一部分(one version)所述SNP完全匹配的截短的部件酶B感应臂,和在所述完全匹配靶的存在下促进MNAzyme组装的稳定因子寡核苷酸。所述部件酶B感应臂和所述靶核酸严紧的互补性要求使得能够区分十分相近的序列。插图(i)完全匹配的5-碱基感应臂和稳定因子寡核苷酸;插图(ii)错配的5-碱基感应臂和稳定因子寡核苷酸;插图(iii)无稳定因子对照;插图(iv)无靶对照;插图(v)用完全匹配靶、错配靶、无稳定因子对照和无靶对照进行的MNAzyme SNP检测结果。
图24调整MNAzyme检测以产生变色反应该方法使用附着有寡核苷酸的纳米金颗粒,所述寡核苷酸当通过桥连寡核苷酸连接时形成蓝色聚集体(插图(i))。所述桥连寡核苷酸掺有底物序列。在靶(插图(ii))的存在下,所述MNAzyme组装并酶切所述底物序列,释放各自的金颗粒,并引起肉眼可见的蓝至红色的颜色改变。
图25使用附着的部件酶的MNAzyme级联实施例该解了MNAzyme能够用于启动信号扩增级联。该反应含有如下要素(i)在溶液中游离的MNAzyme 1的部件酶;(ii)在溶液中游离(如图所示)或者通过底物sub 1附着到不溶性载体上的MNAzyme 2和3(具有相同的感应臂)的组装易化子;(iii)通过底物sub 1附着到不溶性载体上的MNAzyme 2的部件酶。sub 1能够被MNAzyme 1(在靶的存在下)或MNAzyme 3(在组装易化子的存在下)酶切,酶切引起MNAzyme 2的部件酶释放入溶液中;(iv)通过底物sub 2附着到不溶性载体上的MNAzyme 3的部件酶,sub 2能够被MNAzyme 2(在组装易化子的存在下)酶切,酶切引起MNAzyme 3的部件酶释放入溶液中;(v)与Sub2序列相同但是在溶液中游离并且用荧光基团(F)和淬灭基团(Q)双重标记的Sub 2-FQ。Sub 2-FQ能够被MNAzyme 2酶切产生荧光信号。在靶的存在下,从游离于溶液中的部件酶形成活性MNAzyme 1。MNAzyme 1切割其Sub 1,从而释放MNAzyme 2的部件酶。一旦游离,这些部件酶与所述组装易化子杂交并形成MNAzyme 2,所述MNAzyme 2酶切游离的Sub 2-FQ(产生荧光信号)或附着的Sub 2(释放MNAzyme 3的部件酶)。由于MNAzyme 3与MNAzyme 1具有相同的底物臂,它也能够酶切附着的Sub 1,从而释放MNAzyme 2的更多部件酶。这引起更多酶(MNAzyme)的所述组分(部件酶)的酶产生级联以及伴随的信号扩增级联。
定义 在此使用具有如下阐述的含义的某些术语。
术语“包含”(“comprising”)意思是“基本上包括,但不一定仅仅包括”。此外,单词“包含”(“comprising”)的变体,如“包含”(“comprise”)和“包含”(“comprises”)具有相应地变化的含义。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可以互换地使用并涉及下列物质的单链或双链聚合体脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或其类似物、衍生物、变体、片段或组合,包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、短干扰RNA、短发夹RNA、信使RNA、转运RNA、核仁小分子RNA、小型临时RNA、调节性小RNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物、其扩增子或上述的任意组合。以非限制性实例的方式,所述核酸的来源可以选自合成、哺乳动物、人类、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或上述的任意组合。
术语“寡核苷酸”和“引物”通常代表DNA或含有DNA的核酸分子、或RNA或含有RNA的分子或上述的组合的片段。寡核苷酸的实例包括核酸靶;底物,例如,能够被MNAzyme修饰的那些;引物,如用来通过诸如PCR的方法进行体外靶扩增的那些;和MNAzyme组分。在某些实施方案中,MNAzyme组装易化子可以包含如在此定义的寡核苷酸。在此使用的部件酶也可以包含寡核苷酸。
除非另有说明,术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”包括任何所指定的序列以及与其互补的序列。寡核苷酸可以包含至少一种添加或取代,包括但不限于4-乙酰胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、二氢尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、2’-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、β-D-甘露糖基甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-硫代甲基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-硫代甲基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰)苏氨酸、尿苷-5-氧基乙酸甲基酯、尿苷-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷、β-D-阿拉伯糖基尿苷、β-D-阿拉伯糖基胸苷。
术语“催化核酸分子”、“催化核酸”、“核酸酶”和“催化核酸序列”在此可互换使用,并表示DNA分子或含有DNA的分子(本领域中也称为“DNA酶”(“DNA enzyme”)、“脱氧核酶”(“deoxyribozyme”)或“DNA核酶”(“DNAzyme”))或RNA或含有RNA的分子(本领域中也称为“RNA酶”或“核酶”)或上述的组合,是可以识别底物并催化所述底物的修饰的DNA-RNA杂交分子。所述催化核酸中的核苷酸残基可以包括碱基A、C、G、T和U,及其衍生物和类似物。
当术语“衍生物”用于本发明的核酸或核苷酸时,其包括任何功能等同的核酸或核苷酸,包括完整地制备(例如,通过重组方法)或在合成后添加(例如,通过化学方法)的任何融合分子。这样的融合可以包含其中添加了RNA或DNA或与多肽(例如,嘌呤霉素)、小分子(例如,补骨脂素)或抗体偶联的本发明的寡核苷酸。
当术语“类似物”用于本发明的核酸或核苷酸时,其包括具有与DNA或RNA分子或残基相关的物理结构的化合物,并能够与DNA或RNA残基或其类似物形成氢键(即,它能够与DNA或RNA残基或其类似物退火形成碱基对),但是这样的成键并非为所述化合物包括进术语“类似物”中所需。这样的类似物可以具有与在结构上与之相关的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸不同的化学和生物学性质。甲基化、碘化、溴化或生物素化残基是类似物的实例。已经描述含有核苷酸类似物的活性DNAzyme,所述核苷酸类似物包括脱氧肌苷、C-5-咪唑脱氧尿苷、3-(氨基丙炔基)-7-去氮-dATP、2’-O-甲基RNA、2’-O-甲基帽(Warashina et al.,1999;Cairns et al.,2003;Schubert et al.,2004;Sidorovet al.,2004)。其它的类似物与MNAzyme的催化活性相适宜。催化核酸序列的变化,例如用一个碱基取代另一个、用类似物取代碱基或糖组分或磷酸二酯主链的变化,对本领域技术人员而言是显而易见的。例如,能够在合成期间进行改变,或通过在合成后修饰特定碱基进行改变。引入诸如碱基改变或碱基类似物的变化的催化核酸的经验性测试允许评价改变的序列或特定类似物对催化活性的影响。碱基A、C、G、T和U的类似物为本领域已知,其亚类列于表2中。
表2在此有用的核苷酸类似物实例 当术语“片段”用于核酸时,是指所述核酸的组成部分。通常所述片段具有与所述核酸一致的定性的生物学活性,但不一定总是这种情况。核酸片段不一定需要编码保留生物学活性的多肽。更确切地说,核酸片段可以,例如,用作杂交探针或PCR寡核苷酸。所述片段可以衍生自本发明的核酸或者可以通过某些其它手段合成,例如化学合成。
在此使用的术语“变体”涉及基本上相似的核酸或多肽序列。通常,序列变异具有一致的定性的生物学活性。此外,这样的序列变异可以具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。术语“变体”的含义也包括同源物,所述同源物通常是来自不同物种但与在此公开的相应多肽或核酸具有基本上相同的生物学功能或活性的多肽或核酸。
在此使用的术语“高度严紧性”(“high stringency”)是指两个核酸可以杂交的条件,并且可以包括例如溶液中盐和/或洗涤剂的浓度、在两个核酸杂交期间使用的溶液的温度和杂交的时间段。因此,在此使用的术语“高度严格性”是指有益于两个核酸杂交的溶液条件,只有在该条件下所述核酸才具有高度的互补性。所述互补性的程度可以包括但不限于约55%到99%的范围。因此,“高度严紧性”条件可以包括但不限于,使用变动的温度和包含各种浓度的洗涤剂、盐和二价阳离子的缓冲液。
在此使用的术语“组装易化子分子”、“组装易化子”、“MNAzyme组装易化子分子”、“易化子”和“MNAzyme组装易化子”是指可以促进组分部件酶自组装形成催化活性MNAzyme的实体。在优选实施方案中,组装易化子为MNAzyme的自组装所需。某些实施方案中的组装易化子包含诸如核酸或非核酸的靶。组装易化子可以包含可以与一种或多种寡核苷酸“部件酶(partzyme)”配对或结合的一个或多个区域或分子,所述“部件酶(partzyme)”构成“MNAzyme”的组分或部分。不要求组装易化子与每一组分部件酶或寡核苷酸相互作用、配对或结合,条件是它与MNAzyme的组分部件酶中的至少之一相互作用、配对或结合。如在此使用的那样,意欲使MNAzyme组装易化子包括能够促进MNAzyme的自组装的最广范围的组分。在某些实施方案中,组装易化子可以包含核酸。在其它实施方案中,组装易化子可以包含任何细胞或其任何部分,例如任何真核或原核细胞、病毒、朊病毒、酵母或真菌,或任何其它分子,例如,包括但不限于蛋白、多肽、肽或核酸。在其它实施方案中,组装易化子可以包含病毒、朊病毒、酵母或真菌,或任何其它分子,例如,包括但不限于糖蛋白、脂质、脂蛋白、完整有机体、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合。
在此使用的术语“靶”包括试图通过特定MNAzyme检测、鉴定或定量的任何天然或合成的实体、组分或分析物。靶因此包括最广范围的可检测实体、组分或分析物,为此需要灵敏的检测、鉴定和/或定量方法。在某些实施方案中,靶包含组装易化子。某些代表性靶包括但不限于蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、完整有机体、细胞、病毒、细菌、古细菌、酵母、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合。也预期在此使用其它靶。
在此使用的术语“底物”、“底物分子”和“化学底物”包括能够被催化分子识别、作用或化学修饰的任何分子。在具体实施方案中,底物可以被酶识别并修饰。在其它实施方案中,底物可以被催化核酸酶识别并修饰。底物的化学修饰可以通过修饰反应产物的出现或增加或通过修饰反应的底物的消失或减少来测量。特定催化分子可以识别一个或多个不同的底物分子,条件是每一底物分子具有催化活性可被催化分子识别的至少最小结构。
在此使用的“报告底物”、“报告探针”或“报告探针底物”是特别适合于促进测量底物的消失或与催化反应相关产物的出现的底物。报告底物可以在溶液中游离或结合(或“附着”)于例如表面或另一分子。报告底物能够通过许多种手段中的任何手段进行标记,包括,例如,荧光基团(含有一种或多种另外的组分,如淬灭基团)、放射标记物、生物素标记(例如生物素化)或化学发光标记物。催化核酸的报告底物还可以包括蛋白或核酸酶,例如共价地连接到它们的末端上的蛋白或核酸酶。
如在此使用的那样,“通用(generic)”或“普遍性(universal)”底物是被多种MNAzyme识别并对其起催化作用的底物,其中每一MNAzyme能够识别不同的靶,例如报告底物。这样的底物的用途促进开发用结构上相关的MNAzyme检测、鉴定或定量许多种靶的不同分析,所有所述MNAzyme识别普遍性底物。这些普遍性底物每一个能够独立地用一种或多种标记物标记。在优选实施方案中,使用可独立检测的标记物标记一种或多种一般底物以便为用MNAzyme独立地或同时检测多种靶创造方便的系统。
如在此使用的那样,术语“部件酶(partzyme)”、“组分部件酶(component partzyme)”和“组分寡核苷酸”是指含有DNA或含有RNA或含有DNA-RNA的寡核苷酸,其中两种或更多种所述寡核苷酸仅在MNAzyme组装易化子分子的存在下能够一起形成“MNAzyme”。在某些优选实施方案中,一种或多种组分部件酶,并优选至少两种可以包含三个区域(region)或结构域(domain)形成催化化学修饰的部分MNAzyme催化核的“催化”结构域;可以与组装易化子(例如靶)缔合和/或结合的“感应臂”结构域;以及可以和底物缔合和/或结合的“底物臂”结构域。这些区域或结构域的描述能够在例如图1中看到。部件酶可以包含一个或多个分子。部件酶可以包含至少一种另外的组分,包括但不限于适体,所述适体在此是指“适体-部件酶”。部件酶还可以包括底物,其可以在例如图25中看到。
在此使用的术语“MNAzyme”是指两个或多个寡核苷酸序列(例如部件酶),仅在MNAzyme组装易化子分子(例如靶)的存在下才能形成能够催化性修饰底物的活性核酸酶。图1描述了包含部件酶A和部件酶B的代表性MNAzyme。参考图1,DNA部件酶A和B各自与靶结合(例如,通过与核酸靶Watson-Crick碱基配对)。仅当部件酶A和B的感应臂在所述靶上彼此邻近杂交时形成所述MNAzyme。所述MNAzyme的所述底物臂接合所述报告底物,由部件酶A和B的所述催化结构域相互作用形成的所述MNAzyme的所述催化核催化所述底物的酶切。所述MNAzyme在荧光基团和淬灭基团染色对(dye pair)之间酶切所述底物,从而产生信号。附图中例证了DNA/RNA嵌合体(报告底物)的酶切。术语“多组分核酸酶”和“MNAzyme”在此可以互换使用并包含由两个分子组成的双部结构,或由三个核酸分子组成的三部结构,或其它多部结构,例如由四个或更多核酸分子形成的那些。MNAzyme还可以包含通过与组装易化子或底物相互作用给所述MNAzyme提供稳定性的稳定寡核苷酸。很明显,形成MNAzyme要求至少所述部件酶组分与所述组装易化子组装以及与底物结合,使得催化活性可检测,并且缺乏这些组分的任何一种将导致缺乏催化活性。
在此使用的术语“适体”可以包含能够识别一个或多个配体的结构。例如,所述识别可以由于所述适体的较高水平结构如三维结合结构域或口袋而具有高度特异性。因此,适体可以结合蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合,或任何其它实体。优选的适体在此可以包括短的单链DNA或RNA低聚体,所述低聚体能够通过吸附、回收和再扩增的反复过程从合成核酸的复合物库中分离出来。因此,几乎对任何靶都能产生适体,所述靶的范围从小分子如氨基酸或抗体到蛋白和核酸结构。
如在此使用的那样,术语“级联”是指在连续阶段中发生的任何连续的过程或操作,在所述连续阶段中每一阶段的发生通常依赖于前一阶段的发生。级联可以因此包括但不限于酶促级联或其它信号转导级联。在某些实施方案中,级联可以包括扩增因MNAzyme的催化活性而产生的信号。在优选实施方案中,这样的扩增级联可以包括反复并因此而循环的信号扩增,其中第一MNAzyme的催化活性使得第二MNAzyme的催化活性所需要的分子可获得。在某些实施方案中,所述所需要的分子可以包含部件酶、酶、组装易化子、底物、靶、其部分或片段或上述的组合。在某些实施方案中,级联可以因此包括制造累积效应,从而通过将信号产生至可以检测的水平来检测低丰度靶。在其它实施方案中,可以使用多于两个的催化阶段。所述级联可以是线性的。在一个优选实施方案中,所述级联可以是指数的。
如在此使用的那样,术语“抑制因子”或“组装抑制因子”包括,但不限于任何蛋白、多肽、肽或核酸、RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合,或与在此定义的MNAzyme的一种或多种组分相互作用,或与底物或组装易化子相互作用以防止MNAzyme组装的任何其它实体或分子。“抑制因子”或“组装抑制因子”不需要与MNAzyme在物理上邻近,但是通过非限制性实例的方式,可以与MNAzyme、底物或组装易化子的组成部分竞争性结合,从而阻止这样的组成部分可获得用于MNAzyme组装。这样的结合可以包括,例如与包含MNAzyme组成部分的寡核苷酸互补的抑制性核酸。
下列缩写在此使用并贯穿本说明书 MNAzyme多组分核酸酶,或多部核酸酶; DNAzyme脱氧核糖核酸酶; RNAzyme核糖核酸酶,或核酶; PCR聚合酶链反应; SDA单链置换扩增; LAMP环介导等温扩增; RCA滚环扩增; TMA转录介导扩增; 3SR自保留序列复制; NASBA依赖核酸序列扩增; dH2O去离子蒸馏水; LNA锁核酸; PNA肽核酸; bDNA分支DNA测定; FCS荧光相关谱; TSA酪胺信号放大; An分析物或靶; F荧光基团; Q淬灭基团; miR微小RNA; N=A、C、T、G,或其任何类似物; N’=与N互补或能够与N碱基配对的任何核苷酸; (N)x任何数目的N; (N’)x任何数目的N’; WA或T; KA、G或AA; rN任何核苷酸碱基; (rN)x任何数目的rN; rRA或G; rYC或U; MA或C; HA、C或T; DG、A或T; JOE或6-JOE6-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素; FAM或6-FAM6-羧基荧光素。
BHQ1黑孔淬灭基团1 BHQ2黑孔淬灭基团2 M-MLV RT(H-)莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶,RNA酶H负链 shRNA短发夹RNA siRNA短干扰RNA mRNA信使RNA tRNA转运RNA snoRNA核仁小分子RNA stRNA小型临时RNA smRNA调节性小RNA pre-microRNA前体微小RNA pri-RNA初始微小RNA 说明性实施方案详述 首先应当理解,在此提供的附图和实施例是用于举例说明而不是限制本发明及其各种实施方案。
根据本发明,提供检测、鉴定和/或定量靶的组合物、方法和试剂盒。本方法通常包括使用包含多组分或多部核酸酶的组合物,所述多组分或多部核酸酶优选通过在组装易化子的存在下自组装形成活性核酸酶的多核酸组分形成。在优选实施方案中,所述组装易化子是所述靶,因此所述多组分核酸酶仅在所述靶的存在下形成。
1.组合物-MNAzyme 所述多组分核酸酶(在此也对等地称为多部核酸酶或“MNAzyme”)能够由两种或更多种寡核苷酸组分(在此也称为部件酶)自组装形成。部件酶寡核苷酸在MNAzyme自组装易化子的存在下自组装形成MNAzyme。因此,MNAzyme是催化活性核酸酶。在某些实施方案中,MNAzyme的存在可以被检测,并提示靶的存在,这是因为所述MNAzyme仅在所述靶的存在下形成,其中所述靶包含所述组装易化子。在此提供了许多种基于上述基本原理的分析。还在此提供了包含能够形成MNAzyme的寡核苷酸的组合物,以及各种序列的MNAzyme。在某些实施方案中,所述寡核苷酸组分、组装易化子或底物中的至少之一还可以包括/包含能够与靶结合的适体。
在优选实施方案中,所述MNAzyme的结构以一种或多种DNA酶和/或核酶为基础。更为优选的是基于特定DNA酶结构的那些MNAzyme结构。目前的优选结构基于包括10:23和8:17DNA酶的DNA酶。在各种实施方案中所述MNAzyme包含核苷酸碱基和脱氧核糖核苷酸碱基中的任一者或两者都包含。在更优选的实施方案中,MNAzyme的结构至少部分基于DNA酶的结构。在其它优选实施方案中,MNAzyme包含至少一些脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施方案中,所述MNAzyme的催化核包含一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施方案中,一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物参与底物的催化。在其它实施方案中,所述催化核中的至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物促进催化活性。在其它实施方案中,相对于在不存在脱氧核糖核苷酸碱基的情况下可比较的MNAzyme的速率,为了使催化以可测量的速率发生,对所述MNAzyme的催化核中至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物有严格的要求, 如在此提供的那样,MNAzyme可以含有一个或多个取代,如类似物,衍生物,修饰或改变的碱基,核糖核苷酸,糖或磷酸主链的改变,各种删除、插入、取代、重复或其它修饰,或这些的任意组合,为本领域技术人员所熟知。这样的修饰、取代、删除、插入等可以在感应臂和/或底物臂和/或催化核部分进行,如在此阐述的那样,使得所述分子保持催化活性。与所述底物或组装易化子结合的臂的取代和修饰可以很耐受并且实际上是允许改变所述分子以适合不同底物/组装易化子的基础。例如,对所述感应臂的修饰会允许针对不同的组装易化子进行调整,而对所述底物臂的修饰会允许针对不同的底物进行调整。
因此,在某些优选实施方案中,本发明涉及具有催化活性的MNAzyme,所述MNAzyme由脱氧核糖核苷酸组成或通过某些修饰/取代等衍生自这样的分子。作为通常规则,将整个分子用例如核糖核苷酸取代会使所述分子失活,因为它的活性依赖于某些关键的脱氧核糖核苷酸。在相应的方式中,核酶中的某些核苷酸可以用脱氧核糖核苷酸取代但是将整个分子用例如脱氧核糖核苷酸取代会使所述分子失活。
本领域技术人员应当理解,所述MNAzyme包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸中的任一者或甚至两者都包括。目前优选的是。包含至少一种和多种脱氧核糖核苷酸组分,优选所有的都为脱氧核糖核苷酸组分。在所述MNAzyme的催化核中包含至少一种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物的那些MNAzyme也是优选的。甚至更优选的是这样的碱基为催化活性所必需的那些实施方案。
本领域技术人员也应当理解,多部DNA酶比多部核酶具有优势,例如在稳定性和使用的容易程度方面。因此,在此提供的多组分MNAzyme能够提供多组分核酶的目前优选的替代物,所述多组分核酶也根据各种实施方案提供。还应当理解,在某些实施方案中,MNAzyme比单分子核酸酶如DNA酶有优势,所述单分子核酸酶仅能够识别一底物,而单一MNAzyme能够识别两个分子,即组装易化子(例如靶)和底物。例如,MNAzyme的这些性质使它们适合于例如检测靶,包括原位、体内或体外检测。
2.使用MNAzyme检测、鉴定或定量靶的方法 本发明提供利用一种或多种MNAzyme来检测、鉴定或定量至少一种靶的各种方法。在一实施方案中,第一和第二寡核苷酸组分仅在与含有组装易化子的样品接触时才自组装,因此所述催化活性MNAzyme的自组装表明所述组装易化子的存在,其中所述组装易化子是所述靶。在其它实施方案中,例如包括适体的那些,所述组装易化子可以不是所述靶,从而可以仅包含所述MNAzyme的自组装所需要的组分。
本发明的各种实施方案中的一些通过图示陈述可以更好地理解。因此,参考所述附图,并根据在此的组合物和方法,通常提供的是仅用核酸酶(例如,图1、3、4、7-13、20、21、24、25)而无需蛋白质酶如聚合酶来检测至少一种靶的基于MNAzyme的方法。尽管在此不排除联合MNAzyme使用蛋白质酶,并且在此的某些实施方案中包括蛋白质酶是允许的,或甚至是优选的,但是不需要蛋白质酶的方法的反应条件通常限制较少而且较容易优化,例如MNAzyme酶切的效率。无需蛋白质酶也通常降低试剂的成本。
如还在此提供的,为检测靶而使用MNAzyme的某些方法不要求热循环和/或靶的变性。等温方法比要求热循环的方法更灵活而且也能区分包含单链和双链核酸的靶。此外,不需要热循环可以使这样的方法更容易和更便宜。根据该方法提供的是简单、快速、成本划算、等温而且程序灵活的在样品中检测感兴趣靶的方法,所述样品可以是合成的或天然的。
在此提供的某些样品例示通过引起例如荧光报告底物的MNAzyme介导酶切的MNAzyme的靶特异性组装来检测核酸靶。此外,由于所述MNAzyme分子的性质,反应能够在很大的温度范围内进行,仅需视MNAzyme的组装和所用底物的催化修饰(例如酶切)而定。
图1描述了MNAzyme结构的基本实施例。图示的结构包含已经与在此简单地显示为靶的MNAzyme组装易化子分子碱基配对的部件酶A和部件酶B。部件酶A和B通过与靶相互作用使得所述催化核紧密靠近从而形成。所述MNAzyme的所述底物臂与底物(在这里是报告底物)相互作用并碱基配对。因此,所述MNAzyme自组装,并且通过所述MNAzyme组装易化子分子靶的存在促进了这个过程。在缺乏靶时,不形成MNAzyme。在底物中竖向箭头代表的MNAzyme酶切位点处,所述MNAzyme的催化核催化所述底物的修饰(在该例中是酶切)。本发明该具体实施方案中的所述底物包含具有可检测信号的可检测部分,例如荧光基团F,和通过淬灭基团Q的作用对可检测信号F具有淬灭作用的淬灭基团部分。当于MNAzyme酶切位点处酶切时,容易检测或定量的可检测信号(在这里是荧光)显著增加。
图1还能够进一步理解为描述了使用MNAzyme检测靶的基本方法的实施例,所述靶在某些实施方案中包含组装易化子。策略1(见图2)使用适合于检测包括DNA、RNA和蛋白的靶的MNAzyme。报告底物能够在溶液中游离(图1)或结合到载体上(图3)。信号能够通过各种手段如分离荧光基团F和淬灭基团Q染色对(图1和3)而产生。
更特别地,部件酶A和部件酶B如图1所示,各自包含底物臂部分、催化核部分和感应臂部分。在靶的存在下,部件酶A和部件酶B的所述感应臂部分能够开始与所述靶,例如DNA或RNA序列杂交并与其互补部分碱基配对。当以这样的方式与所述靶接触时,所述MNAzyme自组装形成能够修饰被底物臂结合的底物的催化核。优选地,所述MNAzyme的存在通过其催化活性的检测或测量来检测。因而组装的MNAzyme的底物臂能够通过所述底物臂和所述底物上互补序列的相互作用接合底物,例如图1所示的报告底物。一旦所述底物臂这样接合所述底物,所述催化核能够促进所述底物的修饰(例如酶切),从而能够直接或间接测量或检测。
继续参考附图,图2提供MNAzyme分析的一些实例应用的程式化概述。策略1例示了上述MNAzyme分析的基本应用。当所述寡核苷酸识别靶并与之结合时,形成由具有靶和底物两者的识别序列的独立寡核苷酸组成的MNAzyme。所述底物,例如报告底物,被所述MNAzyme的催化活性修饰并引起可检测信号的产生,所述可检测信号的产生为直接产生(策略1)、靶扩增期间或之后产生(策略2)或通过信号级联产生(策略3)。在某些实施方案中,靶和信号扩增两者同时发生。
本领域技术人员应知道MNAzyme可以在覆盖广泛应用领域的组装易化子的检测、鉴定或定量策略中使用。这些领域包括,但不限于,医学、兽医、农业、食品技术、成像和生物恐怖应用。
对本领域技术人员而言也是显而易见的是,MNAzyme能够用来检测、鉴定和/或定量溶液中的靶。例如,涉及使用单个底物检测、鉴定和/或定量单个靶的策略可以应用于这样的检测。在某些实施方案中,这可以包括使用通用底物。也能够使用修饰一系列通用底物的多种MNAzyme在溶液中检测多种靶,每一底物的修饰产生截然不同的可检测信号,例如不同的荧光。
3.使用多种MNAzyme的方法 本领域技术人员应知道,在此提供的各种分析通常能够用来在每个反应或分析中检测单个靶,或在单个反应或分析中检测多种靶。在检测多种靶时,能够根据分析和待检测对象而使用一种或多种MNAzyme。例如,单个MNAzyme可以满足检测多个相关结构的要求,例如具有相同的关键序列(被所述MNAzyme识别)并且仅在例如长度上或在所述关键序列之外的序列上不同的一组序列。具有所述关键序列的任何序列都可以检测。复合MNAzyme对检测差异小至单个核苷酸的相关序列或甚至差异很大的靶会有用,而且可以知道每一个的存在或缺乏。类似地,在某些实施方案中,单个底物会满足要求,而在其它实施方案中检测几个靶中的每一个靶都需要独一无二的底物。在某些情况下,方法的多元化要求对每一底物使用截然不同的或独一无二的可检测信号以便设计方法。当所述底物附着到一种或多种载体上并且能够通过它们在一种或多种载体上的位置区分开时,对每一底物可以不要求截然不同的或独一无二的可检测信号。本领域技术人员很容易理解这些设计特征。在某些实施方案中,所述方法可以在一个反应中检测多种不同类型的靶,例如核酸靶和蛋白。
4.使用靶扩增的方法 本领域技术人员很容易理解,在此描述的方法可以包括在MNAzyme的催化活性之前、期间或之后扩增靶。这样的靶扩增在本发明的实施方案中具有具体应用,其中待检测、鉴定或定量的靶的量是提供使用其他方法可能检测不到的信号的量。这样的扩增可以包括下述的一种或多种聚合酶链反应(PCR)、单链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
策略2(图2)例示了使用适合于在体外扩增核酸靶期间或之后监测扩增子的累积的MNAzyme。体外扩增核酸序列的技术为本领域已知。这些技术包括由DNA聚合酶介导的技术,如聚合酶链反应(“PCR”)(见,例如,美国专利第4,683,202号;美国专利号第4,683,195号;美国专利第4,000,159号;美国专利第4,965,188号;美国专利第5,176,995号)(Saiki et al.,1985;Chehab et al,.1987)、链置换扩增(“SDA”)(Walker et al.,1992)、滚环扩增(“RCA”)(Lizardi et al.,1998)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和环介导等温扩增(“LAMP”)(Notomiet al.,2000;Nagamine et al.,2002)。其它的靶扩增技术由RNA聚合酶介导,例如转录介导扩增(“TMA”)(Jonas et al.,1993)、自主序列复制(“3SR”)(Fahy et al.,1991)和依赖核酸序列扩增(NASBA)(Compton,1991)。
通过PCR、RT-PCR、SDA、RCA和LAMP生产的扩增产物(“扩增子”)由DNA组成,而RNA扩增子通过TMA、3SR和NASBA产生。
进一步参考如图2中例证的策略2,在其几个方面中的一方面,本发明提供与靶扩增方法联用的使用MNAzyme的方法,所述靶扩增方法包括例如上述的PCR、RT-PCR、SDA、RCA、LAMP、TMA、3SR和NASBA。实施例4、5、6和9例示了PCR扩增子的检测。在实施例4、5、6和9中,PCR后的终点分析促进了所述靶核酸存在与否的快速检测。实施例8、10、11、13、14、15、16、19和20例示了PCR的实时监测,从而允许所述靶核酸的定量。使用非对称或对称引物比通过PCR产生的扩增子的累积能够使用MNAzyme监测。
在图2(策略2)中能够看到,根据扩增核酸(即DNA或RNA)的程序扩增靶核酸。优选地,使用标准的体外扩增方法。扩增期间产生的扩增子用作MNAzyme的靶,因此MNAzyme的活性提示靶的存在。本领域技术人员应当理解,这样的监测能够在允许扩增和MNAzyme组装和催化活性的条件下在单一容器中进行,或者能够通过在扩增反应过程结束时或期间移走样品,在扩增之后或在整个扩增期间的时间点进行MNAzyme分析。
还要理解的是,将靶扩增与催化核酸活性相结合的方法或方案可以要求特定的反应条件。优选地,反应条件与聚合酶活性(对于扩增)和底物的催化核酸修饰(对于检测)两者都相适宜。已经描述了用于确定对于DNA酶的在高温条件下(如PCR期间)同时测定催化活性和聚合酶活性的测定条件的方案(Impey et al.,2000)。在这篇论文中论证了包括DNA酶臂长、缓冲液、温度、二价离子浓度的因素的影响和添加剂的影响。DNA酶适合与体外扩增策略结合使用。例如,它们在扩增期间暴露于高温中时不会不可逆地变性。
5.使用不溶性和固体载体的方法 还要理解的是,无论复合与否,所述方法通常可应用在溶液中,或联合不溶性载体或固体载体应用,所述载体上结合、附着或固定有一种或多种底物、酶或其部分、MNAzyme组装易化子和/或靶。有了在此例示的方法和变化以及工作实施例,本领域技术人员通常也应当理解这样的分析系统的特征。因此,本发明不应视为限制于在此的教导,而应视为能够与在此提供的教导的原则和范围及本领域知识相一致地修饰和改变。
参考图3,插图(i),描述了使用MNAzyme和固定在载体上的底物检测靶的代表性方法。在该实施方案中,底物优选为如图所示具有可检测部分和淬灭基团部分的底物,所述可检测部分包含可检测信号例如荧光基团,所述淬灭基团部分在底物的可检测部分与淬灭基团部分保持紧密邻近直到例如底物被例如酶切而修饰的同时减少或消除可检测信号。底物附着到载体上。载体优选为不溶性材料或为保持底物的基质,并阻止底物在大量反应混合物中自由移动。本领域已知这样的载体用于固定或定位底物,包括核酸靶。本领域技术人员应当理解,所述载体能够选自多种形式的各种基质、聚合物等包括便于在微分析中使用的珠,以及与反应条件相适宜的其它材料。在某些优选实施方案中,所述载体能够是塑料如塑料珠或薄片,或在其中进行特定分析的塑料容器(Well)或管道。
设计将底物附着在载体上使得在MNAzyme修饰(如酶切)底物时,可检测部分或淬灭基团部分任一者仍然附着到载体上(但不是两者都仍然附着到载体上),而另一者被释放并移动进入大量反应混合物,远离仍然附着的部分。因此,在酶切实施例中,当淬灭基团部分和可检测部分随酶切而分开时,可检测信号显著增加。在图3的插图(i)所示的实施方案中,含有荧光基团的可检测部分在酶切后仍附着在载体上。这具有允许信号定位于所述载体上的益处,但在某些情况下,荧光基团可以被释放入溶液中。在发生例如连接的另一实施方案中,可以将淬灭基团与荧光基团连接从而减少可检测信号。
参考图3,插图(ii),示出了包含多种MNAzyme组分用于制备对不同靶具有特异性的复合MNAzyme的复合(multiplexed)方法。该实施方案包括在具体已知位置例如“芯片”包含底物的结构,所述“芯片”处可获得复合位置以结合多个底物,例如底物1、底物2。每一底物的可检测部分的位置都能被追踪并被限定在该位置。对每一MNAzyme,例如MNAzyme 1、MNAzyme 2,如果靶例如靶1、靶2存在于例如测试溶液中,与该靶相应并对其具有特异性的MNAzyme会自组装并能催化其相应底物的酶切,导致在该位置产生信号。可检测信号的位置会因此鉴定哪个MNAzyme酶切了它的底物,并因此鉴定哪个/些靶存在于测试溶液中。在该实施方案中,对底物的修饰通过其位置引起可鉴定信号。底物不需要可独立鉴定的检测机理,例如不同的荧光基团,但本领域技术人员应当理解这样的预期在本发明的范围之内。
包括“芯片”(又称为阵列或微阵列)形式的不溶性载体的本发明的实施方案通常包括偶合、拴系或附着到芯片上的多个底物。在具体实施方案中,所述底物包含核酸。多个核酸可以通过本领域已知的任何适当方法定位在芯片上,例如,通过吸液管、喷墨打印、接触打印或光刻法。芯片可以由至少一种要素组成,每一所述要素包含至少一种核酸。所述至少一种要素可以由具有相同序列的多个核酸组成。包含芯片的所述要素数可以是任何数量,并且在芯片上定位有多个所述要素时,所述要素可以以均一的距离隔开或以变化的距离隔开、或为其组合。在某些实施方案中,所述要素可以随机定位,然后测定每一所述要素各自的位置。所述要素的大小和形状会取决于本发明的具体应用,并且具有不同大小和形状的所述要素可以组合成单一芯片。芯片表面可以基本平坦或可以具有如凹陷或突起的特征,且所述要素可以定位在凹陷内或定位到突起上。这样的凹陷可以为所述要素被浸入的溶液提供贮液器,或这样的突起可以促使所述要素干燥。例如,可以将所述要素放在96孔板的每一孔中。在某些实施方案中,所述芯片可以包括独特的鉴定物如指示剂、射频标记、整合装置如微处理器、条形码和其它标记以便鉴定每一所述要素。独特的鉴定物可以另外或可替换地包含阵列表面上的凹陷或突起。此外,独特的鉴定物能够提供芯片的正确定位或鉴定。独特的鉴定物可以通过数据捕获装置或通过光学扫描仪或检测器直接读取。
6.方法中使用的报告底物系统 根据本发明,还提供了通用报告底物系统,通过轻易的设计改变以创造识别不同靶的新MNAzyme,所述通用报告底物系统可以用于快速分析的开发。如在此讨论的那样,部件酶的底物臂部分和催化核部分可以保持不变,仅改变新靶所要求的一种或多种部件酶的感应臂部分。提供通用底物序列并且因此能够将相同的底物引入许多不同靶的分析中。此外,可以将相同的底物引入在此的各种实施方案的方法中,包括底物在溶液中游离或拴系或附着在载体上的分析。可以将一系列通用底物用在可以同时检测多种靶的复合反应中。
使用通用底物的MNAzyme策略与如要求为每一新靶设计并使用探针的
或Beacons技术相比具有显著优势。
7.方法中使用的底物 如接下来详细描述的那样,在某些实施方案中MNAzyme具有能利用普遍性或通用底物的有利性质。表1以目前优选的构型示出了这样的底物,其中所述底物包含可检测部分和淬灭基团两部分。淬灭基团部分适合于使来自底物可检测部分的信号减少或消除,直到MNAzyme酶切该底物。例如,淬灭基团部分可以包含“黑孔淬灭基团1”(BHQ1)或“黑孔淬灭基团2”(BHQ2)。
因此,MNAzyme在可检测部分和淬灭基团部分之间酶切底物使这两部分在溶液中分开,从而使得在淬灭基团部分远离可检测部分或从其局部环境有效移走时可检测信号出现或增加。
通过设计MNAzyme的组分部件酶,能够使用通用或普遍性底物。通过仅改变部件酶的感应臂,但不改变底物臂,能够设计特异性针对多种靶中的每一个的各种MNAzyme,所有所述MNAzyme都利用普遍性底物来检测。本领域技术人员应当理解下述优势,即这不再需要对于每一靶都提供专门的或独特的底物。每一新靶只需要一个或多个感应臂部分的一个或多个改变;底物臂部分和催化核部分可以保持不变。因此,可以使用MNAzyme将单个报告底物用于单个靶,并使用改变的MNAzyme将单个报告底物在一系列分析中用于多种靶。多个报告底物可以复合以便使用多种MNAzyme(每一种MNAzyme用于每一种靶)在单一分析中检测多种靶。使用MNAzyme的这样的复合方法被容易地在溶液中(图18)或附着到载体系统上(图3)实现。在这里,预期复合分析能够因此在包括将一个或多个底物、MNAzyme部件酶或组装易化子或另外的酶活性附着到载体上的系统中实现,如在此描述的那样。
此外,所述底物可以包括另外的实体如标记核酸、纳米颗粒、微粒、蛋白、抗体、RNA、DNA、核酸类似物、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体或上述的任意组合。例如,所述纳米颗粒可以是金纳米颗粒,其中这些金纳米颗粒与多种靶如核酸缔合。
所述底物可以被MNAzyme修饰从而提供可检测作用。在检测过程中,MNAzyme对底物的修饰可以包括,例如,酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。由于MNAzyme修饰底物,产生了可检测作用并且该作用的强度因此可以提示待测靶的量。可检测作用可以通过多种方法检测,包括荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
某些组已经报道了对于核酸靶以及具有比色信息显示(Elghanianet al.,1997,Mirkin et al.,1996,以及Liu and Lu,2004)的其它分析物的检测。该策略包括批量制备金纳米颗粒,每一所述颗粒表面附着有截然不同的DNA寡核苷酸序列。然后能够通过加入与附着到金颗粒上的序列互补的“桥连寡核苷酸”使金颗粒聚集。颗粒聚集引起颜色从红到蓝的伴随改变(Mirkin et al.,1996)。更近一些的研究表明,在桥连寡核苷酸中引入DNA酶底物序列能够提供逆转金颗粒聚集的机制(Liu and Lu,2004)。DNA酶的活化和随后底物/桥连寡核苷酸的酶切引起金颗粒的解离和颜色从蓝到红的改变。
设计了基于上述概念的简易铅检测器,所述检测器通过利用特定DNA酶的催化活性对铅的依赖而起作用。设计DNA酶以酶切用于聚集金颗粒的桥连寡核苷酸(Liu and Lu,2004)。类似地,含有对腺苷具有特异性的适体的aptazyme,和仅在腺苷的存在下能够酶切桥连寡核苷酸的DNA酶使得可以以比色形式检测腺苷。
8.方法的优化 本领域技术人员会容易理解,在此描述的方法可以使用各种实验参数进行优化,以优化靶的检测、鉴定和/或定量。优化的具体实验参数和该优化的水平会取决于采用的具体方法和待检测、鉴别和/或定量的具体靶。这样的参数包括,但不限于,时间、温度,盐、洗涤剂、阳离子和包括但不限于二甲亚砜(DMSO)的其它试剂的浓度,以及核酸的长度、互补性、GC含量和解链温度(Tm)。
在某些实施方案,例如包括检测序列变异和/或检测甲基化DNA的那些方法中,可以优化实验参数,优选包括实施该方法的温度,以便区分MNAzyme组分核酸与分别包含或是不包含序列变化或甲基化核苷酸的靶核酸的结合。实施这样的方法的温度可以是约20℃到约96℃、约20℃到约75℃、约20℃到约60℃或约20℃到约55℃。
在一优选的实施方案中,在此提供优化的反应以实践使用MNAzyme的方法。在这样的优化的反应中,催化活性比未优化的反应增加高达10%、20%或30%。更优选的反应条件使催化活性增加至少35%或40%,并优选高达50%或更多。在更优选的实施方案中,优化的反应的催化活性增加超过50%,并高达66%、75%或甚至100%。在更优选的实施方案中,被充分优化的反应方法会使催化活性增加100%、200%或甚至300%或更多。其它的优选反应条件与以未优化的反应条件实践的方法相比,能够使催化活性增加高达1000%或更多。优化在此提供的方法的高度优选的反应条件是引入某些二价阳离子。二价阳离子的浓度可以以浓度依赖方式影响大多数核酸酶的催化活性。优选的优化反对于Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+中的一种或多种进行优化。
9.使用适体的方法 本领域技术人员会容易理解,在此描述的方法可以用适体实施,其中所述适体可以促进靶包括非核酸的靶的检测、鉴别和/或定量。
参考图4和20,例示了用MNAzyme检测靶包括非核酸实体的方法。该方法使用可以包含能够识别一种或多种配体的核酸或蛋白、多肽或肽或上述的组合。所述适体可以与例如蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合,或任何其它实体(Lee et al.,2004)。
优选的适体在此可以包括短单链DNA或RNA低聚体或肽,所述短单链DNA或RNA低聚体或肽能够通过吸附、回收和再扩增的反复过程从合成核酸或肽的复合物库中分离出来。因此,几乎对任何靶都能产生适体,所述靶的范围从诸如氨基酸或抗体的小分子到蛋白和核酸结构。在优选的实施方案中,所述适体包括例如优选通过演化和选择技术产生的核酸结合分子。优选地,所述适体可以包括DNA或RNA分子,或二者的组合,包括但不限于按照例如上述表2的核苷酸类似物。
图4和20图解了将适体与MNAzyme结合使用的策略。参考图4插图(i),该MNAzyme检测策略需要的核酸寡核苷酸可以包括(a)标准部件酶;(b)适体-部件酶,是纳入适体(黑体序列)和能够形成发夹从而抑制MNAzyme组装的互补序列的部件酶;(c)能够与适体-部件酶和部件酶二者结合从而能够组装活性MNAzyme的组装易化子;和(d)底物。没有靶分析物(An)时,适体-部件酶采取抑制活性MNAzyme组装的发夹结构。在存在靶分析物时,靶分析物与适体-部件酶的适体结构域结合,从而破坏发夹结构并使适体-部件酶参与活性MNAzyme的组装。然后,活性MNAzyme能够修饰底物,引起例如荧光信号的产生。
参考图4插图(ii),该MNAzyme检测策略需要的核酸寡核苷酸可以包括(a)两种标准部件酶;(b)纳入适体(黑体序列)和能够形成发夹结构的互补抑制因子的组装易化子;和(c)底物。在没有靶分析物时,组装易化子采取发夹结构,所述发夹结构抑制该组分引导组装活性MNAzyme的能力。在存在靶分析物时,靶分析物与组装易化子的适体结构域结合,从而破坏发夹结构并使该组分引导活性MNAzyme的组装。然后,活性MNAzyme能够修饰底物,引起例如荧光信号的产生。
本领域技术人员应当理解,可以将适体纳入组装易化子分子的任意端。此外,应当理解,可以将多种适体纳入一种或多种部件酶寡核苷酸组分。图4插图(i)和插图(ii)图解的策略能够包含DNA、RNA、LNA、PNA或含有一种或多种核苷酸碱基类似物的序列。在其它实施方案中,靶An是核酸。在这样的实施方案中,用与靶核酸互补的序列取代图4的黑体适体序列。
参考图4插图(iii),该MNAzyme检测策略需要的核酸寡核苷酸可以包括两种适体-部件酶,每一所述适体-部件酶包含部分适体。在没有靶分析物时,活性MNAzyme不能组装。在存在靶分析物时,靶分析物用作将寡核苷酸组分聚在一起从而引导活性MNAzyme组装的组装易化子。然后,活性MNAzyme能够修饰底物,引起例如荧光信号的产生。
图20图解了将适体结合与MNAzyme组装相结合的相关策略。在该策略中,在下述构型的部件酶(适体-部件酶)端纳入适体序列,即使得活性MNAzyme仅在靶分析物的存在下形成的构象。该图解的MNAzyme检测策略需要的寡核苷酸组分包括(a)标准部件酶;(b)适体-部件酶,其是在一端有适体纳入的部件酶;(c)与适体-部件酶和部件酶两者结合、使活性MNAzyme能够组装的组装易化子(在靶的存在下);(d)报告探针底物;和(e)在跨越部件酶序列的至少部分适体序列和部分底物结合臂的区域与适体-部件酶杂交的组装抑制因子。当没有靶时(左手插图),组装抑制因子与适体-部件酶结合从而阻止报告探针底物的结合(及酶切)。当存在靶时(右手插图),靶与适体-部件酶的适体序列结合,阻止组装抑制因子的结合并允许报告探针底物的结合和酶切。这样,活性MNAzyme仅能在靶的存在下形成并引起荧光信号的产生。
此外,本领域技术人员应当理解,图20图解的策略与图4插图(i)图解的策略相似,差别在于阻止活性MNAzyme形成的互补抑制因子序列是纳入寡核苷酸部件酶组分中(图4插图(i))还是纳入独立的分子中(图20)。这样,能够将抑制因子序列纳入独立的分子中或纳入到参与MNAzyme复合的组分之一中。
本领域技术人员也应当理解,可以将一种或多种适体纳入任何寡核苷酸组分中,包括部件酶、组装易化子或底物。此外,可以将适体纳入这些寡核苷酸中任意一者的任意端。
参考实施例18和21可以更好地理解本发明,其中适体/MNAzyme策略分别用来检测小分子(ATP)和蛋白(Taq聚合酶)。
10.检测、鉴定和定量微小RNA的方法 本领域技术人员应当理解,检测、鉴定和/或定量微小RNA代表在此描述的方法的具体实施方案。参考图5,例示了使用MNAzyme扩增短核酸(例如微小RNA(miR))序列并检测扩增子的策略。
检测短核酸序列如微小RNA(miR)需要另外的策略主要是因为这些靶的尺寸小。MiR分子是长度大约22个核苷酸的非编码RNA。它们能够通过克隆或northern blot分析来检测,但是这些方法费力而且比诸如RT-PCR的技术需要更多的总RNA。MiR的小尺寸提供不完整的序列以容纳标准设计的两个PCR引物。此外,即使实现了miR扩增,仍难以用任意尺寸(用电泳证实)区分真正的扩增子与引物二聚体,或区分荧光与非特异性染料如Sybr Green或溴化乙锭的插入。通过用内杂交探针如
或Beacon探针探查miR扩增子可以克服这一局限性,然而,扩增子的小尺寸再次限制了标准设计探针的使用。
进行miR分析的改进的
RT-PCR方法(Chen et al.,2005)用3’引物启动逆转录,所述3’引物具有miR特异性3’末端和在它们的5’末端处能够形成茎环的另外的无关序列。用这些3’引物和5’引物扩增所产生的cDNA,所述5’引物也具有miR特异性3’末端和在它们的5’末端处的另外的无关序列。该扩增用
探针实时监测,所述探针与miR序列和由引物引入的无关序列都相结合。然而,由于引物设计以及
探针的尺寸和位置,仍然存在不能够将特定miR与十分相近的序列区分开的可能性。
如图5所示,这里使用的方法优选采用3’引物,所述3’引物在3’端与miR结合,并且具有与miR无关的可以或不可以在5’端形成茎环的延伸序列。如图5描述的那样,引物的无关序列可以形成环结构(图5,左手边)或可以仅形成标记结构(图5,右手边)。在任一实施例中,3’miR引物在逆转录酶的存在下延伸,然后用在3’端具有miR特异性序列、在5’端具有无关延伸序列的5’和3’引物进行PCR扩增。扩增子通过MNAzyme很容易检测,所述MNAzyme识别并与包括5’和3’引物之间区域的扩增子杂交。对MNAzyme感应臂与靶核酸之间互补性的严格要求使得能够区分甚至十分相近的序列。下述实施例中的实施例5和实施例10示出了使用MNAzyme检测通过扩增短核酸序列产生的扩增子的结果(也参见上述图2中的策略2)。此外,实施例5示出了使用MNAzyme的方法区分仅有单一核苷酸差异的两个序列的能力。这提供了显著优势,即甚至在扩增过程不能区分十分相近的序列时,MNAzyme可以在得到的扩增子中区分细微的序列变化。
11.使用级联的方法 本领域技术人员应当理解,在此描述的方法可以用来实施在此定义的级联。实施在此公开这样的方法的具体实施方案包括但不限于(1)仅在靶的存在下使用MNAzyme酶切底物,其中然后使所述底物可获得用于参与诸如产生可检测信号的第二事件,如图6所示,其中底物的酶切使得可获得可以接着酶切锚(anchor)的酶,从而使荧光标记从淬灭基团解离;或(2)仅在靶的存在下使用MNAzyme酶切底物,其中然后使所述底物可获得用于参与第二事件,其中所述第二事件的实施又可获得参与任意数目的后续事件的另一底物,以使后续事件可获得参与实施较早事件的底物,从而产生循环级联,如图7和图25所述,其中这样的循环级联能够用于扩增信号,例如,在低丰度的靶不能提供可检测信号的应用中。
可检测作用扩增级联可以包括一个或多个核酶/连接酶级联、循环核酸酶级联、蛋白质酶级联或附着到载体上的一种或多种酶或上述的任意组合。
参考图2,策略3示出了通过使用信号级联使用MNAzyme扩增信号的方法概况。这将参考图6、7和25更详细地讨论。
图6描述了与酶介导信号扩增联用的靶的MNAzyme检测的代表性方法。如上讨论的那样,本发明提供其中靶被扩增的使用MNAzyme检测的方法,以及其中产生的信号被扩增的方法。在某些实施方案中,将MNAzyme技术与信号扩增策略相结合提供将MNAzyme分析与靶扩增相结合的替代方案,尽管在某些情况下靶扩增与信号扩增能够一起使用。扩增信号的优选方法包括级联机制,本领域技术人员应当理解,这经常包括在生物学系统的信号扩增中。
使用催化核酸的扩增级联的某些实施例在本领域为已知并预期在此使用。连接级联(Paul和Joyce,2004)使用连接含有寡核苷酸的两个RNA以形成第二核酶(B)的第一核酶(A)。然后核酶(B)连接含有寡核苷酸的两个其它的RNA以形成新的第一核酶(A),从而引发级联反应。
适合于在此使用的第二扩增级联使用环化DNA酶/底物分子(Levyand Ellington,2003)。当DNA酶(A)为环状时没有活性,但当酶切环状DNA酶(A)的第二DNA酶(B)将其线性化时开始活化。然后活性线性DNA酶(A)酶切环状DNA酶(B)分子从而将它们线性化和活化。能够彼此酶切/线性化的两种DNA酶引起催化性核酸活性的级联。
本领域技术人员应当理解可以使用其它方法-例如将DNA酶与适体的多功能性结合使用和/或与传统蛋白质酶的催化能力结合使用(参见例如Zhang et al.,2005)。Zhang的方法引起蛋白质酶的释放,所述蛋白质酶又能够催化形成可检测分子从而产生并扩增信号。Zhang的方法允许灵敏检测,但因为每一分析都要求高度专门的分子而很昂贵。将肽与核酸偶合的方法在本领域为已知(参见例如Cheng et al.,1993),将DNA附着到载体结构上的方法也是如此。例如,Asher(PCT/US96/02380)描述了将酶(核酶)拴系到不溶性载体上,所述酶在释放时酶切底物从而使用两个空间上分开的核酶启动信号扩增。
用于体外方法的信号扩增的其它实施例在本领域中为已知,并且还能够使用与已证明成功的那些相类似的技术创造信号扩增的其它策略。例如分支的DNA分析(bDNA)(Urdea,1993)通过采用附着到介导反应的标记探针的二级报告分子(例如碱性磷酸酶)扩增信号。荧光相关光谱(FCS)采用信号的电子扩增(Eigen和Rigler,1994)。酪胺信号扩增(TSA)(Bobrow et al.,1989;Adams,1992;Raap et al.,1995;vanGijlswijk et al.,1997)使用辣根过氧化物酶将酪胺转化成其活性形式,所述辣根过氧化物酶结合蛋白质中的酪氨酸残基。TSA用于细胞免疫化学的多种应用中。Invader分析(Hall et al.,2000)采用以下述方式与靶序列结合的两个寡核苷酸,即允许每个靶分子随时间引起超过1000个酶切事件的核酸酶切割,并且所述酶切反应能够与荧光探针结合。然而,对已知的信号扩增方法有限制。例如,bDNA分析不如靶扩增方法灵敏。
因此,进一步参考图6,描述的是采用MNAzyme释放的酶作为部分信号扩增策略的方法实施例。能够产生信号,例如通过底物在荧光基团部分和淬灭基团部分之间的酶切从而使信号产生。预期在此使用的酶包括,但不限于,具有可测量活性的DNA酶、MNAzyme、核酶和蛋白质酶(protein enzyme),如蛋白酶(protease)、限制性核酸内切酶和其它水解酶。优选的靶是核酸序列,包括但不限于人类、动物、植物、病毒、细菌DNA或RNA。其它优选的靶可以包括朊病毒、酵母或真菌,或任何其它分子,例如包括但不限于糖蛋白、脂质、脂蛋白、完整有机体、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合。
从图6可以看出,在此被指定为“酶(Enzyme)”的代表性酶通过可酶切分子,优选核酸,附着到第一不溶性载体上。如图6中的实施例所示,用作酶“酶(Enzyme)”的附着物的可酶切分子是通用或普遍性MNAzyme底物。酶“酶(Enzyme)”的“可酶切锚”底物也附着在不溶性载体上但不与所述第一不溶性载体接触。“酶(Enzyme)”是具有可检测活性的任何酶,例如如上所述的MNAzyme、DNA酶、核酶或蛋白质酶。在优选的实施方案中,MNAzyme或DNA酶特别有用。在自组装形成能够酶切普遍性或通用底物的寡核苷酸组分或部件酶的存在下,和MNAzyme靶的存在下,MNAzyme形成并催化性酶切来自载体的“酶(Enzyme)”,从而将其释放并使其接近“可酶切锚”底物并将该底物酶切。酶切“可酶切锚”从附着的底物上释放荧光基团。所述荧光基团很容易检测和测量。
被固定或附着的酶与其底物(也优选被固定或附着到载体上)的物理分开有时候在此被称为“空间分开”。一个或多个酶能够与其各自的底物“空间分开”,也能够彼此之间“空间分开”。能够产生信号扩增级联,尤其是当第一酶的底物的酶切释放第二酶,而在酶切第二酶的底物时又释放更多的第一酶时(见图7)。
在优选的实施方案中,酶“酶(Enzyme)”的底物是如图所示包含淬灭基团部分和可检测部分的双官能团底物。特别优选的实施方案是其中酶“酶(Enzyme)”的底物是在未酶切底物中时不具有可检测信号且在酶切时其可检测信号增加一个或多个量级的分子的实施方案。
现在参考图7,示出了使用MNAzyme的检测和使用两个“空间分开”的酶的信号扩增的实施例。也能够使用如上所述的“空间分开”的DNA酶产生信号扩增级联。初始MNAzyme酶切事件酶切固定的拴系底物,从而释放DNA酶A。然后DNA酶A移动到拴系有第二DNA酶B的第二序列。DNA酶A释放DNA酶B,而这又释放更多的DNA酶A,启动了引起信号扩增的级联。在各种实施方案中,所述靶能够是核酸序列,包括但不限于人类、病毒、细菌DNA或RNA;或所述靶能够是蛋白、病毒、朊病毒、抗体、完整细胞或小分子。
具体地,从图7的实施例能够看出,DNA酶A通过也被DNA酶B酶切的第一普遍性MNAzyme底物或通用底物被附着到载体上。DNA酶B通过第二通用底物被附着到不溶性载体上,所述第二通用底物是DNA酶A的底物。保持两个DNA酶使得其各自的底物无法接近它们。在自组装形成酶切普遍性底物的MNAzyme的部件酶的存在下,并进一步在靶的存在下,MNAzyme形成并酶切保持DNA酶A的普遍性MNAzyme底物,从而释放DNA酶A。DNA酶A现在能够移动到第二通用底物。DNA酶A酶切第二通用底物时,释放DNA酶B及其附着的可检测信号,在此显示为荧光基团F。由于与保持的淬灭基团部分Q分开,荧光基团F现在是可检测的。现在能够接近其底物的释放的DNA酶B因此酶切它(第一通用底物)从而释放另外的DNA酶A,这又释放更多的DNA酶B和可检测信号F。因此,强烈的信号扩增级联被建立,其可检测信号F的量指数增加。
参考图25能够更好地理解使用拴系的部件酶的MNAzyme级联实施例。MNAzyme能够用来启动该图所示的信号扩增级联。该反应含有如下要素(i)在溶液中游离的MNAzyme 1的部件酶;(ii)在溶液中游离(如图所示)或由底物Sub 1拴系在不溶性载体上的MNAzyme 2和3(具有相同的感应臂)的组装易化子;(iii)由底物Sub 1拴系在不溶性载体上的MNAzyme 2的部件酶。Sub 1能够被MNAzyme 1酶切(在靶分析物的存在下),也能够被MNAzyme 3酶切(在组装易化子的存在下),并且酶切引起MNAzyme 2的部件酶释放至溶液中;(iv)由底物Sub 2拴系在不溶性载体上的MNAzyme 3的部件酶。Sub 2能够被MNAzyme 2酶切(在组装易化子的存在下),并且酶切引起MNAzyme 3的部件酶释放至溶液中;(v)具有与Sub 2相同的序列但在溶液中游离并用荧光基团(F)和淬灭基团(Q)双重标记的Sub 2-FQ。Sub 2-FQ能够被MNAzyme 2酶切以产生荧光信号。
在靶分析物的存在下,从溶液中游离的部件酶形成活性MNAzyme1。MNAzyme 1酶切其Sub 1从而释放MNAzyme 2的部件酶。这些部件酶一旦游离,便与组装易化子杂交并形成MNAzyme 2,所述MNAzyme 2酶切游离的Sub 2-FQ(产生荧光信号)或拴系的Sub 2(释放MNAzyme 3的部件酶)。由于MNAzyme 3与MNAzyme 1具有相同的底物臂,它也能够酶切拴系的Sub 1,从而释放MNAzyme 2的更多部件酶。这引起了更多酶(MNAzyme)的组分(部件酶)的酶促产生级联和伴随的信号扩增级联。
12.甲基化核酸的检测、鉴定和定量方法 MNAzyme介导的信号产生使得能够区分完全匹配的核酸序列与含有错配的核酸序列。这样的能力使MNAzyme能用来检测、鉴别和定量甲基化核酸。
与诸如癌症、糖尿病、自身免疫疾病和精神失常的疾病相关的甲基化模式的改变经常发生。目前用于甲基化分析的大多数方法都以亚硫酸氢盐修饰基因组DNA开始。亚硫酸氢盐修饰将未甲基化的而不是甲基化的胞苷转化成尿苷。如果然后通过例如PCR扩增亚硫酸氢盐修饰的核酸,则胸苷取代尿苷并且胞苷取代甲基化胞苷。修饰的扩增子能够用允许区分含有T(在最初含有未甲基化C的位置)和C(在最初含有甲基化的C的位置)的序列的各种方法进行分析。
MNAzyme区分十分相近序列的能力使这一技术非常适合于区分最初甲基化或未甲基化的亚硫酸氢盐修饰的序列。参考实施例11可以更好地理解这一方法。此外,MNAzyme能够提供直接分析甲基化与未甲基化的DNA而无需用亚硫酸氢盐修饰的新方法。这提供了显著的优势因为亚硫酸氢盐修饰费力、耗时而且对于待分析的核酸有破坏性。
已经使用带有具有截短的感应臂的部件酶的稳定因子臂来论证MNAzyme检测存在于组装易化子中的单一核苷酸多态性的能力(实施例22)。在该实施例中使用的实验条件下,具有截短的(5个碱基)感应臂的部件酶在远超过其预期解链温度之上的温度具有功能。具有稳定因子臂的系统和具有截短的感应臂的部件酶对靶中的小改变非常敏感,并且可在高度严紧的温度下使用。这样的检测策略能够进一步扩展到直接区分在特定的胞苷残基上甲基化或未甲基化的靶,不需要之前的亚硫酸氢盐修饰。
相对于未甲基化的胞苷,5-甲基胞苷的存在使DNA的解链温度增加,每一甲基化碱基增加1.3℃。当在适合于在甲基化靶的存在下杂交和活性MNAzyme组装但是对于在未甲基化靶的存在下的MNAzyme组装太高的温度下温育部件酶、稳定因子臂和底物时,信号会仅在甲基化靶的存在下产生。这提供了直接分析甲基化模式的新策略,所述甲基化模式能够提供作为癌症和其它疾病的标记物的甲基化碱基的检测方法。
因此,本领域技术人员会很容易理解和知道,预期将在此公开的温度的实验参数的最优化包括在本发明方法的范围之内,而且这样的优化尤其可用于实施与直接或在亚硫酸氢盐修饰之后检测甲基化DNA相关的方法。
13.核酸序列变异的检测和鉴定方法 本发明还提供检测和鉴别序列变异的方法,所述方法基于MNAzyme介导的信号产生使得能够区分完全匹配的核酸序列与含有错配的那些核酸序列。
能够通过本发明的方法检测的序列变异包括但不限于添加、删除、取代、转换、重复、易位、移码序列变异、无义序列变异或上述的任意组合。
该方法可以应用于任何需要检测和/或鉴别核酸序列变异的情形,包括但不限于疾病或患所述疾病的素因的诊断、多态性的鉴别或核酸复制准确性的评价。此外,也可以检测更大的改变,如与各种癌症类型相关的易位,所述易位引起融合转录。这些情形的发生经常与白血病相关。例如,PML/RARα融合转录与急性早幼粒细胞白血病相关,bcr/abl融合转录与慢性粒细胞白血病相关。
MNAzyme介导的靶检测能够通过部件酶感应臂和组装易化子的Watson-Crick碱基识别进行。能够采用对互补性的要求以检测小的序列变异,包括但不限于部件酶感应臂和组装易化子之间的单个碱基错配。参考实施例5、19和22可以更好地理解区分序列变异的能力。
那些实施例均证实了MNAzyme区分感应臂和组装易化子完全匹配的情形与有至少单个碱基错配或多态性的情形的能力。
区分单个碱基错配的能力依赖于多个因素,包括(a)反应条件的严紧性,能够被包括温度、盐浓度、阳离子浓度的多种因素影响;(b)错配的类型;(c)部件酶臂中错配的位置;和(d)部件酶臂的长度。根据本申请,能够调整反应的严紧性使之不耐受或耐受感应臂和组装易化子之间一定程度的错配。严紧的条件使得能够区分十分相近的序列变异,如单个核苷酸的差异。更低的严紧性条件不可以区分序列十分相近的组装易化子。因此,可以用该方法以单个MNAzyme在单个反应中同时检测一组十分相近的序列。
能够通过使用具有截短感应臂的部件酶扩展对单个核苷酸多态性的区分(图23和实施例22)。截短感应臂能够通过稳定因子寡核苷酸组分进行稳定,所述稳定因子寡核苷酸组分虽然是单独的分子,但能够视作截短部件酶的第二组分,它与截短感应臂相邻地结合。
14.用于检测、鉴定和/或定量细菌和病毒的MNAzyme 本发明包括检测细菌、病毒或任何其它微生物的方法,例如通过设计适合于与任何分子如待检测、鉴别和/或定量的微生物独有的核酸杂交的MNAzyme感应臂。另外或可选地,可以检测许多微生物,例如包括但不限于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。该方法的进一步变化在本领域技术人员的预期范围内,包括但不限于,使用适合于与待检测、鉴别和/或定量的微生物独有的蛋白、小分子、细胞、细胞组分或细胞产物如毒素相结合的适体。
细菌和病毒含有能够为用MNAzyme技术进行快速灵敏鉴别、检测和/或定量提供模板的DNA和/或RNA。细菌和病毒种类和株之间的序列变异能够用于各种类与株之间的灵敏区分。复合MNAzyme方法尤其优选用于同时检测和/或区分多种细菌或病毒种类、株或分离株。
或者,细菌或病毒种类和株中具有序列相似性的区域能够用来在单一MNAzyme分析中鉴别任何一组种类和株的存在与否。图15例示了这后一种方法,其中在细菌核糖体16S序列中发现的保守区域用作分析的基础,以取代用于快速释放测试无菌状态和/或支原体污染的革兰氏染色的细菌测试。
例示使用MNAzyme检测和定量HIV-1病毒RNA的实施例16论证了把MNAzyme用作病毒检测和定量的灵敏工具。
15.试剂盒 本发明也提供了用于实践在此公开的方法的试剂盒。通常,实施本发明方法的试剂盒含有实施本方法的所有必需试剂。例如,在一实施方案中试剂盒可以包含第一容器和第二容器,所述第一容器含有包含第一和第二部件酶的至少第一和第二寡核苷酸组分,所述第二容器包含底物,其中第一和第二部件酶和底物自组装成MNAzyme需要存在于测试样品中的组装易化子的协助。因此,在这样的实施方案中,所述第一和第二部件酶以及所述底物可以应用于测试样品以便确定所述组装易化子的存在,其中所述组装易化子包含靶。
通常,本发明的试剂盒也会包含一个或多个其它的容器,其含有例如洗涤剂和/或在实施本发明的方法中需要的其它试剂。
在本发明的背景下,间隔化的试剂盒包括其中试剂包含在独立容器中的任何试剂盒,并可以包括小玻璃容器、塑料容器或塑料条或纸条。这样的容器使得可以从一个隔间向另一隔间进行高效的试剂转移,同时避免样品与试剂的交叉污染,并且每一容器中的试剂或溶液可以定量地从一个隔间加入另一隔间。这样的试剂盒也可以包括会接受测试样品的容器、含有在分析中使用的试剂的容器、含有洗涤剂的容器和含有检测试剂的容器。通常,本发明的试剂盒也会包括使用试剂盒组分实施适当方法的说明书。本发明的试剂盒和方法可以与自动分析仪器及系统结合使用,例如,包括但不限于实时PCR仪器。
对于检测、鉴别或定量不同靶的应用,本发明的单一试剂盒可能是适合的,或者可选地为不同的试剂盒,例如含有对每一靶具有特异性的试剂。本发明的方法和试剂盒可以应用于其中要求检测、鉴别或定量任何实体的任何情形。
现在将参考如下具体的实施例更详细地进一步描述本发明,这些实施例不应以任何方式解释为对本发明范围的限制。
实施例 在如下实施例中,基于分裂10:23或8:17DNAzyme的催化核的某些MNAzyme设计适合于各种靶核酸和底物(表3)。这些靶底物系统已经在各种反应条件下测试过并被证明很强健。
在如下实施例中使用的MNAzyme设计和特异性部件酶的实例列于表3中。将部件酶命名为使得该名称(例如R O4A1/1)纳入对靶结构域(例如RPLPO外显子4的RO4)、MNAzyme催化活性必需的结构域(例如A1)和底物结构域(例如SubBi-1的1)的引用。
表3示例性MNAzyme和底物。工作实施例中使用的特异性部件酶
表3(续)示例性MNAzyme和底物。工作实施例中使用的特异性部件酶
表3(续)示例性MNAzyme和底物。工作实施例中使用的特异性部件酶
表3(续)示例性MNAzyme和底物。工作实施例中使用的特异性部件酶 实施例1MNAzyme直接检测靶核酸的应用(人类RPLPO序列) 1.1部件酶 寡核苷酸 测试了基于8:17DNA酶的对于MNAzyme的四个设计(图8-10)。本领域技术人员应当理解,“N”表示的感应臂(靶结合)序列可以用任何已知核酸靶的靶特异性序列代替(图8-10)。与报告底物结合的底物臂序列能够是通用的并且能够用于许多靶。本领域技术人员应当理解,图8-10中“N”表示的底物序列可以用DNA、RNA或DNA/RNA嵌合序列代替,用“r”表示的那些可以用其它和/或不同数目的核苷酸序列代替。
在用于测量在图8-10中描述的RPLPO MNAzyme催化活性的实验中,设计针对RPLPO基因的靶外显子4的A和B寡核苷酸部件酶。A和B部件酶的序列从5’到3’如下所示,其中加下划线的碱基形成组装MNAzyme的至少部分活性催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO1部件酶A1 RO4A1/1
CGGTCGAA
SEQ ID NO2部件酶A2 RO4A2/1
CGGTCGAA
SEQ ID NO3部件酶B1 RO4B1/1
CCGTCGAA
SEQ ID NO4部件酶B2 RO4B2/1
CCG
SEQ ID NO5部件酶B3 RO4B3/1
CCGAGC
1.2.报告底物 通过酶切双重标记的核酸报告底物监测MNAzyme的活性。报告底物是含有先前已经用作8:17DNA酶的底物的RNA和DNA碱基的嵌合序列(Li et al.,2000)。在当前实施例中,报告底物被命名为SubBi-1-FB并具有内部标记,分别是附着到RNA碱基核苷酸5’端的6-羧基荧光素(“6-FAM”),和附着到RNA碱基核苷酸3’端的黑孔淬灭基团1(“BHQ1”)部分。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测MNAzyme对于SubBi-1-FB的酶切,。SubBi-1-FB的标记序列如下,5’到3’,加下划线的碱基提示6-FAM和BHQ1部分的位置。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO6SubBi-1-FBACTCACTATaGGAAGAGATG 1.3.对照MNAzyme序列 通过使对催化核的形成至关重要的A1寡核苷酸中的单个碱基突变使杂交对照(无活性的MNAzyme)失活。尽管报告底物和靶序列仍然能够与MNAzyme结合,由于MNAzyme催化核的修饰,底物不能被酶切。由于杂交时报告底物的构象改变,报告底物与部件酶分子的结合本身可以产生荧光的测量值。将使用突变的A1部件酶分子(RO4A1mut)的对照包括在内并将其命名为杂交对照。突变的MNAzyme序列例示如下,被改变为T的G碱基的位置加有下划线。
SEQ ID NO7突变体部件酶A RO4A1mut/1GCTGGTCATCCAGCACGGTCTAAATAGTGAGT 1.5.靶 该实施例的靶序列是寡核苷酸,RO4/1靶,其具有与人类RPLPO基因的外显子4的片段相同的序列。RO4/1靶的序列如下,从5’到3’书写。
SEQ ID NO8 RO4/1靶 GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC 为了保证当存在不正确的靶序列时不能检测到信号,“脱靶”效应通过使用3μgλDNA(PROMEGA)或无关序列的合成的阴性对照寡核苷酸(RO4/1mut靶)来确定。
SEQ ID NO9RO4/1mut靶 CGACCATTAGGTCGTCCACAAGCTGTTACCG 1.5.反应组分 靶序列的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是25μL。所有的反应在Smart
系统热循环仪(Cepheid)中在40℃下进行。每7秒钟读取每一反应的荧光,总共读10分钟。表4中的所有反应含有在Tris HCl中的1μM SubBi-1-FB(PH 9.0,25℃)和25mM MgCl2的散装混合物。
表4用于检测核酸的反应组分
首先测试实验期间使用的Smart
系统热循环仪(Cepheid)上每一反应孔的背景荧光水平,因为已知这在各孔之间有变化。这通过单独读取散装混合物的荧光来测定。然后从在该孔进行的所有其它反应中减去这一值以便在各孔之间进行比较。
1.6.结果检测SubBi-1-FB报告底物的酶切 设计1和2MNAzyme示出了在本实验的条件下报告底物的靶依赖酶切的一点证据(图8)。有和没有靶RPLPO寡核苷酸靶的反应的荧光相似。对于设计3(图9和10)和设计4(图10),加入靶RPLPO寡核苷酸导致荧光增加。这与在靶核酸的存在下形成活性MNAzyme引起报告底物在荧光基团和淬灭基团染色对之间酶切而导致荧光增加相一致。无靶对照的荧光低于含有靶的反应的荧光并且没有一个对照反应显示荧光随时间增加(图8-10)。这表明在含有靶的反应中产生的荧光增加是由于催化活性MNAzyme的靶依赖性组装,所述MNAzyme然后酶切报告底物。对于RPLPO系统设计4的酶切效率大于设计3(图10)。
设计3示出脱靶、杂交、仅部件酶A和仅部件酶B的对照反应(图9)。这些对照的荧光水平比无靶反应低或相似。没有一个对照反应显示荧光随时间增加。这些结果进一步表明报告底物的酶切依赖于部件酶A和部件酶B寡核苷酸两者以及靶核酸序列的存在,所述部件酶A和部件酶B寡核苷酸是活性MNAzyme的组装所必需的。
实施例2用于检测miR-20或与miR-20具有同源性的短DNA序列的MNAzyme 2.1.部件酶寡核苷酸 使用MNAzyme的检测也能够用来分析miR。在本实施例中,MNAzyme仅在存在正确的miR序列时形成。这样的MNAzyme能够区分相关的miR序列例如hsa-miR-20和hsa-miR-93。
在为测量图11中描述的MNAzyme的催化活性而进行的实验中,将A和B部件酶寡核苷酸设计成靶向hsa-miR-20。部件酶A和B寡核苷酸的序列从5’到3’如下所示。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO10部件酶A2 miR20A2/1
CGGTCGAA
SEQ ID NO11部件酶B3 miR20B3/1
CCGAGC
2.2.报告底物 通过酶切双重标记的核酸报告底物监测MNAzyme活性。本实施例的报告底物是SubBi-1-FB,其序列从5’到3’如下所示。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。加下划线的碱基表示5’端的6-FAM部分和3’端的BHQ1部分的位置。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测在FAM和BHQ1之间的核苷酸处酶切SubBi-1-FB所引起的荧光改变。
SEQ ID NO6SubBi-1-FB ACTCACTATaGGAAGAGATG 2.3.靶 本实施例的靶序列是DNA寡核苷酸,D-20,其具有与RNAhsa-miR-20(图11(i))同源的序列。D-20靶的序列如下所示,从5’到3’书写。
SEQ ID NO12D-20靶 TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA 2.4.对照序列 被开发用来检测微小RNA的任何分析都必须特异地区分想要的miR序列例如hsa-miR-20与相关序列如hsa-miR-17-5p,所述hsa-miR-17-5p可以与靶miR具有一个或多个碱基不同(图11(i))。hsa-miR-20相关的“脱靶”17-5p、93、106a和106b miR寡核苷酸也被合成为DNA并从5’到3’写在下面。
SEQ ID NO13D-17-5p靶 CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGT SEQ ID NO14D-93靶 AAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG SEQ ID NO15D-106a靶 AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGC SEQ ID NO16D-106b靶 TAAAGTGCTGACAGTGCAGAT 2.5.反应条件 靶序列的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是25μL。所有的反应在Smart
系统热循环仪(Cepheid)中在40℃下进行。每7秒钟读取每一反应的荧光,总共读4分钟。表5中的所有反应含有由1μM SubBi-1-FB、Tris HCl(pH 9.0,25℃)和25mM MgCl2组成的散装混合物。
表5如图11所示检测核酸靶的反应组分
首先测试实验期间使用的Smart
系统热循环仪(Cepheid)上每一反应孔的背景荧光水平,因为已知这在各孔之间有变化。这通过单独读取散装混合物的荧光来测定。然后从在该孔进行的所有其它反应中减去这一值以便在各孔之间进行比较。
也在5mM和100mM MgCl2浓度的存在下进行了含靶、“无靶”和“脱靶”反应并与25mM MgCl2比较(图12)。
2.6.结果检测SubBi-1-FB报告底物的酶切 MNAzyme的部件酶A和B寡核苷酸仅在靶序列的存在下组装成催化活性MNAzyme。在本实施例中脱靶对照与感应臂(miR-20靶结合序列)的差异小到仅有两个错配碱基。“脱靶”D-17-5p有两个错配碱基,其中仅有一个在位于miR-20序列中间的最有差别的区域发生。含有靶序列D-20的酶切反应与无靶对照(图11(iii))相比信号增加26倍。这与脱靶对照相比较,D-17-5p和D-106a与无靶对照相比信号增加3.5倍,而D-93和D-106b与无靶对照相比信号没有增加(图11(iii))。因此,D-20与相关序列的差异证实了MNAzyme系统区分仅几个碱基不同的序列的能力。先前使用单分子DNA酶的研究已经证实DNA酶具有区分单个碱基突变的能力(Impey et al.,2000)。MNAzyme也可以区分单个碱基的改变(见下文的实施例5)。
“仅部件酶A”和“仅部件酶B”的对照具有与背景荧光相似(数据未显示)的荧光。
使用蛋白质酶要求反应中的其它试剂处在对于蛋白质酶活性来说最佳的浓度下。例如,辅助DNA酶酶切报告底物的金属离子辅因子的浓度在使用酶样聚合酶的方法中维持在最低值。使用MNAzyme的直接检测不需要任何蛋白质酶因此能够为快速底物酶切而优化反应条件。在这些反应中能够增加金属离子辅因子例如Mg2+以优化MNAzyme的催化速率。图12示出如何能够将MgCl2的浓度增加到靶检测方法正常不能耐受的水平。在高MgCl2(100mM)时MNAzyme的催化效率较高。此外,当检测D-20靶时MgCl2的增加不影响反应的特异性,因为仍然能将D-20靶清楚地与相关的序列D-17-5p靶、D-106a靶、D-93靶和D-106b靶进行区分。
实施例3用于直接检测核酸靶的MNAzyme(设计5和6) 3.1.部件酶寡核苷酸 测试基于10:23DNA酶的MNAzyme的设计5和6的催化活性(图13)。本领域技术人员应当理解,“N”表示的感应臂(靶结合)序列可以用任何已知核酸靶的靶特异性序列代替。与报告底物结合的底物臂序列能够是通用的并且能够用于许多靶。本领域技术人员应当理解,图13中“N”表示的底物序列可以用DNA、RNA或DNA/RNA嵌合序列代替。
在进行测量在图13中描述的RPLPO MNAzyme催化活性的实验中,设计靶向RPLPO基因的外显子5的A和B寡核苷酸部件酶。A和B部件酶的序列从5’到3’如下所示,其中加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。SEQ ID NO17和SEQ ID NO18中既非加下划线、黑体也非斜体的序列优选形成例如图13中描述的茎结构(见例如,设计5)。
SEQ ID NO17部件酶A3 RO5A3/2
CACAACGA
SEQ ID NO18部件酶B4 RO5B4/2
GGCTAGCTGCG
SEQ ID NO19部件酶A4 RO5A4/2
ACAACGA
SEQ ID NO20部件酶B5 RO5B5/2
GGCTAGCT
3.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-2,其序列从5’到3’如下所示。在当前的实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-FB。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-2-FB的酶切。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO21SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 3.3.靶序列 本实施例中的靶序列是合成的寡核苷酸RO5/1靶,其序列从5’到3’如下所示。该靶序列具有与RPLPO基因外显子5部分相同的序列。
SEQ ID NO22RO5/1靶 GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG 3.4.反应组分 靶序列的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是25μL。所有反应在Smart
系统热循环仪(Cepheid)中在55℃下进行。每7秒钟读取每一反应的荧光,总共读5分钟。表6中的所有反应含有1μM SubBi-1-FB、Tris HCl(pH 9.0,25℃)和25mM MgCl2。
表6如图13所示用于检测核酸靶的反应组分
首先测试实验期间使用的Smart
系统热循环仪(Cepheid)上每一反应孔的背景荧光水平,因为已知这在各孔之间有变化。这通过单独读取散装混合物的荧光来测定。然后从在该孔进行的所有其它反应中减去这一值以便在各孔之间进行比较。
3.5.底物的检测和酶切 使用设计5和6的MNAzyme的含靶反应表明与无靶对照(图13ii)相比,上插图和下插图各自的荧光随时间增加。这表明部件酶寡核苷酸仅在靶序列的存在下组装形成催化活性MNAzyme并酶切报告底物。无靶对照没有显示荧光的增加,表明没有发生酶切。设计6的酶切速率比设计5快很多。
实施例4使用MNAzyme检测来自体外PCR扩增核酸序列的扩增子 4.1.部件酶寡核苷酸 MNAzyme也能够用于检测来自体外扩增核酸序列的扩增子。对于本实施例,检测扩增子以两步法进行,但也可以在单一反应中进行。在这种情况下,用来检测扩增子的寡核苷酸以设计4为基础,所述设计4使用检测人类RPLPO基因的寡核苷酸RO4A2/1和RO4B3/1(图10)。A和B部件酶寡核苷酸如下所示。在如下的序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO2部件酶A2 RO4A2/1
CGGTCGAA
SEQ ID NO5部件酶B3 RO4B3/1
CCGAGC
4.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-1-FB,其序列从5’到3’如下所示。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。加下划线的碱基表示5’端处6-FAM部分和3’端处BHQ1部分的位置。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-1-FB的酶切。
SEQ ID NO6 SubBi-1-FB ACTCACTATaGGAAGAGATG 4.3.PCR扩增人类RPLPO基因的引物 本实施例的靶序列使用如下所示的PCR引物通过体外PCR扩增来自RPLPO基因的外显子4的序列产生,所述RPLPO基因来自从K562(PROMEGA)细胞系提取的人类基因组DNA。
SEQ ID NO23引物5RO4/3 CAAGACTGGAGACAAAGTG SEQ ID NO24引物3RO4/2 GCAGAGTTTCCTCTGTGATA 4.4.对照靶寡核苷酸 合成寡核苷酸并将其用作RPLPO序列的阳性对照。在这些实验中,对照寡核苷酸不通过PCR扩增。
SEQ ID NO8 RO4/1靶 GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC 4.5.反应组分PCR扩增RPLPO基因 RPLPO基因的PCR扩增以25μL的总反应体积进行。所有的扩增反应在Gene
PCR系统9700热循环仪(Applied Biosystems)中进行。循环参数是95℃7分钟、95℃5秒钟和65℃(每一循环温度降低1℃)30秒钟的10个循环、最后95℃5秒钟和55℃30秒钟的50个循环。所有的反应含有40nM 5R04/3和200nM 3RO4/2、3mM MgCl2、200μM的每一dNTP、1x Immobuffer(Bioline)和1单位Immolase(Bioline),含有或不含有500ng K562人类基因组DNA(PROMEGA)。
4.6.反应组分检测靶序列 靶序列的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是25μL。所有的反应在Smart
系统热循环仪(Cepheid)中在40℃下进行。每7秒钟读取每一反应的荧光,总共读10分钟。表7中的所有反应含有1μM SubBi-1-FB、Tris HCl(pH 9.0,25℃时)和25mMMgCl2的散装混合物。寡核苷酸部件酶A和B的浓度是1μM。
表7体外PCR后用于检测RPLPO DNA扩增子的反应组分。使用设 计4的MNAzyme系统(RO4A2/1RO4B3/1) 首先测试实验期间使用的Smart
系统热循环仪(Cepheid)上每一反应孔的背景荧光水平,因为已知这在各孔之间有变化。这通过单独读取散装混合物的荧光来测定。然后从在该孔进行的所有其它反应中减去这一值以便在各孔之间进行比较。
4.7.结果检测SubBi-1-FB报告底物的酶切 用于检测RPLPO外显子4的MNAzyme设计4表明,当靶RPLPO序列是从人类基因组DNA通过PCR扩增时,荧光随时间增加(图14)。RPLPO扩增子的荧光增加与可见到的1012拷贝的阳性对照RO4/1靶寡核苷酸的荧光增加相似。无靶对照的荧光低于含靶反应中的荧光并且没有一个阴性反应显示荧光随时间增加。这表明含靶反应中产生的荧光增加是由于随后酶切报告底物的催化活性MNAzyme的靶依赖性组装。
实施例5使用MNAzyme检测体外PCR扩增短核酸序列产生的扩增子 5.1.部件酶寡核苷酸 MNAzyme能够用来检测来自体外扩增核酸序列的扩增子。在本实施例中扩增和检测用三步法进行(图5)但是逆转录、PCR扩增和检测也可以在单一反应管中同时进行。对于本实施例,用来检测扩增子的寡核苷酸使用被设计用来检测hsa-miR-20的设计4、miR部件酶A和B寡核苷酸(图11)。MNAzyme部件酶寡核苷酸如下所示,使得加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO10部件酶A2 miR20A2/1
CGGTCGAA
SEQ IDNO11部件酶B3 miR20B3/1
CCGAGC
5.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-1-FB,其序列从5’到3’如下所示。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。加下划线的碱基表示5’端处6-FAM部分和3’端处BHQ1部分的位置。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-1-FB的酶切。
SEQ ID NO6 SubBi-1-FB ACTCACTATaGGAAGAGATG 5.3.用于扩增22mer D-20寡核苷酸靶序列的PCR引物 本实施例的靶序列通过使用下列寡核苷酸PCR引物体外扩增D-20寡核苷酸产生。
SEQ ID NO25引物5miR20/1 ACGTGACGCTAAAGTGCT SEQ ID NO26引物3miR20/L1 CGTCCGAATGACGTACCTGCAC SEQ ID NO27引物3miR20/P1 CGAATGACGTACCTGCAC 5.4.靶序列和对照 把与miR-20同源的DNA序列(D-20靶)用作模板来例示用PCR和MNAzyme扩增和检测短序列。
SEQ ID NO12 D-20靶 TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA 此外,为了确保错误地扩增的任何十分相近的“脱靶”序列不能用miR-20系统检测到,对照靶DNA寡核苷酸D-17-5p靶也用miR-20部件酶A和B寡核苷酸系统测试。
SEQ ID NO13 D-17-5p靶 CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGT 5.5.反应组分扩增靶序列 扩增靶序列以25μL的总反应体积进行。所有的扩增反应在Gene
PCR系统9700热循环仪(Applied Biosystems)中进行。步骤1和2(逆转录和PCR)的循环参数是42℃30分钟、95℃7分钟、95℃5秒钟和30℃(每一循环增加2℃)30秒钟的10个循环和最后95℃5秒钟和50℃30秒钟的50个循环。反应最初仅含有10nM 3miR20/L1,42℃30分钟之后反应暂停并加入30nM 3miR20/P1和200nM5miR20/1。列出的所有其它试剂都在初始的反应混合物中,3mMMgCl2、200μM的每一dNTP、1x Immobuffer(Bioline)和1单位Immolase(Bioline),以及a)108拷贝D-20靶、b)无靶(dH2O)或c)108拷贝脱靶DNA(D-17-5p靶)之一。
5.6.反应组分检测靶序列 靶序列的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是25μL。所有的反应在Smart
系统热循环仪(Cepheid)中在40℃下进行。每7秒钟读取每一反应的荧光,总共读10分钟。表8中的所有反应含有1μM SubBi-1-FB、Tris HCl(pH 9.0,25℃)和25mM MgCl2的散装混合物。部件酶A和B的浓度是1μM。
表8用于检测体外扩增的短(20-25mer)核酸序列的反应组分。
MNAzyme系统使用设计4(miR20A2/1miR20B3/1)。
首先测试实验期间使用的Smart
系统热循环仪(Cepheid)上每一反应孔的背景荧光水平。然后从在该孔进行的所有其它反应中减去这一值以便在各孔之间进行比较。
5.7.结果检测SubBi-1-FB报告底物的酶切 用于检测miR-20的MNAzyme设计4表明,当所用的靶序列是通过PCR扩增的D-20靶时荧光随时间增加(图15(i))。
无靶对照的荧光比含靶反应低,并且没有一个阴性对照显示荧光随时间增加。这表明含靶反应中产生的荧光增加是由于随后酶切报告底物的催化活性MNAzyme的靶依赖性组装。
在本实施例中脱靶对照(D-17-5p)也用miR-20引物扩增,因为它仅在与miR-20引物杂交的区域内的末端位置有一错配。D-20靶和D-17-5p靶两者的扩增通过电泳证实。由于这两种扩增子在它们的末端纳入引物序列,它们现在仅在扩增子的中间有单一碱基不同。MNAzyme成功地区分了D-20和D-17-5p扩增子。这一区分是位于图15(ii)所描述的引物之间的区域内D-20和D-17-5p扩增子中的单个核苷酸差异的结果。MNAzyme要求引物之间的四个碱基存在(从而能够区分引物二聚体与真正的扩增子)而且那四个碱基必须确实没有取代耐受。本实施例例示了MNAzyme区分十分相近的序列的能力,包括仅单一核苷酸多态性不同的那些序列。
实施例6使用MNAzyme检测体外PCR扩增总RNA产生的微小RNA扩增子 6.1.部件酶寡核苷酸 MNAzyme能够用来检测来自体外扩增的核酸序列的扩增子。在本实施例中扩增和检测用两步法进行(图5),其中逆转录和PCR扩增在第一管中发生,接着是第二管中MNAzyme介导的检测。对于本实施例,用来检测扩增子的寡核苷酸是被设计用来检测hsa-miR-20的设计4、miR部件酶A和B寡核苷酸(图11)。MNAzyme部件酶寡核苷酸如下所示,使得加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO10部件酶A2 miR20A2/1
CGGTCGAA
SEQ ID NO11部件酶B3 miR20B3/1
CCGAGC
6.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-1-FB,其序列从5’到3’如下所示。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。加下划线的碱基表示5’端处6-FAM部分和3’端处BHQ1部分的位置。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-1-FB的酶切。
SEQ ID NO6 SubBi-1-FB ACTCACTATaGGAAGAGATG 6.3.扩增hsa-miR-20的PCR引物 本实施例的靶序列通过使用下列寡核苷酸引物体外扩增人胸腺总RNA(Ambion)产生。
SEQ ID NO25引物5miR20/1 ACGTGACGCTAAAGTGCT SEQ ID NO26引物3miR20/L1 CGTCCGAATGACGTACCTGCAC 6.4.靶序列和对照 人胸腺总RNA(Ambion)用作扩增miR-20的模板,然后用MNAzyme检测扩增子(6.6部分)。
与miR-20同源的RNA序列(R-20靶)用作证实短序列扩增的阳性对照,然后用MNAzyme检测所得到的扩增子。
SEQ ID NO28R-20靶 uaaagugcuuauagugcaggua 6.5.反应组分扩增靶序列 靶序列的逆转录和PCR扩增以25μL的总反应体积进行。所有的扩增反应在Gene
PCR系统9700热循环仪(Applied Biosystems)中进行。循环参数是40℃30分钟、95℃7分钟、95℃5秒钟和30℃(每一循环温度升高2℃)30秒钟的10个循环和最后95℃5秒钟和50℃30秒钟的50个循环。反应含有40nM 3miR20/L1和200nM5miR20/1、3mM MgCl2、200μM的每一dNTP、10单位Rnasin(Promega)、30单位MMLV(-H)逆转录酶(Promega)、1xImmobuffer(Bioline)和0.5单位Immolase(Bioline),以及a)1μg总RNA、b)无靶(dH2O)或c)1014拷贝R-20靶寡核苷酸。
6.6.反应组分检测靶序列 靶序列的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是25μL。所有的反应在Smart
系统热循环仪(Cepheid)中在40℃下进行。每30秒钟读取每一反应的荧光,总共读5分钟。表9中的所有反应含有1μM SubBi-1-FB、1μM partzyne A、1μM partzyne B、50mM TrisHCl(pH 9.0,25℃)、25mM MgCl2和靶的散装混合物(如表9所示)。
表9用于检测体外扩增的总RNA的反应组分。MNAzyme系统使用设计4(miR20A2/1miR20B3/1)。
测试Smart
系统热循环仪(Cepheid)上每一反应孔的背景荧光水平。然后从在该孔进行的所有其它反应中减去这一值以便在各孔之间进行比较。
6.7.结果检测SubBi-1-FB报告底物的酶切 用于检测miR-20的MNAzyme设计4表明,当所用的靶序列是通过PCR扩增的总RNA时荧光随时间增加(图16)。
无RNA靶对照的荧光比含RNA靶反应的荧光低,并且没有一个阴性对照反应显示荧光随时间增加。这表明含靶反应中产生的荧光增加是由于随后酶切报告底物的催化活性MNAzyme的靶依赖性组装。虽然本实验分两步进行(逆转录/PCR,然后MNAzyme终点检测),所有步骤可以在单一反应管中同时进行以实时监测反应。
实施例7通过MNAzyme与核酸信号级联结合进行靶检测 7.1.MNAzyme启动信号扩增级联 通过将MNAzyme检测与信号扩增级联反应结合能够减少核酸检测的限制,如图7所示。MNAzyme也可以使级联启动的引发机理具有高度特异性。
7.2.空间分开的DNA酶级联 能够用各种方法将DNA酶拴系到载体上,所述方法包括附着到用抗生蛋白链菌素涂覆的塑料晶片上,所述抗生蛋白链菌素允许生物素标记的DNA酶的附着。用于附着的序列也能够用作通用MNAzyme/DNA酶底物。在靶与允许形成活性MNAzyme的部件酶序列杂交后,能够检测到靶(例如核酸序列)。然后MNAzyme能够酶切拴系的通用底物从而释放DNA酶A。然后DNA酶A能够移动到拴系DNA酶B的第二固体表面的第二通用底物。DNA酶A能够酶切第二通用序列,从而释放DNA酶B。在荧光基团/淬灭基团染色对之间酶切该底物能够引起荧光增加。释放的DNA酶B又能够酶切更多的第一底物,从而释放更多的DNA酶A并启动引起信号扩增的信号级联(图7)。
本实施例描述了一种使用空间分开的DNA酶产生信号级联的机制,然而,也存在可以使用催化核酸进行信号扩增的其它方法。本领域技术人员应当理解,任何这样的方法完全可以在此使用,条件是通过某些附着或物理分隔手段使底物保持与作用于它的酶“无法接近”。可以与MNAzyme启动的反应结合的核酸信号扩增的其它实施例包括但不限于,连接级联(Paulhe and Joyce,2004)和循环DNA酶级联(Levyand Ellington,2003),其中每一级联都具有保持酶与其底物“分开”的基本原则,当酶与底物接触使得能够产生催化活性时,直接或间接的扩增信号或信号级联就会产生。
实施例8使用MNAzyme定量核酸靶 8.1.部件酶寡核苷酸 使用体外靶扩增方法如PCR,能够将MNAzyme用来实时监测靶核酸的扩增。此外,实时监测可以定量反应中最初存在的靶的量。在本实施例中,扩增和检测用一步法进行,其中PCR扩增和MNAzyme介导的检测在单一管中同时发生。部件酶寡核苷酸A和B使用设计6,所述设计6具有与人类RPLPO基因的外显子5互补的感应臂(图17(i))。部件酶寡核苷酸如下所示,其中“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO29部件酶A4 RO5A4/3-P
ACAACGA
SEQ ID NO30部件酶B5 RO5B5/3-P
GGCTAGCT
8.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-3,其序列从5’到3’如下所示。在当前的实施例中,对于SubBi-3-FB在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-3-FB的酶切。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO31SubBi-3-FB CAGCACAACCguCACCAACCG 8.3.用于扩增RPLPO外显子5的PCR引物 本实施例的靶序列通过使用下列寡核苷酸PCR引物体外扩增人类基因组DNA而产生。
SEQ ID NO32引物5RO5/1 CATTCTATCATCAACGGGTA SEQ ID NO33引物3RO5/1 CAAAGGCAGATGGATCAG 8.4.靶序列 从K562细胞系(Promega)提取的人类基因组DNA用作扩增RPLPO基因的模板。
8.5.反应组分扩增和定量靶序列 实时扩增和定量靶序列以25μl的总反应体积进行。所有的反应在ABI7700热循环仪(Applied Biosystems)中进行。循环参数是95℃7分钟、95℃5秒钟和60℃(每一循环温度降低1℃)30秒钟的10个循环和最后95℃5秒钟和50℃30秒钟的50个循环。反应含有40nM5RO5/1和200nM 3RO5/1、200nM RO5A4/3-P和200nM RO5B5/3-P、200nM SubBi-3-FB、10mM MgCl2、200μM的每一dNTP、10单位Rnasin(Promega)、1x ROX参照(reference)(Invitrogen)、1x Immobuffer(Bioline)、0.25单位Immolase(Bioline),以及基因组DNA模板(20,000pg、4000pg、800pg、160pg、32pg和6.4pg)或无靶(dH2O)。
8.6.结果扩增靶和酶切SubBi-3-FB报告底物 实时检测和定量RPLPO外显子5的MNAzyme设计6表明,当所用的靶序列是通过PCR扩增的人类基因组DNA时荧光随时间增加(图17(ii))。
无DNA靶对照的荧光低于含DNA靶反应中的荧光并且在反应期间不增加。这表明含靶反应产生的荧光增加是由于随后酶切报告底物的催化活性MNAzyme的靶依赖性组装。通过将DNA浓度的对数对引起线性图的循环阈值作图,产生相关系数为0.995的标准曲线。在含有6.4pg基因组DNA的反应中,会存在大约10拷贝的靶。本实施例表明本方法的高灵敏度。
虽然本实验使用不对称的引物比,接下来使用实时PCR(数据未示出)的实验表明MNAzyme检测也与使用对称引物比的PCR相适宜。
实施例9同时针对多种靶使用多种MNAzyme的复合反应 9.1.部件酶寡核苷酸 在包含多个独特MNAzyme的一复合反应中能够同时检测多种靶。每一MNAzyme具有对一种靶具有特异性的感应臂和对一系列通用底物中的独特成员具有特异性的底物臂,每一所述底物用不同的荧光基团标记(图18)。在如下的实施例中,设计MNAzyme以检测两不同的靶,即RPLPO和D-20序列。应当理解,能够根据本方法使用任何数目的靶。部件酶A和B的序列从5’到3’如下所示。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO29部件酶A4 RO5A4/3-P
ACAACGA
SEQ ID NO30部件酶B5 RO5B5/3-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO34部件酶A4 miR20A4/2
ACAACGA
SEQ ID NO35部件酶B5 miR20B5/2
GGCTAGCT
9.2.报告底物 本实施例中使用的两报告底物是SubBi-2和SubBi-3,其序列从5’到3’如下所示。在当前的实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-FB。对于SubBi-3在5’端用6-JOE部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-3-JB。
以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-2-FB的酶切,并且以520nm(JOE激发波长)激发在548nm(JOE发射波长)下监测SubBi-3-JB的酶切。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO21 SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA SEQ ID NO36 SubBi-3-JB CAGCACAACCguCACCAACCG 9.3.靶序列 本实施例的靶序列是合成寡核苷酸RO5/1和D-20靶,其序列从5’到3’如下所示。RO5/1靶序列具有与RPLPO基因的外显子5部分相同的序列,D-20靶序列是RNA hsa-miR-20的DNA同源物, SEQ ID NO22 RO5/1靶 GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG SEQ ID NO12 D-20靶 TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA 9.4.反应条件 靶序列的检测通过监测由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是25μL。所有的反应在Smart
系统热循环仪(Cepheid)中在55℃下进行。每7秒钟读取每一反应的荧光,总共读5分钟。表10中的所有反应含有PCRII缓冲液(Applied Biosystems)和25mM MgCl2。
表10用于同时检测两种不同核酸靶的反应组分。
首先测试实验期间使用的Smart
系统热循环仪(Cepheid)上每一反应孔的背景荧光水平,因为已知这在各孔之间有变化。这通过单独读取散装混合物的荧光来测定。然后从在该孔进行的所有其它反应中减去这一值以便在各孔之间进行比较。
9.5.结果底物的检测和酶切 含有靶D-20或RPLPO的单位点反应表明,与无靶对照相比荧光随时间增加(图19(i))。这表明部件酶仅在靶序列的存在下组装成催化活性MNAzyme并酶切报告底物。“无靶”(dH2O)对照的荧光不增加,表明缺乏靶时没有发生酶切。同时检测RPLPO和D-20的复合反应产生的每一靶的结果(图19(ii))与在单位点(单位点)反应中观察到每一靶的结果相似。“无靶”对照反应中没有观察到荧光增加。这些结果表明在单一反应中同时检测多种靶而不失去特异性。
实施例10使用MNAzyme定量体外扩增微小RNA产生的扩增子 10.1.部件酶寡核苷酸 使用体外靶扩增方法如RTPCR,MNAzyme能够用来实时监测靶核酸的扩增。此外,实时监测可以定量反应中最初存在的靶的量。在本实施例中,扩增和检测用两步法进行,其中第一步包括通过逆转录产生cDNA,然后PCR扩增和MNAzyme介导的cDNA检测在第二步中同时发生。部件酶寡核苷酸A和B使用具有与人类微小RNAhsa-let-7a互补的感应臂的设计6。部件酶寡核苷酸如下所示,其中“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO37部件酶A4 PCR7aA4/2-P
ACAACGA
SEQ ID NO38部件酶B5 PCR7aB5/2-P
GGCTAGCT
10.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-2,其序列从5’到3’如下所示。在当前实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-FB。以492nm(FAM激发波长)激发在516nm(FAM发射波长)下监测SubBi-2-FB的酶切。在如下序列中,小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO21SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 10.3.靶序列 本实施例的标准曲线通过合成RNA寡核苷酸R-let7a的两步RTPCR产生,所述合成RNA寡核苷酸R-let7a具有与RNA hsa-let-7a同源的序列。R-let7a的序列从5’到3’如下所示。
SEQ ID NO39R-let7a ugagguaguagguuguauaguu 扩增来自结肠细胞(Ambion)、K562白血病细胞、HeLa宫颈癌细胞(Ambion)和脾细胞(Clontech)的人类总RNA样品并分析hsa-let-7a的丰度。
10.4.用于扩增hsa-let-7a的PCR引物 使用下列引物来扩增hsa-let-7a。引物3let7a用于逆转录,引物5let7a和3PCR7a用于PCR扩增。
SEQ ID NO40引物3let7a AGCGAAGCTGAGACAACTATACAA SEQ ID NO41引物5let7a CGACGTGACCGTGAGGTAG SEQ ID NO42引物3PCR7a CATGGCACAAGCGAAGCTGA 10.5.反应组分靶序列的逆转录 靶序列的逆转录以25μL的总反应体积进行。反应在2720热循环仪(Applied Biosystems)上在20℃温育20分钟,接着在30℃温育20分钟,然后在40℃温育20分钟。反应含有10nM 3let7a、5mM MgCl2、300μM的每一dNTP、20单位Rnasin(Promega)、1x Immobuffer(Bioline)、100单位M-MLV RT(H-),和来自正常结肠(0.1μg)、K562(0.1μg)、HeLa(0.2μg)或脾(0.2μg)的R-let7a(6×1011拷贝)或人类总RNA。对照反应含有上述所有试剂但是缺乏RNA靶而代之以仅含5μLdH2O。
10.6.反应组分靶序列的扩增和定量 靶序列的实时扩增和定量以25μL的总反应体积进行。所有的反应在Mx3005PTM QPCR系统(Stratagene)上进行。循环参数是95℃7分钟、95℃15秒钟和40℃(每一循环温度增加1℃)30秒钟的10个循环、最后95℃15秒钟和50℃30秒钟的50个循环。所有的反应含有200nM 3PCR7a和40nM 5let7a、400nM PCR7aA4/2-P和400nMPCR7aB5/2-P、200nM SubBi-2-FB、10mM MgCl2、200μM每一dNTP、20单位Rnasin(Promega)、1x Immobuffer(Bioline)、1单位Immolase(Bioline),和5μL R-let7a cDNA(含5×108、5×107、5×106、5×105、5×104拷贝)、人类总RNA模板(正常结肠,0.5μg;K562,0.5μg;HeLa,1μg;脾,1μg)或无靶(dH2O)。
10.7.结果靶的扩增和SubBi-2-FB报告底物的酶切 用于实时检测和定量hsa-let-7a的MNAzyme表明,当所用的靶序列产生自合成RNA寡核苷酸或人类总RNA时,荧光随时间增加。没有检测到无靶对照反应的信号(表11)。这表明含靶反应中产生的荧光增加是由于随后酶切报告底物的催化活性MNAzyme的靶依赖性组装。通过将初始RNA浓度的对数对循环阈值作图产生标准曲线,得到相关系数为0.999的直线图。也扩增了4个人类总RNA样品并通过从标准曲线外推估计出了每一样品中hsa-let-7a的量(表11)。
表11扩增和检测hsa-let-7a扩增子的反应结果
本实施例证实了MNAzyme检测和定量通过RTPCR扩增人类微小RNA产生的扩增子的能力。由于其约22个碱基的小尺寸,微小RNA难以扩增和检测。MNAzyme适合于这一应用。
实施例11使用MNAzyme检测DNA甲基化 11.1.部件酶寡核苷酸 实施例19表明,实时PCR和MNAzyme介导的信号产生允许区分完全匹配的核酸序列和包含C/C错配的那些序列。该能力使得MNAzyme能够用来分析细胞的甲基化状态。甲基化模式改变的发生经常与癌症相关。大多数甲基化分析方法以用亚硫酸氢盐修饰基因组DNA开始,该修饰将未甲基化而非甲基化的胞苷转化成尿苷。然后,PCR扩增修饰过的DNA以胸苷替换尿苷,并能够用多种方法区分含T(原先未甲基化的C)和C(原先甲基化的C)的序列。在如下实施例中,使用MNAzyme在亚硫酸氢盐修饰过的DNA中确定在p16基因启动子区域的特异性CpG对(doublet)的甲基化状态。
在本实施例中,部件酶被设计用来匹配亚硫酸氢盐修饰甲基化p16基因后产生的序列。部件酶的序列如下所示(5’到3’)。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与亚硫酸氢盐修饰的靶杂交,斜体碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO43部件酶A5 p16A5/3-P
TACAACGA
SEQ ID NO44部件酶B6 p16B6/3-P
GGCTAGC
11.2.报告底物 本实施例中使用的报告底物是SubBi-3。在当前实施例中,对于SubBi-3在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-3-FB。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-3-FB的酶切。SubBi-3-FB的序列如下所示(5’到3’);小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO31 SubBi-3-FB CAGCACAACCguCACCAACCG 11.3.扩增亚硫酸氢盐修饰的p16的PCR引物 在本实施例中,PCR引物被设计用来匹配亚硫酸氢盐修饰的靶,所述靶原先已被甲基化。本实施例的靶序列通过使用下列寡核苷酸PCR引物(5’到3’)体外扩增亚硫酸氢盐修饰的人类基因组DNA产生。
SEQ ID NO45引物5p16 GTTGGTTACGGTCGCGGTTC SEQ ID NO46引物3p16 CCGACCGTAACTATTCGATACG 11.4.靶序列和对照 从K562细胞系提取的人类基因组DNA用作含未甲基化p16基因启动子的阴性对照基因组DNA。普遍性CpG甲基化基因组DNA(Chemicon)用作甲基化p16基因启动子的对照。根据厂家的说明书,用MethylEasy试剂盒(Human Genetic Signatures)将基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰过夜。然后,将甲基化DNA和未甲基化DNA连续地稀释以得到一系列样品,它们含有不同比例的在p16基因启动子上甲基化的DNA,这些比例分别为100%、20%、4%、0.8%、0.16%和0.032%。不含核酸酶的dH2O代替基因组DNA用作无靶对照。
11.5.反应组分扩增和定量靶序列 靶序列的实时扩增和定量以25μL的总反应体积进行。所有的反应在MX3005p QPCR系统上进行。循环参数是95℃7分钟、95℃15秒钟和56℃30秒钟的10个循环、最后95℃15秒钟和52℃30秒钟的50个循环。反应含有200nM 5p16和40nM 3p16、200nM p16A5/3-P和200nM p16B6/3-P、200nM SubBi-3-FB、7.5mM MgCl2、200μM每一dNTP、10单位Rnasin(Promega)、1x Immobuffer(Bioline)、1单位Immolase(Bioline),以及150ng亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA(含有100%、20%、4%、0.8%、0.16%或0.032%甲基化的DNA)或仅dH2O(无靶对照反应)。所有的反应以双份进行。
11.6.结果通过MNAzyme检测甲基化 甲基化特异性MNAzyme表明,当靶样品含有100%到低至0.16%的甲基化DNA时荧光随时间增加(表12)。与之相比,当靶样品含有0.032%和0%的甲基化DNA时,反应显示低荧光水平,与在无靶对照中看到的相似,并且荧光不随时间增加。由于甲基化靶的比例减少,反应的Ct增加并作出R2值为0.996的标准曲线。实验结果总结于如下的表12中。
表12.使用MNAzyme检测亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA样品中的DNA甲基化。
在本实施例中使用的条件下,甲基化的p16特异性引物和MNAzym能够区分甲基化和未甲基化的靶。此外,该系统在未甲基化靶的背景下允许检测0.16%的甲基化靶。PCR反应中的100%效率暗示每一循环处有倍增。在本实验中观察到的133%的效率提示既有靶扩增(通过PCR),也有MNAzyme的催化活性扩增的扩增子检测。
实施例12由具有形成发夹结构的感应臂的部件酶组装的MNAzyme。
能够组装成活性MNAzyme的部件酶的结构是灵活多样的。本实施例示出了与MNAzyme活性相适宜的另外的结构。
12.1.部件酶寡核苷酸 当部件酶A、部件酶B或部件酶A和B两者的感应臂区域后面连着任意的发夹序列时,也能够用MNAzyme进行检测。在如下实验中,部件酶A和B被设计用来靶向人类微小RNA hsa-miR-143的序列。部件酶A和部件酶B寡核苷酸的序列从5’到3’如下所示。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交,并且普通文本的碱基形成发夹。
SEQ ID NO142部件酶A2 miR143A2/1
CGGTCGAA
SEQ ID NO143部件酶B3 miR143B3/1
CCGAGC
SEQ ID NO144部件酶A2 miR143A2H/1 GGCACTAACGTGCC
CGGTCGAA
SEQ ID NO145部件酶B3 miR143B3H/1
CCGAGC
12.2.报告底物 通过酶切双重标记的核酸报告底物监测MNAzyme的活性。本实施例的报告底物是SubBi-1-FB,其序列从5’到3’如下书写。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。加下划线的碱基表示5’端6-FAM的位置和3’端BHQ1部分的位置。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测由于在FAM和BHQ1之间的脱氧核糖核苷酸处酶切SubBi-1-FB引起的荧光改变。
SEQ ID NO6 SubBi-1-FB ACTCACTATaGGAAGAGATG 12.3.靶 本实施例的靶序列是DNA寡核苷酸D-143靶,所述D-143靶具有与人类微小RNA hsa-miR-143同源的序列。D-143靶的序列从5’到3’如下书写。
SEQ ID NO146D-143靶 TGAGATGAAGCACTGTAGCTCA 12.4.反应条件 靶序列的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是25μL。所有的反应在Smart
系统热循环仪(Cepheid)中在40℃下进行。每7秒钟读取每一反应的荧光,总共读10分钟。表13中的所有反应含有在1μM SubBi-1-FB、10mM Tris HCl(pH 9.0,25℃)和25mM MgCl2的散装混合物。
表13用于检测核酸靶的反应组分。
首先测试实验期间使用的Smart
系统热循环仪(Cepheid)上每一反应孔的背景荧光水平,因为已知这在各孔之间有变化。这通过单独读取散装混合物的荧光来测定。然后从在各孔进行的所有其它反应中减去这一值以便在各孔之间进行比较。
12.5.结果检测SubBi-1-FB报告底物的酶切 部件酶A和B的设计的各种组合都能够被组装成活性MNAzyme。这些MNAzyme仅在靶序列的存在下酶切报告底物,如荧光增加所证明的那样。在本实施例中,已经用形成发夹的序列将部件酶的感应臂延长。含有具有发夹的一种部件酶(部件酶A或部件酶B)的反应,或两种部件酶(A和B)都含发夹的反应给出与使用没有发夹的部件酶时可见的相似的荧光信号。在没有靶的任一对照反应中没有观察到信号增加。
含有发夹的部件酶的设计提供适合于检测短序列如微小RNA的策略。在本实验中检测的DNA寡核苷酸仅为22个碱基。使用了含发夹或不含发夹的部件酶检测该序列。该发夹设计提供更稳定的结构并在已知与MNAzyme组装和催化活性相适宜的部件酶的设计中进一步提供灵活性。
实施例13使用MNAzyme通过实时RTPCR同时定量四种核酸序列 13.1.用于四重RTPCR分析的部件酶寡核苷酸 使用体外靶扩增方法如RTPCR能够同时实时扩增多种靶。此外,靶的扩增能够在包含多种独特MNAzyme的一复合反应中同时实时监测。每一种MNAzyme具有对一种靶具有特异性的感应臂,和对一系列通用底物的独特成员具有特异性的底物臂,每一所述底物用不同的荧光基团标记(图18),在本实施例中,MNAzyme被设计用来检测四种不同靶,即人BCR、RPLPO、β-肌动蛋白和HPRT转录本。应当理解,根据本方法能够使用任何数目的靶。每一种靶的部件酶A和B序列从5’到3’如下所示。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO51部件酶A4 BaA4/2-P
ACAACGA
SEQ ID NO52部件酶B5 BaB5/2-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO29部件酶A4 RO5A4/3-P
ACAACGA
SEQ ID NO30部件酶B5 RO5B5/3-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO55部件酶A4 BCRA4/6-P
ACAACGA
SEQ ID NO56部件酶B5BCRB5/6-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO57部件酶A4 HPRTA4/7-P
ACAACGA
SEQ ID NO58部件酶B5 HPRTB5/7-P
GGCTAGCT
13.2.报告底物 对于本实施例,使用四种不同的报告底物,每一种用不同的荧光基团标记。底物的序列从5’到3’如下书写。在当前实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-JOE部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-JB。以535nm激发在555nm下监测SubBi-2-JB的酶切。对于SubBi-3在5’端用Quasar 670部分进行末端标记,在3’端用BHQ2部分进行末端标记,并命名为SubBi-3-Q6B2。以635nm激发在665nm下监测SubBi-3-Q6B2的酶切。对于SubBi-6在5’端用德克萨斯红(Texas Red)部分进行末端标记,在3’端用BHQ2部分进行末端标记,并命名为SubBi-6-TRB2。以585nm激发在610nm下监测SubBi-6-TRB2的酶切。对于第四底物SubBi-7在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-7-FB。以492nm激发在516nm下监测SubBi-7-FB的酶切。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO59 SubBi-2-JB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA SEQ ID NO60 SubBi-3-Q6B2 CAGCACAACCguCACCAACCG SEQ ID NO61 SubBi-6-TRB2 ATCACGCCTCguTCCTCCCAG SEQ ID NO62 SubBi-7-FB TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA 13.3.用于扩增四种扩增子的靶序列和PCR引物 将从K562白血病细胞提取的人类总RNA用作所有四种靶转录本的体外扩增的模板。扩增子通过使用下列寡核苷酸PCR引物的RTPCR产生。
SEQ ID NO325’引物5RO5/1 CATTCTATCATCAACGGGTA SEQ ID NO33 3’引物3RO5/1 CAAAGGCAGATGGATCAG SEQ ID NO63 5’引物5B肌动蛋白 CATTGCCGACAGGATGCAGA SEQ ID NO64 3’引物3B肌动蛋白 GAGCCGCCGATCCACACG SEQ ID NO655’引物5BCR14 CACTCAGCCACTGGATTTAA SEQ ID NO66 3’引物3BCR15/6 GCGCGTCTTTGCTTTATTC SEQ ID NO67 5’引物5HPRT/5 CTTTGCTGACCTGCTGGATTA SEQ ID NO68 3’引物3HPRT/8 CCTGTTGACTGGTCATTACAA 13.4.反应组分靶序列的扩增和定量 靶序列的实时扩增和定量以25μL的总反应体积进行。所有的反应在Mx3005PTM QPCR系统(Stratagene)上进行。循环参数是50℃30分钟、95℃7分钟、95℃15秒钟和65℃(每一循环温度降低1℃)30秒钟的10个循环、最后95℃15秒钟和54℃30秒钟的40个循环。反应含有40nM每一5’引物和200nM每一3’引物、200nM每一A部件酶和200nM每一B部件酶、200nM每一底物、10mM MgCl2、200μM的每一dNTP、10单位Rnasin(Promega)、20单位M-MLV RT(H-)、1x Immobuffer(Bioline)、1.5单位Immolase(Bioline),以及总RNA模板(100ng、20ng、4ng、800pg、160pg或32pg)或无靶(dH2O)。
表14用于同时检测四种不同核酸靶的反应组分。
13.5.结果四种不同靶序列的同时扩增以及通过酶切四种不同报告底物的检测 用来实时检测和定量β-肌动蛋白、RPLPO、BCR和HPRT转录本的四种MNAzyme表明,当所用的靶序列是通过RTPCR扩增的人类总RNA时荧光随时间增加(表15)。所有四个反应中无RNA靶对照的荧光低于含RNA靶反应中的荧光并且在反应期间不增加(表15)。这表明含靶反应中产生的荧光增加是由于随后酶切报告底物的催化活性MNAzyme的靶依赖性组装。
通过将RNA浓度的对数对循环阈值作图,生成所有四种靶的标准曲线,得到线性图。每一标准的阈值(Ct)如表15所示。表中所示的Ct值是两份反应结果的平均值。每一靶的相关系数(R2)、斜率和反应效率也如表15所示。
表15同时扩增和检测四种不同核酸靶的反应结果
本实施例中的MNAzyme RTPCR反应允许在包括四种通用底物的单一复合反应中同时检测四种靶,并生成用于定量这四种靶的标准曲线。这些通用底物适合于在单一反应中监测四种靶的其它组合。
实施例14使用MNAzyme在实时复合RTPCR中同时定量五种核酸序列 14.1.用于五重RTPCR分析的部件酶寡核苷酸 使用体外靶扩增方法如RTPCR能够同时实时扩增多种靶。此外,靶的扩增能够在一包含多种独特MNAzyme的复合反应中同时实时监测。每一MNAzyme具有对一种靶具有特异性的感应臂,和对一系列通用底物的独特成员具有特异性的底物臂,每一所述底物用不同的荧光基团标记(图18)。在本实施例中,MNAzyme被设计用来检测五种不同靶,即BCR、RPLPO外显子4、β-肌动蛋白、RPLPO外显子5和HPRT mRNA序列。应当理解,根据本方法能够使用任何数目的靶。部件酶A和B的序列从5’到3’如下所示。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO69部件酶A4 BaA4/7-P
ACAACGA
SEQ ID NO70部件酶B5 BaB5/7-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO71部件酶A4 RO5A4/4-P
ACAACGA
SEQ ID NO72部件酶B5 RO5B5/4-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO55部件酶A4 BCRA4/6-P
ACAACGA
SEQ ID NO56部件酶B5 BCRB5/6-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO75部件酶A4 HPRTA4/2-P
ACAACGA
SEQ ID NO76部件酶B5 HPRTB5/2-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO77部件酶A4 RO4A4/3-P
ACAACGA
SEQ ID NO78部件酶B5 RO4B5/3-P
GGCTAGCT
14.2.报告底物 对于本实施例,使用五种不同的报告底物,每一种用五种不同的荧光基团中的一种标记。底物的序列从5’到3’书写。在当前实施例中,对于SubBi-2在5’端用Alexa 350部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-A350B。以350nm激发在440nm下监测SubBi-2-A350B的酶切。对于SubBi-3在5’端用Quasar 670部分进行末端标记,在3’端用BHQ2部分进行末端标记,并命名为SubBi-3-Q6B2。以635nm激发在665nm下监测SubBi-3-Q6B2的酶切。对于SubBi-6在5’端用德克萨斯红部分进行末端标记,在3’端用BHQ2部分进行末端标记,并命名为SubBi-6-TRB2。以585nm激发在610nm下监测SubBi-6-TRB2的酶切。对于SubBi-7在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-7-FB。以492nm激发在516nm下监测SubBi-7-FB的酶切。对于SubBi-4在5’端用6-JOE部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-4-JB。以535nm激发在555nm下监测SubBi-4-JB的酶切。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO79 SubBi-2-A350B AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA SEQ ID NO60 SubBi-3-Q6B2 CAGCACAACCguCACCAACCG SEQ ID NO61 SubBi-6-TRB2 ATCACGCCTCguTCCTCCCAG SEQ ID NO62 SubBi-7-FB TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA SEQ ID NO83 SubBi-4-JB CATGGCGCACguTGGGAGAAGTA 14.3.用于扩增五种mRNA靶序列的靶序列和PCR引物 将从K562细胞提取的人类总RNA用作所有五种靶体外扩增的模板。扩增子通过使用下列寡核苷酸PCR引物体外扩增而产生。
SEQ ID NO32 5’引物5RO5/1 CATTCTATCATCAACGGGTA SEQ ID NO33 3’引物3RO5/1 CAAAGGCAGATGGATCAG SEQ ID NO63 5’引物5B肌动蛋白 CATTGCCGACAGGATGCAGA SEQ ID NO64 3’引物3B肌动蛋白 GAGCCGCCGATCCACACG SEQ ID NO65 5’引物5BCR14 CACTCAGCCACTGGATTTAA SEQ ID NO66 3’引物3BCR15/6 GCGCGTCTTTGCTTTATTC SEQ ID NO67 5’引物5HPRT/5 CTTTGCTGACCTGCTGGATTA SEQ ID NO68 3’引物3HPRT/8 CCTGTTGACTGGTCATTACAA SEQ ID NO84 5’引物5R04/3 CAAGACTGGAGACAAAGTG SEQ ID NO85 3’引物3R04/2 GCAGAGTTTCCTCTGTGATA 14.4.反应组分靶序列的扩增和定量 靶序列的实时扩增和定量以25μL的总反应体积进行。所有的反应在Mx3005PTM QPCR系统(Stratagene)上进行。循环 参数是50℃30分钟、95℃7分钟、95℃15秒钟和65℃(每一循环温度降低1℃)30秒钟的10个循环、最后95℃15秒钟和54℃30秒钟的40个循环。反应含有40nM 5B肌动蛋白、5BCR14、5HPRT/5,和80nM 5RO4/3、5RO5/1,和200nM 3B肌动蛋白、3BCR15/6、3HPRT/8,和400nM 3RO4/2和3RO5/1。对于β肌动蛋白、BCR、RPLPO外显子4和HPRT有200nM的每一A部件酶和B部件酶。对于RPLPO外显子5有400nM的每一A部件酶和B部件酶。有200nM的SubBi-2-A350B、SubBi-3-Q6B2、SubBi-6-TRB2和SubBi-7-FB,以及400nM的SubBi-4-JB。还有10mM MgCl2、200μM的每一dNTP、10单位Rnasin(Promega)、20单位M-MLV RT(H-)(Promega)、1xImmobuffer(Bioline)、2单位Immolase(Bioline),以及5μLRNA模板(100ng、20ng、4ng、800pg或160pg)或无靶(dH2O)。
表16用于同时检测五种不同核酸靶的反应组分
14.5.结果五种不同靶序列的同时扩增以及通过酶切五种不同报告底物的检测 用来实时检测和定量具有RPLPO外显子4、BCR、β-肌动蛋白、RPLPO外显子5和HPRT的RNA序列的五种MNAzyme表明,当所用的靶序列是通过RTPCR扩增的人类总RNA时荧光随时间增加(表17)。所有五个反应中无RNA靶对照的荧光低于含RNA靶反应中的荧光并且在反应期间不增加(表17)。这表明含靶反应中产生的荧光增加是由于随后酶切报告底物的催化活性MNAzyme的靶依赖性组装。
通过以RNA浓度的对数对循环阈值作图,生成所有五种靶的标准曲线,得到线性图。每一标准的阈值(Ct)如表17所示。Ct值是两份反应结果的平均值。每一靶的相关系数(R2)、斜率和反应效率也如表17所示。
表17同时扩增和检测五种不同核酸靶的反应结果
本实施例中的MNAzyme RTPCR反应允许在包括五种通用底物的单一复合反应中同时检测五种靶,并生成用于定量这五种靶的标准曲线。这些通用底物适合于在单一反应中监测五种靶的其它组合。
实施例15使用MNAzyme定量细菌中核糖体16S 为了取代革兰氏染色(Gram stain)的细菌测试,MNAzyme能够基于在细菌种类中发现的保守核酸序列用来进行无菌和/或支原体污染的快速释放测试。使用体外靶扩增方法如RTPCR,MNAzyme能够用来实时监测靶细菌核酸的扩增。在本实施例中,使用在细菌核糖体16S序列中发现的保守区域,其中逆转录、PCR扩增和MNAzyme介导的检测在一管中同时发生。
设计了一种靶向某些细菌种类共有的核糖体16S序列的区域的系统,这些细菌种类包括头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、洛菲不动杆菌(Acinetobacter woffii)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
15.1.部件酶寡核苷酸 部件酶寡核苷酸A和B使用设计7,所述设计7具有与细菌种类之间的保守区域互补的感应臂。部件酶寡核苷酸如下所示,其中“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO86部件酶A5 16S1A5/2-P
TACAACGA
SEQ ID NO87部件酶B6 16S1B6/2-P
GGCTAGC
15.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-2,其序列从5’到3’如下所示。在当前实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-FB。以492nm(FAM激发波长)激发在516nm(FAM发射波长)下监测SubBi-2-FB的酶切。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO21 SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 15.3.用于扩增细菌核糖体16S的PCR引物 本实施例的靶序列使用下列寡核苷酸PCR引物通过体外扩增枯草芽孢杆菌而产生。
SEQ ID NO88 5’引物516S1-1 TGGTGCATGGTTGTCGTC SEQ ID NO89 3’引物316S1-1 TTGCGCTCGTTGCGGGA 15.4.靶序列和对照 从枯草芽孢杆菌细胞提取细菌核糖体RNA并将其用作扩增16S区域的模板。无核酸酶的dH2O取代RNA用作无靶对照。
15.5.反应组分靶序列的扩增和定量 靶序列的实时扩增和定量以25μL的总反应体积进行。所有的反应在Mx3005p QPCR系统(Stratagene)上进行。循环参数是50℃30分钟、95℃7分钟、95℃15秒钟和65℃(每一循环温度降低1℃)30秒钟的10个循环和最后95℃5秒钟和55℃30秒钟的40个循环。反应含有40nM 516S1-1和200nM的316S1-1、200nM 16S1A5/2-P和200nM 16S1B6/2-P、200nM SubBi-2-FB、7.5mM MgCl2、200μM的每一dNTP,10单位Rnasin(Promega)、1x Immobuffer(Bioline)、1单位的Immolase(Bioline),以及RNA模板(500ng、50ng、5ng或500pg)或无靶(dH2O)。
15.6.结果靶的扩增和SubBi-2-FB报告底物的酶切 用于实时检测和定量细菌核糖体16S的MNAzyme表明,当所用的靶序列是通过RTPCR扩增的细菌RNA时,荧光随时间增加。无模板对照的荧光低于含RNA反应中的荧光并且在反应期间不增加。这表明含靶反应中产生的荧光增加是由于随后酶切报告底物的催化活性MNAzyme的靶依赖性组装。通过以RNA浓度的对数对循环阈值作图生成标准曲线,得到相关系数为0.992的线性图。
表18扩增和检测细菌核糖体16S扩增子的反应结果
本实施例证实MNAzyme检测和定量通过RTPCR扩增细菌核糖体16S RNA产生的扩增子的能力。本实施例使用的MNAzyme靶向细菌16S的区域,所述区域下述细菌种类之间100%保守头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、洛菲不动杆菌(Acinetobacter woffi)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。这样,单一MNAzyme和报告底物可以用来筛选存在任一种上述细菌的样品。信号(例如FAM)的检测可以提示样品中存在一种或多种这些细菌种类。
实施例16通过单管RT-PCR使用MNAzyme检测和定量病毒RNA 使用体外靶扩增方法如RTPCR,MNAzyme能够用来实时监测靶核酸的扩增。此外,实时检测允许定量反应中最初存在的靶的量。本实施例例示使用MNAzyme检测和定量HIV病毒RNA。逆转录、PCR扩增和MNAzyme检测在单管反应中进行。
16.1.部件酶寡核苷酸 将部件酶设计成以特异性靶向HIV-1的Nef基因。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO90部件酶A4 NefA4/6-P
ACAACGA
SEQ ID NO91部件酶B5 NefB5/6-P
GGCTAGCT
16.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-6,其序列从5’到3’如下所示。在当前实施例中,对于SubBi-6在5’端用德克萨斯红部分进行末端标记,在3’端用BHQ2部分进行末端标记,并命名为SubBi-6-TRB2。以585nm(德克萨斯红激发波长)激发在610nm(德克萨斯红发射波长)下监测SubBi-6-TRB2的酶切。在如下序列中,小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO61 SubBi-6-TRB2 ATCACGCCTCguTCCTCCCAG 16.3.靶序列 本实施例中的标准曲线通过RTPCR扩增HIV-1病毒RNA产生。使用QIAGEN Ultrasens病毒试剂盒HIV-1从采集自感染HIV-1的人CEMT4细胞的介质中分离病毒RNA。使用无核酸酶(NF)的水替代病毒RNA,作为无靶对照。
16.4.用于扩增HIV-1Nef转录本的PCR引物 使用如下的引物扩增HIV-1Nef转录本。使用3’引物Nef/3PCR逆转录,然后该引物和5’引物Nef/5PCR促进PCR扩增。
SEQ ID NO92引物Nef/3PCR CAGGGTCATCCATTCCATGCAG SEQ ID NO93引物Nef/5PCR GCTAGTACCAGTTGAGCCAG 16.5.反应组分靶序列的扩增和定量 靶序列的实时扩增和定量以25μL的总反应体积进行。所有的反应在Mx3005p QPCR系统(Stratagene)上进行。循环参数是50℃30分钟、95℃7分钟、95℃15秒钟和65℃(每一循环温度降低1℃)30秒钟的10个循环和最后95℃15秒钟和55℃30秒钟的50个循环。反应含有200nM的3’引物Nef/3PCR和40nM的5’引物Nef/5PCR、200nM的部件酶NefA4/6-P和200nM的部件酶NefB5/6-P、200nMSubBi-6-TRB2、10mM MgCl2、200μM的每一dNTP、10单位Rnasin(Promega)、1x Immobuffer(Bioline)、0.5单位的Immolase(Bioline)、10单位MMLV RT(H-),以及5μL的总RNA模板(含45,000pg、4,500pg、450pg、45pg、4.5pg或0.45pg)或无靶(仅H2O)。
16.6.结果靶的扩增和SubBi-6-TRB2报告底物的酶切 实时检测和定量HIV-1Nef转录本的MNAzyme表明,当所用的靶序列是通过RTPCR扩增的HIV-1病毒RNA时,荧光随时间增加。无靶(仅H2O)对照反应的信号没有增加。这表明含靶反应中产生的荧光增加是由于随后酶切报告底物的催化活性MNAzyme的靶依赖性组装。
通过以每一反应中RNA模板量的对数对循环阈值(Ct)作图生成标准曲线,得到线性图。每一标准的Ct,以及相关系数(R2)、斜率和反应效率如表19所示。
表19扩增和检测HIVNef转录本的结果
本实施例证实了MNAzyme用于检测和定量病毒序列包括HIV-1的能力。
实施例17MNAzyme催化活性的的序列要求 17.1.部件酶寡核苷酸 原先发现的10:23DNA酶的催化核包含15个核苷酸(Santoro&Joyce,1997)。对催化核中关键碱基后来的研究表明,某些特定碱基取代显著降低催化活性,而其它的取代耐受性很好(Zaborowska et al.)。
在本实施例中,设计并检测一系列部件酶以研究MNAzyme催化核对两种部件酶的部分核中序列变异的耐受性。用于检测人类RPLPO基因的MNAzyme的未修饰的部件酶A和B用作对照,并与各种变异的部件酶序列比较,所述变异的部件酶序列中在部分催化核区域进行单个碱基取代。用来检测靶的部件酶寡核苷酸基于设计7(见实施例20),从5’到3’如下所示。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,使加下划线的、斜体或黑体碱基与对照(未变异)的部分核序列相比发生变异,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。
SEQ ID NO94部件酶A5 RO4A5/2
TACAACGA
SEQ ID NO95部件酶A5 RO4A5/2-G14A
TACAAC
SEQ ID NO96部件酶A5 RO4A5/2-A9T
SEQ ID NO97部件酶A5 RO4A5/2-A12T
SEQ ID NO98部件酶A5 RO4A5/2-A11T
SEQ ID NO99部件酶B6 RO4B6/2
GGCTAGC
SEQ ID NO100部件酶B6 RO4B6/2-C7A
GGCTAG
SEQ ID NO101部件酶B6 RO4B6/2-T4C
GGC
AGC
17.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-2,其序列从5’到3’如下所示。在当前的实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-FB。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-2-FB的酶切。在如下序列中,小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO21 SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 17.3.靶序列 在本实验中将合成DNA寡核苷酸用作靶模板,所述靶的序列从5’到3’如下所示。
SEQ ID NO102 RO4/2靶 ATGCTGCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGCCCAA 17.4.反应条件 各种部件酶对的催化活性分析用SmartCycler系统热循环仪(Cepheid)进行。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是25μL。每一反应含有1x PCR Buffer II(Applied Biosystems)、10mM MgCl2、0.2μM的SubBi-2FB、2μM的RO4/2靶,以及一对A和B部件酶(每一为2μM)。每一反应中的部件酶对如下表20所示。
表20用于检测核酸靶的反应组分 反应在54℃温育20分钟,以12秒钟的间隔收集荧光数据。由于在SmartCycler系统热循环仪上各孔的初始荧光可能不同,从每一反应在每一时间点的荧光中减去初始荧光值以便比较不同孔中的反应。然后将含变异部件酶A或变异部件酶B的复制反应的平均值表示为对照复制荧光的百分数。
17.5.结果SubBi-2FB报告底物酶切的检测 通过荧光随时间的变化测量各种部件酶对对底物的酶切。然后将每一反应的正常化荧光值表示为在相同时间点在对照反应中观察到的荧光的百分数(表21)。
表21各种部件酶序列变异体的酶切活性(*本实施例)以及与变异10:23DNA酶(**Zaborowska)活性的比较。
本试验表明,部件酶A或B的部分催化核中的各种取代与活性MNAzyme的形成相适宜。相比之下,其它取代耐受性不好并产生催化活性很小或无催化活性的结构。当把使用MNAzyme所得结果与报道的10:23DNA酶催化核中等同取代的结果相比较时(Zaborowska etal.),观察到了上述类似的模式(表21)。例如,在部件酶A中或10:23核中位置14处用G取代A(G14A)导致大于90%的酶切活性丧失。相比之下,在部件酶A中或10:23核中位置12处用A取代T(A12T)导致分子的酶切活性与对照序列相比保留大约80%。
这样,当将相同序列变异引入一种部件酶时,关于其它序列取代的文献中的信息可以预测期望的催化活性,所述序列取代与DNA酶活性相适宜(例如10:23DNA酶或8:17DNA酶)。此外,本领域技术人员可以用经验测试来鉴定另外的部件酶部分催化核序列变异,所述变异与活性MNAzyme形成相适宜。
实施例18MNAzyme用于检测包括诸如5’-三磷酸腺苷的小分子的靶 适体是这样的单链DNA或RNA分子,即因以高度亲和力和特异性结合靶的能力而从大量随机序列的寡核苷酸体外离析而来的单链DNA或RNA分子。已经选择能与多种靶特异性结合的适体,所述靶包括蛋白、糖类、脂质、核苷酸、完整细胞和病毒。在本实施例中,将适体序列引入具有使得活性MNAzyme仅在靶的存在下才能形成的构型的部件酶的末端(适体-部件酶)。有多种方式实现这一目标,包括图4概述的策略和图20中例示的如下实施例中使用的策略。
图20中例示的MNAzyme检测策略需要的核酸寡核苷酸包括;标准部件酶; a)适体-部件酶,是将适体引入其一个末端的部件酶; b)组装易化子,是与能够组装成活性MNAzyme的适体-部件酶和部件酶都结合的寡核苷酸; c)报告底物;和 d)抑制因子寡核苷酸,其在跨越至少部分适体序列和部件酶序列的部分底物结合臂的区域与适体-部件酶杂交。
在没有与适体结合的靶(图20左手插图)时,抑制因子寡核苷酸与适体-部件酶结合从而阻止报告探针底物的结合(与酶切)。在存在与适体结合的靶(图20右手插图)时,该靶与适体-部件酶的适体序列结合,阻止抑制因子寡核苷酸的结合并允许报告探针底物的结合与酶切。这样,MNAzyme仅在靶的存在下形成并引起荧光信号的产生。
该策略使用检测小分子ATP来证实。本实施例使用的27个核苷酸长度的适体序列先前已报道为能够与ATP和dATP高度特异地结合(Achenbach,2005;Huizenga and Szostak,1995)。
18.1.部件酶寡核苷酸、组装和抑制性寡核苷酸 在本实施例中,将ATP适体序列置于邻近适体-部件酶A的底物臂(图20)。将适体-部件酶A和部件酶B的感应臂设计成与组装易化子结合。适体-部件酶AtpA2/1和部件酶Atp B3/1(图21)的序列如下所示(5’到3’)。在如下序列中,黑体碱基与组装易化子杂交,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,斜体碱基与底物杂交。此外,部件酶AtpA2/1中普通文本的碱基表示与ATP或dATP结合的DNA适体序列。
SEQ ID NO103适体-部件酶A2 AtpA2/1
CGGTCGAA
ACCTGGGGGAGTAT TGCGGAGGAAGGT SEQ ID NO104部件酶B3 AtpB3/1
CCGAGC
组装易化子的序列如下所示(5’到3’) SEQ ID NO105组装易化子AtpC/1 GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT 抑制因子寡核苷酸的序列如下所示(5’到3’) SEQ ID NO106抑制因子AtpR/1 CCAGGTACTCACTATTT 18.2.报告底物 通过酶切双重标记的核酸报告底物监测MNAzyme活性。本实施例的报告底物是SubBi-1-FB,其序列从5’到3’如下所示。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。加下划线的碱基表示5’端的6-FAM部分和3’端的BHQ1部分的位置。以490nm(FAM激发波长)激发在520nm(FAM发射波长)下监测在FAM和BHQ1之间的核苷酸处酶切SubBi-1-FB所引起的荧光改变。
SEQ ID NO6SubBi-1-FB ACTCACTATaGGAAGAGATG 18.3.靶 本实施例的靶分子是5’-三磷酸腺苷(ATP)和5’-三磷酸脱氧腺苷(dATP)。5’-三磷酸鸟苷(GTP)和5’-三磷酸胞苷(CTP)用作阴性对照。所有分子购自Bioline。无核酸酶的水用作无靶对照。
18.4.反应条件 靶的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是50μL。在底物注射之前,所有的反应在60℃预温育5分钟(以减少二级结构)。反应在FLUOstar OPTIMA(BMG Biotech)上在47℃下进行。每3秒钟读取每一反应的荧光,总共读10分钟。每一反应含有如下终浓度的物质200nM AtpA2/1、200nM AtpB3/1、200nM AtpC/1、200nM AtpR/1、200nM SubBi-1-FB、25mM MgCl2、50mM Tris HCl pH 7.5,以及2mM的ATP、dATP、GTP、CTP或无靶(水)。
18.5.SubBi-1-FB报告底物的检测与酶切 在没有ATP或dATP时,观察到不随时间增加的低水平荧光,表明抑制因子寡核苷酸能够阻止活性MNAzyme的组装(图21)。在存在ATP或dATP时,荧光信号较高而且随时间增加。这表明dATP和ATP取代了抑制因子寡核苷酸并且活性MNAzyme形成。由于在GTP和CTP存在时的荧光信号与没有ATP或dATP时即在无分析物的水对照中的荧光信号相同,MNAzyme的组装具有靶依赖性。本实施例表明MNAzyme能够以对靶具有高度特异性的方式与用于检测靶的适体结合,所述靶包括核酸和非核酸靶。
本领域技术人员应当认识到该策略的设计能够灵活进行。能够将适体引入含有部分催化核序列的两种部件酶的任一者的任意一端(5’或3’)。这样,抑制因子寡核苷酸能够与适体区域以及底物臂(结合报告底物)或感应臂(结合组装易化子)相结合。在前一设计(图20;本实施例)中,抑制因子阻止报告底物的结合。在后一设计中,抑制因子会阻止组装易化子与部件酶结合从而阻止活性MNAzyme形成。
文献中含有能够检测多种靶的大量适体的序列。这些序列包括蛋白、糖类、脂质、朊病毒、核苷酸、完整细胞和病毒。所有这些种类的靶的适体都可以连接到部件酶上以检测大范围的各种分子。与靶结合适体(或适体-部件酶)和MNAzyme酶切报告底物都相适宜的反应条件(缓冲液、温度、二价阳离子浓度等)能够通过经验测试确定。此外,由于适体是在研究者选择的反应条件下体外离析得到,有可能调整分子离析以允许对任何想得到的靶开发适体,所述靶会在与MNAzyme酶切相适宜的条件下结合。由于MNAzyme在非常宽广的条件范围内都有活性,本领域技术人员可以轻易确定与MNAzyme酶切相适宜的条件。
实施例19使用MNAzyme检测单个碱基错配 使用体外靶扩增方法如PCR,MNAzyme能够用来实时检测和定量靶核酸。通过例如检测核酸序列的改变,MNAzyme也能够用来产生定量结果。通过感应臂和靶序列的Watson-Crick碱基识别,能够进行MNAzyme介导的靶检测。在本实施例中,通过采用部件酶感应臂和靶核酸序列的该互补性要求,MNAzyme被用来检测单个碱基错配。
19.1.部件酶寡核苷酸 将部件酶寡核苷酸设计成使之要么与靶序列完全互补,要么相对于靶序列有错配(图22(i))。完全匹配的部件酶A(RO5A5/2(22)-P)、完全匹配的部件酶B(RO5B6/2(11G)-P)和错配的部件酶B(RO5B6/2(11C)-P)的序列如下所示(5’到3’)。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。部件酶RO5B6/2(11C)-P的错配碱基为黑体并加了下划线。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO107部件酶A5 RO5A5/2(22)-P
TACAACGA
SEQ ID NO108部件酶B6 RO5B6/2(11G)-P
GGCTAGC
SEQ ID NO109部件酶B6 RO5B6/2(11C)-P
GGCTAGC
19.2.报告底物 本实施例中使用的报告底物是SubBi-2。在当前的实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-FB。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-2-FB的酶切。SubBi-2-FB的序列如下所示(从5’到3’);小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO21 SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 19.3.用于扩增RPLPO外显子5的PCR引物 本实施例的靶序列通过使用下列寡核苷酸PCR引物(从5’到3’)体外扩增人类基因组DNA产生。
SEQ ID NO32引物5RO5/1 CATTCTATCATCAACGGGTA SEQ ID NO110引物3RO5/2 AGCAGCCACAAAGGCAGA 19.4.靶序列和对照 从人K562细胞系提取的人类基因组DNA用作扩增RPLPO基因的模板。无核酸酶(NF)的水替代基因组DNA用作无靶对照。
19.5.反应组分靶序列的扩增和检测 靶序列的实时扩增和检测以25μL的总反应体积进行。所有的反应在ABI 7700热循环仪(Applied Biosystems)上进行。循环参数是95℃7分钟、95℃15秒钟和65℃(每一循环温度降低1℃)30秒钟的10个循环、最后95℃15秒钟和47℃30秒钟的50个循环。反应含有40nM5RO5/1、200nM的3RO5/2、200nM RO5A5/2(22)-P和200nMRO5B6/2(11G)-P或200nM RO5B6/2(11C)-P、200nM SubBi-2-FB、10mM MgCl2、200μM每一dNTP、10单位Rnasin(Promega)、1x ROXreference(Invitrogen),1x Immobuffer(Bioline)、1单位每一Immolase(Bioline),以及100ng基因组DNA模板或NF水。
19.6.结果使用MNAzyme检测单一碱基错配 包含完全匹配的感应臂B的MNAzyme表明,当所用的靶序列是通过PCR扩增的人类基因组DNA时,荧光随时间增加(图22(ii))。相比之下,含错配的感应臂B的MNAzyme显示基因组靶的低水平荧光,与在无靶对照中看到的相似,而且荧光不随时间增加。因此,离部件酶A和B接合点三个碱基处的单个碱基错配足够阻止活性MNAzyme的形成。
本实施例表明MNAzyme能够用于检测靶和感应臂之间的单个碱基错配。由于MNAzyme能够检测小到单个碱基改变的变化,MNAzyme也能够用于区分由小的删除或小的插入引起的序列差异对本领域技术人员而言是显而易见的。此外,也能够检测较大的变化,如与引起融合转录的各种癌症相关的易位。这些变化经常与白血病相关,例如PML/RARα融合转录与急性早幼粒细胞白血病相关,bcr/abl融合转录与慢性粒细胞白血病相关。
虽然本实施例表明单个碱基错配能够足以阻止活性MNAzyme的组装,但是另外的实验表明并非所有单个碱基错配在所有条件下都能完全阻碍MNAzyme的组装。区分单个碱基错配的能力取决于多个因素,包括a)反应条件的严紧性,所述严紧性能够受到多种因素包括温度、盐浓度、阳离子浓度的影响,b)错配类型,例如G/T错配对C/C错配,c)部件酶臂中错配的位置,和d)部件酶臂的长度。
能够使用另外的策略增加MNAzyme检测单个碱基多态性的能力。这些策略包括,例如使用如实施例22所示的截短的部件酶感应臂。
实施例20从含有源自10:23催化核的变异部分催化核序列的一系列部件酶对中测试MNAzyme的活性 能够制备从各种体外离析的DNA酶纳入部分序列的多组分核酸酶(MNAzyme)。已经例示了基于来自8:17和10:23DNA酶的部分序列的活性MNAzyme。此外,已经表明,基于8:17和10:23DNA酶的多个可选的部件酶设计要么有活性(实施例1、3,图9、10、13),要么缺乏活性(实施例1,图8)。本实施例进一步扩展这些研究并鉴定基于来自10:23DNA酶的部分催化核序列的有活性和无活性的部件酶序列。此外,本实施例为鉴定最佳位置以酶切催化核序列使得当将部分催化核序列纳入部件酶时生成功能活性MNAzyme所需的步骤提供了一般方法。
20.1.部件酶寡核苷酸 本实施例的方法用来研究10:23催化核序列中哪些位置适合于酶切成部分催化核序列,当所述部分催化核序列纳入部件酶时,得到功能活性MNAzyme。在多个位点酶切10:23序列,然后将这两个部分序列纳入被设计用来在靶(人类RPLPO基因)的存在下酶切底物的一系列部件酶对中。被测试的每一部件酶对的部分催化核参考10:23DNA酶的完整催化核序列如表22所示(Santoro and Joyce,1997)。
表2210:23DNA酶和一系列变异的部件酶对中的碱基和位置,其中在核中1-15的位置的碱基在两个部件酶A和B之间不同地分布。
所有的序列从5’到3’书写。MNAzyme设计和部件酶命名自表3中的系列延续并在本表中扩展以鉴定核中的酶切位置。例如,设计6是具有部件酶A4和部件酶B5设计(A4:B5)的10:23衍生MNAzyme,其中该核已在位置8的T和位置9的A(T8-A9)之间被酶切。
在本实验中,部件酶对的系列都是合成的,其中感应臂被设计用来与人类RPLPO基因的外显子5杂交,并且底物臂针对底物SubBi-2。本实验中使用的部件酶对通过Sigma-Proligo合成,其序列如下所示(从5’到3’)。加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与核酸靶杂交,斜体碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
RPLPO部件酶对A4:B5 SEQ ID NO147 RO5A4/2-P
ACAACGA
SEQ ID NO112RO5B5(16)/2-P
GGCTAGCT
RPLPO部件酶对A5:B6 SEQ ID NO107RO5A5/2(22)-P
TACAACGA
SEQ ID NO114RO5B6(16)/2-P
GGCTAGC
RPLPO部件酶对A6:B7 SEQ ID NO115RO5A6(22)/2-P
ACGA
SEQ ID NO116RO5B7(16)/2-P
GGCTAGCTACA
RPLPO部件酶对A7:B 8 SEQ ID NO117RO5A7(22)/2-P
CAACGA
SEQ ID NO118RO5B8(16)/2-P
GGCTAGCTA
RPLPO部件酶对A8:B9 SEQ ID NO119RO5A8(22)/2-P
CTACAACGA
SEQ ID NO120RO5B9(16)/2-P
GGCTAG
RPLPO部件酶对A9:B10 SEQ ID NO121RO5A9(22)/2-P
GCTACAACGA
SEQ ID NO122RO5B10(16)/2-P
GGCTA
20.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-2,其序列从5’到3’如下所示。在当前的实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-FB。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-2-FB的酶切。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO21 SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 20.3.用于扩增人类RPLPO基因的外显子5的PCR引物。
引物的序列从5’到3’如下所示。
SEQ ID NO123 5’引物5RO5/2 GCTACCCAACTGTTGCATC SEQ ID NO110 3’引物3RO5/2 AGCAGCCACAAAGGCAGA 20.4.靶模板 从K562细胞中提取的人类基因组DNA用作PCR扩增的模板。
20.5.反应条件 靶序列的实时扩增和部件酶对的催化活性检测在25μL的反应中在ABI 7700热循环仪(Applied Biosystems)上进行。循环参数是95℃7分钟、95℃15秒钟和65℃(每一循环温度降低1℃)30秒钟的10个循环、最后95℃15秒钟和50℃30秒钟的50个循环。每一反应含有0.04μM 5RO5/1和0.2μM的3RO5/2、10mM MgCl2、50μM每一dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、1x Immobuffer(Bioline)、0.2μMSubBi-2-FB、1x Rox参考染料(Invitrogen)、10单位的Rnasin(Progema)和1单位的Immolase聚合酶(Bioline)和100ng的基因组DNA。另外,每一反应含有具有0.2μM的部件酶A和0.2μM的部件酶B的部件酶对(RPLPO部件酶对A4:B5或A5:B6或A6:B7或A7:B8或A8:B9或A9:B10)。
20.6.结果 使用实时MNAzyme-PCR方法,从六个RPLPO部件酶对的三个检测催化活性。部件酶对A4:B5和A5:B6显示高水平的催化活性水平,允许≤22个循环的靶的检测(表23)。A7:B8部件酶对也有活性,但活性比A4:B5和A5:B6低。在本实验的条件下没有从部件酶对A6:B7、A8:B9或A9:B10检测到催化活性。
表23使用各种部件酶对获得的循环阈值(Ct) 当将阈值荧光水平设定为0.2并且在循环1和14之间减去基线背景荧光时,Ct值是三份反应的平均值。
实施例21应用MNAzyme检测蛋白靶 如实施例18所示,通过将适体序列纳入到部件酶的末端(适体-部件酶),MNAzyme能够用来检测靶。在本实施例中,使用已被报道与Taq聚合酶高度特异地结合的46个核苷酸长度的适体序列,相同的MNAzyme检测策略(图20)被用来检测蛋白Taq聚合酶(Yakimovich,2003)。组装易化子和部件酶B与在使用MNAzyme检测ATP的实施例18中使用的相同。
21.1.部件酶寡核苷酸、组装和抑制性寡核苷酸 在本实施例中,将Taq聚合酶适体序列置于邻近适体-部件酶A的底物臂(图20)。适体-部件酶A和部件酶B的感应臂被设计用来与组装易化子结合。适体-部件酶TaqA2/1和部件酶AtpB3/1的序列如下所示(5’到3’)。在如下序列中,黑体碱基与组装易化子杂交,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,斜体碱基与底物杂交。另外,适体-部件酶A2 TaqA2/1中普通文本的碱基表示与Taq聚合酶结合的DNA适体序列。
SEQ ID NO124适体-部件酶A2 TaqA2/1
CGGTCGAA
GCATTCTTAGCGTTTTGCCCCGAGCCGACCGC SEQ ID NO104部件酶B3AtpB3/1
CCGAGC
组装易化子的序列如下所示(5’到3’) SEQ ID NO105组装易化子AtpC/1 GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT 抑制因子寡核苷酸的序列如下所示(5’到3’) SEQ ID NO125抑制因子TaqR/1 TGCCCCGAGCCGACCGAACTCACTATTT 21.2.报告底物 通过酶切双重标记的核酸报告底物监测MNAzyme活性。本实施例的报告底物是SubBi-1-FB,其序列从5’到3’如下所示。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。加下划线的碱基表示5’端的6-FAM部分和3’端的BHQ1部分的位置。以490nm(FAM激发波长)激发在520nm(FAM发射波长)下监测在FAM和BHQ1之间的核苷酸处酶切SubBi-1-FB所引起的荧光改变。
SEQ ID NO6SubBi-1-FB ACTCACTATaGGAAGAGATG 21.3.靶 本实施例的靶分子是Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences),Klenow聚合酶(Amersham Biosciences)用作阴性对照。无核酸酶的水用作“无靶”对照。
21.4.反应条件 靶序列的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是50μL。反应在FLUOstar OPTIMA(BMG Biotech)上在40℃下进行。每6秒钟读取每一反应的荧光,总共读15分钟。每一反应含有如下终浓度的物质200nM TaqA2/1、200nM AtpB3/1、200nM AtpC/1、200nMTaqR/1、200nM SubBi-1-FB、25mM MgCl2、25mM Tris HCl pH 6.8,以及5单位的Taq DNA聚合酶、5单位的Klenow聚合酶或无蛋白(仅水)。
21.5.结果SubBi-1-FB报告底物的检测和酶切 在没有Taq聚合酶时观察到仅随时间轻微增加的低荧光水平,表明抑制因子寡核苷酸能够阻止活性MNAzyme的组装。在存在Taq聚合酶时荧光信号水平较高并且随时间增加。这表明Taq聚合酶取代了抑制因子寡核苷酸并且活性MNAzyme形成。由于Klenow聚合酶存在时的荧光信号与没有Taq聚合酶时即“无靶”水对照时的荧光信号相似,MNAzyme的组装具有靶依赖性。这与Yakimovich et al.(2003)的观察结果一致,他们证实Taq聚合酶适体序列对Taq聚合酶具有特异性而且不与Klenow结合。以上的这一MNAzyme实施例表明MNAzyme能够与适体结合以检测特定蛋白。
实施例22使用截短的部件酶和稳定因子寡核苷酸检测单核苷酸多态性(SMP) 通过部件酶感应臂和靶序列的Watson-Crick碱基识别能够进行MNAzyme介导的靶检测。在实施例19中,这一互补性要求用于检测部件酶感应臂和靶核酸序列之间的单个碱基错配。在如下实施例中,再次采用所述互补性要求使用下述策略检测单核苷酸多态性(SNP),即使用具有截短的感应臂的部件酶的策略,所述截短的感应臂可以由稳定因子寡核苷酸稳定。在本实施例中使用的MNAzyme检测策略如图23所示,所要求的寡核苷酸描述如下 a)标准的部件酶; b)具有截短的感应臂(例如5个碱基)的部件酶,所述截短的感应臂被设计成与SNP的一种形式完全匹配但不与其其它形式完全匹配; c)稳定因子寡核苷酸(例如15个碱基),其与与部件酶的截短的感应臂邻近的靶杂交; 稳定因子被设计用来在5个核苷酸的感应臂与靶杂交时促进MNAzyme的组装;和 d)报告探针底物。
22.1.部件酶寡核苷酸和稳定因子寡核苷酸 在本实施例中,部件酶B的感应臂被设计成仅有5个核苷酸长并用来区分在靶寡核苷酸中存在的SNP。部件酶B的感应臂被设计成与SNP的“T”形式杂交但不与SNP的“C”形式杂交。部件酶A和B和稳定因子寡核苷酸的序列如下所示(5’到3’)。在如下序列中,黑体碱基与靶杂交,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,斜体碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO126部件酶A4 XdA4/2-P
ACAACGA
SEQ ID NO127部件酶B5 XdB5/2-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO128稳定因子XdF/2-P
22.2.报告底物 本实施例中使用的报告底物是SubBi-2。在当前的实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-FB。以490nm(FAM激发波长)激发在520nm(FAM发射波长)下监测SubBi-2-FB的酶切。SubBi-2-FB的序列如下所示(5’到3’);小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO21 SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 22.3.靶 本实施例的靶分子是源自Xd基因的合成寡核苷酸。所述靶之一与SNP(XdC/2(52))的“T”形式对应并与部件酶B的感应臂完全匹配。另一种靶与SNP的“C”形式对应并与部件酶B感应臂错配。合成的寡核苷酸自Sigma-Proligo订购,无核酸酶的水代替靶用作“无靶”对照。这两种靶的序列如下所示(5’到3’),其中SNP加下划线。
SEQ ID NO129靶XdC/2(52) TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGTATACAGACAGATGGACATCCAGTT GGTGA SEQ ID NO130靶(错配)XdC/2(1M52) TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGCATACAGACAGATGGACATCCAGTTGGTGA 22.4.反应条件 靶序列的检测通过由催化活性MNAzyme酶切报告底物引起的荧光信号增加来测量。加入底物启动反应并且所有反应的总体积是50μL。反应在FLUOstar OPTIMA(BMG Biotech)上在55℃下进行。每2秒钟读取每一反应的荧光,总共读5分钟。所有反应含有200nMXdA4/2-P、200nM XdB5/2-P、1x PCR Buffer II(Applied Biosystem)和25mM MgCl2。另外,反应含有表24中列出的寡核苷酸。
表24.MNAzyme反应中另外的试剂 22.5.结果SubBi-2-FB报告底物的检测和酶切 MNAzyme表明,当使用完全匹配的SNP模板时荧光随时间增加(反应A图23)。相比之下,当模板有错配时(含SNP),荧光信号不随时间增加(反应B图23)。类似地,在没有靶寡核苷酸时荧光不增加(反应D图23)。稳定因子寡核苷酸的存在显示对于稳定MNAzyme复合物至关重要。含有包括完全匹配的靶但缺乏稳定因子寡核苷酸的所有反应组分的反应,荧光不随时间增加(反应C图23)。这样,感应臂的5个碱基不足以形成稳定的MNAzyme复合物但是稳定因子寡核苷酸的存在可以弥补部件酶感应臂长度短(5个碱基)的缺点并允许在严紧的温度条件(本实施例中为55℃)下形成稳定的MNAzyme。稳定因子寡核苷酸可以视为本系统的第三部件酶,因为它是形成稳定的MNAzyme所必需的。
本实施例表明,MNAzyme能够用来区分差异小至SNP的两个靶。此外,它例示了具有截短的感应臂的部件酶的应用,以及它们与稳定因子寡核苷酸联合的使用。
实施例23具有核苷酸取代的MNAzyme的催化活性 与核酶不同,尚未发现DNA酶在自然界存在。DNA酶在体外离析自大的寡核苷酸库。已经尝试在某些条件下将已知的核酶中某些脱氧核糖核苷酸取代为某些核糖核苷酸(McCall et al.,1992)。由于RNA和DNA的构象差异,完全转化成DNA的核酶没有活性(Perreault et al.,1990)。这些研究表明,不能够仅仅通过以脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸而将RNA酶修饰成工作DNA酶。发明者进行了实验以研究MNAzyme对于核糖核苷酸取代为脱氧核糖核苷酸的耐受性。
23.1.部件酶寡核苷酸 在本实施例中,合成了各种部件酶,其中在构成催化核的区域,以核糖核苷酸取代一个或多个脱氧核糖核苷酸。合成的部件酶要么具有单个核糖核苷酸取代,要么整个部分催化核区域被核糖核苷酸取代。部件酶寡核苷酸A和B具有与人类RPLPO基因的外显子4区域互补的感应臂。部件酶寡核苷酸从5’到3’如下所示。在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。小写字母的碱基代表已经取代DNA碱基的RNA碱基。
SEQ ID NO131部件酶A(对照)RO4A5(18)/2-P
TACAACGA
SEQ ID NO132部件酶B(对照)RO4B6(19)/2-P
GGCTAGC
SEQ ID NO133部件酶A(ribo-14g)RO4A5(18)/2-rG14-P
TACAACgA
SEQ ID NO134部件酶A(ribo-9a)RO4A5(18)/2-rA9-P
TaCAACGA
SEQ ID NO135部件酶A(ribo x 8)RO4rA5(18)/2
uacaacga
SEQ ID NO136部件酶B(ribo x 7)RO4rB6(19)/2
ggcuagc
23.2.报告底物 本实施例的报告底物是SubBi-2,其序列从5’到3’如下所示。在当前的实施例中,对于SubBi-2在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-2-FB。以485nm(FAM激发波长)激发在530nm(FAM发射波长)下监测SubBi-2-FB的酶切。在如下序列中小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO21 SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 23.3.靶序列 在本实验中,合成的DNA寡核苷酸用作靶模板。靶的序列从5’到3’如下所示。
SEQ ID NO8 RO4/1靶 GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC 23.4.反应条件 各种部件酶对的催化活性分析用SmartCycler系统热循环仪(Cepheid)进行。反应的总体积是25μL并且每一反应含有1X PCRBufferII(Applied Biosystems)、10mM MgCl2、0.2μM的SubBi-2-FB、2μM的RO4/1靶,以及一对A和B部件酶(每一为2μM)。每一反应中的部件酶对见表24。
表24各种反应中的部件酶。
反应在54℃温育20分钟,每隔12秒钟采集荧光数据。由于SmartCycler系统热循环仪上各孔之间的初始荧光会不同,从每一反应的每一时间点的荧光中减去初始荧光值以便比较不同孔中的反应。
23.5.结果部件酶部分催化核序列中具有核糖核苷酸取代的MNAzyme的催化活性 由各种部件酶对组成的MNAzyme对底物的催化酶切以荧光随时间的改变来监测(表25)。
表25用各种部件酶组合获得的结果 本实验表明,部件酶的部分催化核中的某些核糖核苷酸取代与活性MNAzyme的形成相适宜。虽然在这些条件下单取代(部件酶A(ribo14g))与所有的DNA部件酶具有相似的活性,但是可选的单取代(部件酶A(ribo9a)),虽然仍与活性MNAzyme的形成相适宜,酶切底物的速率比对照慢。MNAzyme不耐受部件酶A和/或部件酶B的部分催化核结构域中所有核苷酸的取代。
实施例24作为启动信号扩增级联机制通过释放拴系的部件酶使MNAzyme活化 24.1.MNAzyme介导的信号扩增级联 MNAzyme能够用来启动信号扩增级联。图25例示了这样的信号扩增级联的一个策略。在靶的存在下,从在溶液中游离的部件酶形成活性MNAzyme 1。MNAzyme 1酶切其拴系的底物Sub 1,从而释放MNAzyme 2的部件酶组分。一旦游离,这些部件酶与组装易化子杂交并形成酶切底物Sub 2的MNAzyme 2。MNAzyme 2酶切溶液中游离的双重标记的Sub 2并产生荧光信号。此外,MNAzyme 2酶切拴系的Sub 2释放部件酶,所述部件酶与MNAzyme 2具有相同的感应臂并且在与组装易化子杂交时形成MNAzyme 3。(组装易化子可以被拴系,也可以在溶液中游离)。由于MNAzyme 3与MNAzyme 1有相同的底物臂,它也能够酶切拴系的Sub 1,从而释放MNAzyme 2的更多部件酶组分。这导致更多酶(MNAzyme)组分(部件酶)的酶促产生以及伴随的信号扩增级联的级联。
24.2.能够酶切荧光标记底物的拴系的MNAzyme的活化 本实施例例示图25所示的信号扩增级联的第一步。在这一启动步骤中,靶与溶液中游离的部件酶结合并形成活性MNAzyme 1。MNAzyme 1酶切拴系的底物Sub 1,从而释放MNAzyme 2的部件酶组分。一旦游离,这些部件酶与组装易化子杂交并形成MNAzyme 2。MNAzyme 2酶切溶液中游离的双重标记的Sub2-FQ(尤其是本实施例中的SubBi-3-FB)并产生荧光信号。
24.3.部件酶寡核苷酸 在如下序列中,加下划线的碱基形成组装的MNAzyme的部分催化核,黑体碱基与靶杂交,斜体碱基与底物杂交。既是斜体又加下划线的碱基表示与待拴系的部件酶相结合的底物序列。“-P”表示寡核苷酸的磷酸化,“(Biotin)”表示寡核苷酸的生物素化。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。所有的序列从5’到3’如下书写。
溶液中游离的MNAzyme 1部件酶被设计用来与人类RPLPO基因的外显子5特异性结合,拴系的MNAzyme 2部件酶被设计用来与组装易化子杂交。
SEQ ID NO147部件酶A4 RO5A4/2-P
ACAACGA
SEQ ID NO148部件酶B5 RO5B5/2-P
GGCTAGCT
SEQ ID NO138拴系的底物1/部件酶A4 RO4A4/3-5b (生物素)
ACAACGA
SEQ ID NO139拴系的底物1/部件酶B5 RO4B5/3-3b
GGCTAGCT
(生物素) 24.4.报告底物 本实施例的报告底物(Sub2;图25)是SubBi-3,其序列从5’到3’如下所示。在当前的实施例中,对于SubBi-3在5’端用6-FAM部分进行末端标记,在3’端用BHQ1部分进行末端标记,并命名为SubBi-3-FB。以492nm(FAM激发波长)激发在516nm(FAM发射波长)下监测SubBi-3-FB的酶切。小写字母的碱基代表RNA,大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO31 SubBi-3-FB CAGCACAACCguCACCAACCG 24.5.合成靶和组装易化子 在如下序列中,“生物素(Biotin)”表示寡核苷酸的生物素化。
SEQ ID NO140组装易化子RO4/2-3b GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC-(生物素) SEQ ID NO141RPLPO 5合成靶(RO5) GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG 24.6.将生物素化的部件酶拴系到包被链霉亲和素的微量测定板上 对于生物素化的部件酶和组装易化子的固定以100μl的总体积在室温下进行。在Amressco PBS溶液(不含Ca+和Mg+)中,结合混合物含有200nM的部件酶RO4A4/3-5b、200nM的部件酶RO4B5/3-3b和200nM的组装易化子RO4/2-3b。将结合混合物(100μl)等分到包被链霉亲和素的微量测定板(Roche诊断学)的每一孔中。结合时间为30分钟,然后用PBS洗三次,每次洗尽前温育15分钟。
24.7.酶切拴系的MNAzyme并检测酶切的荧光标记底物 荧光标记的底物SubBi-3-FB的酶切在FluoStar Optima荧光计(BMG LabTech)上以100μL的总反应体积于55℃等温监测4分钟。反应含有200nM的部件酶RO5A4/2-P、200nM的部件酶RO5B5/2-P、200nM的底物SubBi-3-FB、25mM MgCl2、1x PCR BufferII(Applied Biosystems)和200nM的合成RO5靶。无核酸酶的水代替合成RO5靶用作“无靶”对照。加入底物SubBi-3-FB启动反应。
24.8.结果存在RO5靶与“无靶”对照相比的荧光水平改变与无靶反应(水对照)比较,存在RO5靶时荧光有增加。与无靶对照中小于1,000单位相比,存在靶时4分钟后荧光的改变大约是36,000单位。这证实了MNAzyme 1(由部件酶RO5A4/2-P和RO5B5/2-P组成)酶切拴系的底物并释放组成MNAzyme 2的部件酶的能力。此外,它证实了部件酶一旦释放就能够与能够酶切底物引起信号产生的组装易化子形成活性MNAzyme。
实施例25直接区分DNA中甲基化胞苷与胞苷 使用具有部件酶的稳定因子臂以证实MNAzyme检测靶组装易化子中存在的单核苷酸多态性(SNP),所述部件酶具有截短的感应臂(实施例22)。在本实验中使用的实验条件下,在远高于其期望的解链温度的55℃下,将5个碱基的感应臂用作SNP的探针。具有稳定因子臂的系统和具有截短的感应臂的部件酶对靶中的小改变非常敏感。这一检测策略能够进一步扩展到直接区分在特定的胞苷残基处甲基化或未甲基化的靶而无需进行之前的亚硫酸氢盐修饰(见实施例11)。
5-甲基胞苷的存在使DNA的解链温度与未甲基化胞苷相比增加,每一甲基化碱基增加1.3℃。因此,具有例如5个核苷酸长度的感应臂的部件酶能够与含有三个5-甲基胞苷的靶结合的温度,与其能够与相同序列的未甲基化靶结合的温度相比,高几乎4℃。
当在适合于在甲基化靶的存在下杂交并形成MNAzyme、但是对于在未甲基化靶的存在下形成MNAzyme又太高的温度下温育部件酶、稳定因子臂和底物时,信号会仅在甲基化靶的存在下产生。
这提供了分析甲基化模式的新策略,所述策略能够提供作为癌症和其它疾病的标志物的甲基化碱基的检测方法。
实施例26使用MNAzyme诱导响应靶的颜色改变 图24例示将MNAzyme用于比色形式的策略。在该方法中,可能将MNAzyme底物纳入桥连寡核苷酸。桥连寡核苷酸与附着到金颗粒上的寡核苷酸有互补性。如果没有组装易化子存在,桥连寡核苷酸会保持完整而且金颗粒会聚集而使反应变蓝。如果存在组装易化子例如靶核酸,那么溶液中存在的部件酶会组装成MNAzyme并酶切底物(并因此酶切桥连寡核苷酸)。这会引起金颗粒聚集体的解散,而这又会导致颜色从蓝到红的改变。
这一MNAzyme策略提供了纳入若干通用组分的系统。这样,它提供能够快速适用于任何新靶的方法。这比其它系统相比的优势在于使用要求更多复合分子的DNA酶和金颗粒。在这一MNAzyme策略中,具有附着的寡核苷酸的MNAzyme底物和金颗粒可以是通用的并用于分析任何核酸靶。新分析系统会仅要求合成新部件酶,所述新部件酶具有与新靶互补的感应臂。此外,比色反应也能够用于与对核酸、蛋白或其它靶的活化敏感的MNAzyme系统联合。
参考文献
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<212>DNA
<213>合成的
<400>42
catggcacaa gcgaagctga 20
<210>43
<211>33
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(33)..(33)
<400>43
gcccccgcct ccaactacaa cgaggttgtg ctg33
<210>44
<211>31
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(31)..(31)
<400>44
cggttggtga ggctagcaac gcccgcacct c 31
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>合成的
<400>45
gttggttacg gtcgcggttc 20
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>合成的
<400>46
ccgaccgtaa ctattcgata cg22
<210>47
<400>47
000
<210>48
<400>48
000
<210>49
<400>49
000
<210>50
<400>50
000
<210>51
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
<400>51
agatcaagat cattgctcca caacgagagg aaacctt37
<210>52
<211>36
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(36)..(36)
<400>52
tgcccaggga ggctagcttc ctgagcgcaa gtactc 36
<210>53
<400>53
000
<210>54
<400>54
000
<210>55
<211>38
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(38)..(38)
<400>55
agttcaaatc tgtactgcac cacaacgaga ggcgtgat 38
<210>56
<211>38
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(38)..(38)
<400>56
ctgggaggaa ggctagctct ggaggtggat tcctttgg38
<210>57
<211>42
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(42)..(42)
<400>57
actgaataga aatagtgata gatacaacga gtgccatgtt aa 42
<210>58
<211>41
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(41)..(41)
<400>58
tatcacagcc aaggctagct ccattcctat gactgtagat t41
<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(12)..(13)
<400>59
aaggtttcct cguccctggg ca22
<210>60
<211>21
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(11)..(12)
<400>60
cagcacaacc gucaccaacc g 21
<210>61
<211>21
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(11)..(12)
<400>61
atcacgcctc gutcctccca g21
<210>62
<211>25
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(13)..(14)
<400>62
ttaacatggc acgutggctg tgata25
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>合成的
<400>63
cattgccgac aggatgcaga 20
<210>64
<211>18
<212>DNA
<213>合成的
<400>64
gagccgccga tccacacg18
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>合成的
<400>65
cactcagcca ctggatttaa 20
<210>66
<211>19
<212>DNA
<213>合成的
<400>66
gcgcgtcttt gctttattc 19
<210>67
<211>21
<212>DNA
<213>合成的
<400>67
ctttgctgac ctgctggatt a21
<210>68
<211>21
<212>DNA
<213>合成的
<400>68
cctgttgact ggtcattaca a21
<210>69
<211>38
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(38)..(38)
<400>69
agatcaagat cattgctcca caacgagtgc catgttaa 38
<210>70
<211>38
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(38)..(38)
<400>70
tatcacagcc aaggctagct tcctgagcgc aagtactc 38
<210>71
<211>39
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(39)..(39)
<400>71
caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag tgcgccatg39
<210>72
<211>41
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(41)..(41)
<400>72
tacttctccc aaggctagct gtggagacgg attacacctt c 41
<210>73
<400>73
000
<210>74
<400>74
000
<210>75
<211>41
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(41)..(41)
<400>75
actgaataga aatagtgata gatacaacga gaggaaacct t 41
<210>76
<211>39
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(39)..(39)
<400>76
tgcccaggga ggctagctcc attcctatga ctgtagatt 39
<210>77
<211>33
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(33)..(33)
<400>77
gctggtcatc cagcagacaa cgaggttgtg ctg 33
<210>78
<211>33
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(33)..(33)
<400>78
cggttggtga ggctagctgt gttcgacaat ggc33
<210>79
<211>22
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(12)..(13)
<400>79
aaggtttcct cguccctggg ca22
<210>80
<400>80
000
<210>81
<400>81
000
<210>82
<400>82
000
<210>83
<211>23
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(11)..(12)
<400>83
catggcgcac gutgggagaa gta 23
<210>84
<211>19
<212>DNA
<213>合成的
<400>84
caagactgga gacaaagtg 19
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>合成的
<400>85
gcagagtttc ctctgtgata 20
<210>86
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
<400>86
ggttgtcgtc agctcgtgta caacgagagg aaacctt 37
<210>87
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
<400>87
tgcccaggga ggctagctcg tgagatgttg ggttaag 37
<210>88
<211>18
<212>DNA
<213>合成的
<400>88
tggtgcatgg ttgtcgtc 18
<210>89
<211>17
<212>DNA
<213>合成的
<400>89
ttgcgctcgt tgcggga17
<210>90
<211>38
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(38)..(38)
<400>90
gaagaggcca ataaaggaga gacaacgaga ggcgtgat 38
<210>91
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
<400>91
ctgggaggaa ggctagctaa caccagcttg ttacacc37
<210>92
<211>22
<212>DNA
<213>合成的
<400>92
cagggtcatc cattccatgc ag22
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>合成的
<400>93
gctagtacca gttgagccag 20
<210>94
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<400>94
gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt37
<210>95
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<400>95
gggctggtca tccagcagta caacaagagg aaacctt37
<210>96
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<400>96
gggctggtca tccagcagtt caacgagagg aaacctt 37
<210>97
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<400>97
gggctggtca tccagcagta catcgagagg aaacctt 37
<210>98
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<400>98
gggctggtca tccagcagta ctacgagagg aaacctt 37
<210>99
<211>36
<212>DNA
<213>合成的
<400>99
tgcccaggga ggctagcgtg ttcgacaatg gcagca36
<210>100
<211>36
<212>DNA
<213>合成的
<400>100
tgcccaggga ggctagagtg ttcgacaatg gcagca36
<210>101
<211>36
<212>DNA
<213>合成的
<400>101
tgcccaggga ggccagcgtg ttcgacaatg gcagca36
<210>102
<211>40
<212>DNA
<213>合成的
<400>102
atgctgccat tgtcgaacac ctgctggatg accagcccaa40
<210>103
<211>59
<212>DNA
<213>合成的
<400>103
aacgtacact gcacgcggtc gaaatagtga gtacctgggg gagtattgcg gaggaaggt59
<210>104
<211>31
<212>DNA
<213>合成的
<400>104
catctcttct ccgagcgtct gtaccgtgta c 31
<210>105
<211>30
<212>DNA
<213>合成的
<400>105
gtacacggta cagaccgtgc agtgtacgtt30
<210>106
<211>17
<212>DNA
<213>合成的
<400>106
ccaggtactc actattt 17
<210>107
<211>41
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(41)..(41)
<400>107
caaacgagtc ctggccttgt cttacaacga gaggaaacct t 41
<210>108
<211>28
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(28)..(28)
<400>108
tgcccaggga ggctagcgtg gagacgga 28
<210>109
<211>28
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(28)..(28)
<400>109
tgcccaggga ggctagcgtc gagacgga 28
<210>110
<211>18
<212>DNA
<213>合成的
<400>110
agcagccaca aaggcaga 18
<210>111
<400>111
000
<210>112
<211>34
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(34)..(34)
<400>112
tgcccaggga ggctagctgtggagacggat taca 34
<210>113
<400>113
000
<210>114
<211>33
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(33)..(33)
<400>114
tgcccaggga ggctagcgtg gagacggatt aca 33
<210>115
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
<400>115
caaacgagtc ctggccttgt ctacgagagg aaacctt37
<210>116
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
<400>116
tgcccaggga ggctagctac agtggagacg gattaca37
<210>117
<211>39
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(39)..(39)
<400>117
caaacgagtc ctggccttgt ctcaacgaga ggaaacctt 39
<210>118
<211>35
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(35)..(35)
<400>118
tgcccaggga ggctagctag tggagacggattaca35
<210>119
<211>42
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(42)..(42)
<400>119
caaacgagtc ctggccttgt ctctacaacg agaggaaacc tt 42
<210>120
<211>32
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(32)..(32)
<400>120
tgcccaggga ggctaggtgg agacggatta ca 32
<210>121
<211>43
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(43)..(43)
<400>121
caaacgagtc ctggccttgt ctgctacaac gagaggaaac ctt 43
<210>122
<211>31
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(31)..(31)
<400>122
tgcccaggga ggctagtgga gacggattac a 31
<210>123
<211>19
<212>DNA
<213>合成的
<400>123
gctacccaac tgttgcatc 19
<210>124
<211>78
<212>DNA
<213>合成的
<400>124
aacgtacact gcacgcggtc gaaatagtga gtgcggtcgg ctcggggcat tcttagcgtt60
ttgccccgag ccgaccgc 78
<210>125
<211>28
<212>DNA
<213>合成的
<400>125
tgccccgagc cgaccgaact cactattt 28
<210>126
<211>38
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(38)..(38)
<400>126
actggatgtc catctgtctg acaacgagag gaaacctt38
<210>127
<211>23
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(23)..(23)
<400>127
tgcccaggga ggctagctta tac23
<210>128
<211>15
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(15)..(15)
<400>128
cttcgtgagg gtgag 15
<210>129
<211>52
<212>DNA
<213>合成的
<400>129
tgccccctca ccctcacgaa ggtatacaga cagatggaca tccagttggt ga52
<210>130
<211>52
<212>DNA
<213>合成的
<400>130
tgccccctca ccctcacgaa ggcatacaga cagatggaca tccagttggt ga52
<210>131
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
<400>131
gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt 37
<210>132
<211>36
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(36)..(36)
<400>132
tgcccaggga ggctagcgtg ttcgacaatg gcagca 36
<210>133
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(25)..(25)
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
<400>133
gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt37
<210>134
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(20)..(20)
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
<400>134
gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt37
<210>135
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(19)..(26)
<400>135
gggctggtca tccagcagua caacgagagg aaacctt37
<210>136
<211>36
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(11)..(17)
<400>136
tgcccaggga ggcuagcgtg ttcgacaatg gcagca 36
<210>137
<400>137
000
<210>138
<211>61
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>生物素
<222>(1)..(1)
<220>
<221>RNA
<222>(18)..(19)
<400>138
aaaaaaaagg tttcctcguc cctgggcagc tggtcatcca gcagacaacg aggttgtgct g 61
<210>139
<211>61
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(45)..(46)
<220>
<221>生物素
<222>(61)..(61)
<400>139
cggttggtga ggctagctgt gttcgacaat ggcaaggttt cctcguccct gggcaaaaaa a61
<210>140
<211>31
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>生物素
<222>(31)..(31)
<400>140
gccattgtcg aacacctgct ggatgaccag c 31
<210>141
<211>43
<212>DNA
<213>合成的
<400>141
gaaggtgtaa tccgtctcca cagacaaggc caggactcgt ttg43
<210>142
<211>28
<212>DNA
<213>合成的
<400>142
tgagctacag tcggtcgaaa tagtgagt 28
<210>143
<211>27
<212>DNA
<213>合成的
<400>143
catctcttct ccgagcgctt catctca 27
<210>144
<211>42
<212>DNA
<213>合成的
<400>144
ggcactaacg tgcctgagct acagtcggtc gaaatagtga gt42
<210>145
<211>41
<212>DNA
<213>合成的
<400>145
catctcttct ccgagcgctt catctcacga cgataacgtc g 41
<210>146
<211>22
<212>DNA
<213>合成的
<400>146
tgagatgaag cactgtagct ca 22
<210>147
<211>40
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(40)..(40)
<400>147
caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag aggaaacctt 40
<210>148
<211>39
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>磷酸化
<222>(39)..(39)
<400>148
tgcccaggga ggctagctgt ggagacggat tacaccttc39
<210>149
<211>8
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>RNA
<222>(2)..(2)
<400>149
tacaacga8
<210>150
<211>8
<212>DNA
<213>合成的
<400>150
cggtcgaa8
<210>151
<211>7
<212>DNA
<213>合成的
<400>151
acaacga 7
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<211>8
<212>DNA
<213>合成的
<400>152
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000
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<211>8
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<400>155
tacaacaa8
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<211>8
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<213>合成的
<400>157
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000
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000
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<211>6
<212>DNA
<213>合成的
<400>161
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000
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<400>163
000
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000
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<211>7
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<400>170
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000
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<211>9
<212>DNA
<213>合成的
<400>172
ggctagcta 9
权利要求
1.包含至少两种或更多种寡核苷酸组分的组合物,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在MNAzyme组装易化子的存在下自组装形成催化活性多组分核酸酶(MNAzyme),其中每一所述至少第一和所述第二寡核苷酸组分包含底物臂部分、催化核部分和感应臂部分;
其中当自组装时,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述感应臂部分用作所述MNAzyme的感应臂,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述底物臂部分用作MNAzyme的底物臂,并且所述第一和第二寡核苷酸组分的所述催化核部分用作所述MNAzyme的催化核;
并且其中所述MNAzyme的所述感应臂与所述MNAzyme组装易化子相互作用以便维持所述第一和第二寡核苷酸组分的邻近,使得它们各自的催化核部分缔合形成所述MNAzyme的所述催化核,所述催化核能够修饰至少一种底物,并且其中所述MNAzyme的所述底物臂接合底物使得所述MNAzyme的所述催化核能够修饰所述底物。
2.如权利要求1所述的组合物,其中所述寡核苷酸组分、组装易化子或底物的至少之一由DNA或其类似物组成。
3.如权利要求1或2所述的组合物,其中所述组装易化子是待鉴定、检测或定量的靶。
4.如权利要求3所述的组合物,其中所述靶是核酸。
5.如权利要求4所述的组合物,其中所述核酸选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、短干扰RNA、短发夹RNA、转运RNA、信使RNA、核仁小分子RNA、小型临时RNA、调节性小RNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物、扩增子或上述的任意组合。
6.如权利要求5所述的组合物,其中所述核糖体RNA是16S核糖体RNA。
7.如权利要求4-6中任一权利要求所述的组合物,其中所述核酸的来源选自合成、哺乳动物、人类、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或上述的任意组合。
8.如权利要求4-6中任一权利要求所述的组合物,其中所述核酸被扩增。
9.如权利要求8所述的组合物,其中所述扩增包括下述的一种或多种聚合酶链反应(PCR)、单链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
10.如权利要求1-9中任一权利要求所述的组合物,其还包含至少第三寡核苷酸组分,所述第三寡核苷酸组分用来稳定所述底物臂部分或感应臂部分的至少之一。
11.如权利要求1-10中任一权利要求所述的组合物,其中所述组装易化子、所述寡核苷酸组分或底物的至少之一或上述的组合由多于一个的分子组成。
12.如权利要求1-11中任一权利要求所述的组合物,其中所述第一核苷酸组分的所述催化核部分选自SEQ ID NO 149-153、155-157、159和161,并且所述第二寡核苷酸组分的所述催化核部分选自SEQ IDNO 166-170和172。
13.如权利要求1-12中任一权利要求所述的组合物,其还包含所述MNAzyme的所述自组装的至少一种抑制因子。
14.如权利要求1-13中任一权利要求所述的组合物,其中所述寡核苷酸组分或组装易化子或底物的至少之一或上述的组合还包含至少一种适体或其部分。
15.如权利要求14所述的组合物,其中所述适体或其部分由核酸、肽、多肽或蛋白的至少之一或其衍生物或组合组成。
16.如权利要求1-15中任一权利要求所述的组合物,其还包含所述MNAzyme的所述自组装的至少一种抑制因子。
17.如权利要求1-16中任一权利要求所述的组合物,其中所述第一或所述第二寡核苷酸组分或所述组装易化子或所述底物的至少之一还包含能够形成发夹结构的至少一部分自互补序列。
18.如权利要求17所述的组合物,其中所述发夹结构抑制所述MNAzyme的自组装。
19.如权利要求18所述的组合物,其中当适体与靶接触时自组装的所述抑制被解除。
20.如权利要求14-19中任一权利要求所述的组合物,其中所述适体或其部分与靶结合,所述靶选自核酸、蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合。
21.如权利要求1-20中任一权利要求所述的组合物,其中所述底物是核酸或蛋白。
22.如权利要求21所述的组合物,其中所述核酸包含标记核酸、RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体中的至少之一或上述的任意组合。
23.如权利要求21所述的组合物,其中所述蛋白包含抗体、多肽、糖蛋白、脂蛋白的至少之一或上述的任意组合。
24.如权利要求1-23中任一权利要求所述的组合物,其中所述底物还包含纳米颗粒或微粒的至少之一或上述的组合。
25.如权利要求1-24中任一权利要求所述的组合物,其中所述底物臂通过互补碱基对接合所述底物。
26.如权利要求1-25中任一权利要求所述的组合物,其中所述底物附着到不溶性载体上或在溶液中游离。
27.如权利要求1-26中任一权利要求所述的组合物,其中所述底物包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。
28.如权利要求1-27中任一权利要求所述的组合物,其中所述MNAzyme对所述底物的所述修饰提供可检测作用。
29.如权利要求1-28中任一权利要求所述的组合物,其中所述底物的所述修饰选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键,或上述的任意组合。
30.如权利要求27、28或29所述的组合物,其中所述可检测作用通过如下方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
31.如权利要求27-30中任一权利要求所述的组合物,其中测定所述可检测作用并且其中所述测量值的大小提示靶的量。
32.如权利要求1-31中任一权利要求所述的组合物,其中所述寡核苷酸组分、所述组装易化子或所述底物的至少之一选自DNA、RNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体或上述的任意组合。
33.如权利要求1-32中任一权利要求所述的组合物,其中所述组装易化子和所述底物是与至少部分所述第一或第二寡核苷酸组分全部或部分互补的核酸。
34.如权利要求1-34中任一权利要求所述的组合物,其中所述寡核苷酸组分、所述组装易化子或所述底物的至少之一包含至少一核苷酸取代或添加,所述核苷酸选自4-乙酰胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、二氢尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β,D-半乳糖基Q核苷、2’-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、β,D-甘露糖基甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-尿苷、5-甲氧基尿苷、2-硫代甲基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-硫代甲基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰)苏氨酸、尿苷-5-氧基乙酸甲基酯、尿苷-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷、β-D-阿拉伯糖基尿苷、β-D-阿拉伯糖基胸苷。
35.如权利要求1-34中任一权利要求所述的组合物,其还包含至少第三寡核苷酸组分和第四寡核苷酸组分,所述至少第三寡核苷酸组分和第四寡核苷酸组分在至少一种另外的组装易化子的存在下自组装形成至少一种另外的催化活性MNAzyme,其中每一所述至少第三和第四寡核苷酸组分包含底物臂部分、催化核部分和感应臂部分;
其中当至少第三寡核苷酸组分和第四寡核苷酸组分自组装时,所述至少第三和所述至少第四寡核苷酸组分的所述感应臂部分形成所述至少一种另外的催化活性MNAzyme的感应臂,所述至少第三和所述至少第四寡核苷酸组分的所述底物臂部分形成所述至少一种另外的催化活性MNAzyme的底物臂,并且所述至少第三和所述至少第四寡核苷酸组分的所述催化核部分形成所述至少一种另外的催化活性MNAzyme的催化核;
并且其中所述至少一种另外的MNAzyme的所述感应臂与所述至少一种另外的组装易化子相互作用,以便维持所述至少第三和所述至少第四寡核苷酸组分的邻近使得它们各自的催化核部分缔合形成所述至少一种另外的MNAzyme的所述催化核,所述催化核能够作用于至少一种另外的底物,并且其中所述至少一种另外的MNAzyme的所述底物臂接合至少一种另外的底物使得所述至少一种另外的MNAzyme的所述催化核能够作用于所述至少一种另外的底物。
36.如权利要求35所述的组合物,其中每一所述另外的底物相同、不同或是其组合。
37.检测至少一种组装易化子存在的方法,其包括
(a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在组装易化子的存在下自组装形成至少一种催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);
(b)在允许下述情况的条件下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述组装易化子的样品接触
(1)所述至少一种催化活性MNAzyme的所述自组装,和
(2)所述MNAzyme的所述催化活性;和
(c)确定所述至少一种MNAzyme的所述催化活性的存在,其中所述催化活性的存在提示所述至少一种组装易化子的存在。
38.如权利要求37所述的方法,其中所述MNAzyme的所述自组装要求所述组装易化子与所述第一和第二寡核苷酸组分的一者或两者接触。
39.如权利要求37或38所述的方法,其还包括提供至少第三寡核苷酸组分,所述第三寡核苷酸组分与所述第一和第二寡核苷酸组分的任一者或两者的至少一部分接触,以便自组合所述MNAzyme。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述第三寡核苷酸组分由多于一个的分子组成。
41.检测至少一种组装易化子的存在的方法,其包括
(a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在至少第一组装易化子的存在下自组装形成至少第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);
(b)提供至少第一底物,所述第一MNAzyme能够修饰所述第一底物,其中所述MNAzyme对所述底物的所述修饰提供可检测作用;
(c)在允许下述情况的条件下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述至少第一组装易化子的样品接触
(1)所述至少第一MNAzyme的所述自组装;
(2)所述至少第一MNAzyme的所述催化活性;和
(d)检测所述可检测作用。
42.如权利要求37-41中任一权利要求所述的方法,其中所述寡核苷酸组分、组装易化子或底物的至少之一由DNA或其类似物组成。
43.如权利要求37-41中任一权利要求所述的方法,其中所述组装易化子是待鉴定、检测或定量的靶。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述靶是核酸。
45.如权利要求44所述的方法,其中所述核酸选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、短干扰RNA、短发夹RNA、转运RNA、信使RNA、核仁小分子RNA、小型临时RNA、调节性小RNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物、扩增子或上述的任意组合。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述核糖体RNA是16S核糖体RNA。
47.如权利要求44-46中任一权利要求所述的方法,其中所述核酸的来源选自合成、哺乳动物、人类、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或上述的任意组合。
48.如权利要求37-47中任一权利要求所述的方法,其还包括扩增所述核酸的步骤。
49.如权利要求48所述的方法,其中所述扩增步骤包括下述的一种或多种聚合酶链反应(PCR)、单链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
50.如权利要求37-49中任一权利要求所述的方法,其中所述组装易化子、所述第一或第二寡核苷酸组分或底物的至少之一或上述的组合由多于一个的分子组成。
51.如权利要求48所述的方法,其还包括在所述扩增期间或之后检测所述可检测作用。
52.如权利要求37-51中任一权利要求所述的方法,其中所述可检测作用提示所述组装易化子的存在。
53.如权利要求37-52中任一权利要求所述的方法,其中定量或定性测定所述可检测作用。
54.如权利要求37-53中任一权利要求所述的方法,其中所述底物是核酸或蛋白。
55.如权利要求54所述的方法,其中所述核酸包含标记核酸、RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体的至少之一或上述的任意组合。
56.如权利要求54所述的方法,其中所述蛋白包含抗体、多肽、糖蛋白、脂蛋白的至少之一或上述的任意组合。
57.如权利要求37-56中任一权利要求所述的方法,其中所述底物还包含纳米颗粒或微粒的至少之一或上述的组合。
58.如权利要求54-57中任一权利要求所述的方法,其中所述底物是核酸,并且其中所述底物臂通过互补碱基配对接合所述底物。
59.如权利要求37-58中任一权利要求所述的方法,其中所述底物包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。
60.如权利要求37-59中任一权利要求所述的方法,其中所述底物附着到不溶性载体上或在溶液中游离。
61.如权利要求37-60中任一权利要求所述的方法,其中所述可检测作用通过如下方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
62.如权利要求37-61中任一权利要求所述的方法,其还包括通过使用可检测作用扩增级联来扩增所述可检测作用。
63.如权利要求62所述的方法,其中所述可检测作用扩增级联包含一个或多个核酶/连接酶级联、循环核酸酶级联、蛋白质酶级联或附着到载体上的一个或多个酶,或上述的任意组合。
64.如权利要求37-63中任一权利要求所述的方法,其中所述底物的所述修饰选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。
65.如权利要求37-64中任一权利要求所述的方法,其还包括提供至少第三和第四寡核苷酸组分,其中所述至少第三和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的组装易化子的存在下能够自组装形成至少一种另外的催化活性MNAzyme,和
其中样品中存在至少一种另外的底物,所述另外的底物仅能由所述另外的MNAzyme修饰,其中所述修饰提供所述另外的可检测作用。
66.如权利要求76所述的方法,其中所述至少一另外的可检测作用能独立地检测到。
67.如权利要求65或66所述的方法,其中每一另外的底物的至少之一附着到不溶性载体上使得在所述另外的MNAzyme修饰所述另外的底物时,所述另外的底物的可检测部分和淬灭基团部分中仅一者仍附着在所述载体上。
68.如权利要求65-67中任一权利要求所述的方法,其中一种另外的底物附着到至少一种不溶性载体上使得在所述底物各自的MNAzyme修饰该底物时产生可检测作用。
69.检测至少一种靶存在的方法,其包括
(a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和至少第二寡核苷酸组分在所述靶的存在下能够自组装形成催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);并且其中所述第一和所述第二寡核苷酸组分的至少之一还包含至少一种适体的部分;
(b)在允许下述情况的条件下,使所述寡核苷酸组分与推定含有所述至少一种靶的样品接触
(1)所述靶结合所述适体的部分和
(2)所述MNAzyme的催化活性;和
(c)确定所述MNAzyme的所述催化活性的存在,其中所述催化活性的存在提示所述靶的存在。
70.如权利要求69所述的方法,其中所述靶待鉴定、检测或定量。
71.检测至少一种靶存在的方法,其包括
(a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在至少一种组装易化子和所述至少一种靶的存在下能够自组装形成至少一种催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);并且其中所述第一或所述第二寡核苷酸组分的至少之一或所述至少一种组装易化子还包含至少一种适体或其部分,且其中所述靶能够与所述至少一种适体或其部分结合;
(b)提供所述MNAzyme的所述自组装的至少一种抑制因子;
(c)在允许下述情况的条件下,使所述两种寡核苷酸组分、组装易化子和所述抑制因子与推定含有所述至少一种靶的样品接触
(1)所述靶结合所述至少一种适体或其部分,和
(2)所述至少一种MNAzyme的催化活性;和
(3)解除所述催化活性MNAzyme的所述自组装的所述抑制;和
(d)确定所述MNAzyme的所述催化活性的存在,其中所述催化活性的存在提示所述靶的存在。
72.如权利要求71所述的方法,其中所述适体或其部分由核酸、肽、多肽或蛋白的至少之一或其衍生物或组合组成。
73.如权利要求69-72中任一权利要求所述的方法,其还包括提供底物,所述MNAzyme能够修饰所述底物以提供可检测作用。
74.如权利要求73所述的方法,其中所述修饰选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。
75.如权利要求73所述的方法,其中在缺少所述组装易化子和所述靶时,所述底物不被所述第一或第二寡核苷酸组分单独修饰或不被所述第一和第二寡核苷酸组分两者修饰。
76.检测至少一靶种存在的方法,其包括
(a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在至少第一组装易化子和所述至少第一靶的存在下能够自组装形成至少第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);
(b)提供至少第一底物,所述至少第一MNAzyme能够修饰所述第一底物,其中所述MNAzyme对所述底物的所述修饰提供可检测作用;
(c)其中所述第一或所述第二寡核苷酸组分或所述至少第一组装易化子或所述至少第一底物的至少之一还包含适体,并且其中所述靶能够与至少部分所述适体结合,提供至少第一抑制因子,所述第一抑制因子在缺少所述靶时能够抑制所述催化活性MNAzyme的所述自组装;
(d)在允许下述情况的条件下,使所述寡核苷酸组分、所述组装易化子、所述底物和所述抑制因子与推定含有所述靶的样品接触
(1)所述靶结合所述适体,和
(2)解除所述催化活性MNAzyme的所述自组装的所述抑制
(3)所述MNAzyme的催化活性;和
(e)确定所述可检测作用的存在,从而检测所述靶的存在。
77.如权利要求69-76中任一权利要求所述的方法,其中至少一种所述寡核苷酸组分或组装易化子由DNA或其类似物组成。
78.如权利要求69-77中任一权利要求所述的方法,其中所述适体或其部分与靶结合,所述靶选自核酸、蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或上述的任何衍生物、部分或组合。
79.如权利要求69-78中任一权利要求所述的方法,其中至少一种所述寡核苷酸组分、组装易化子、底物或抑制因子附着到不溶性载体上。
80.如权利要求71-79中任一权利要求所述的方法,其中至少一种所述寡核苷酸组分、组装易化子、适体或适体的部分还包含所述抑制因子。
81.如权利要求69-80中任一权利要求所述的方法,其中所述适体或其部分由核酸、肽、多肽或蛋白的至少之一或其衍生物或组合组成。
82.如权利要求71-81中任一权利要求所述的方法,其中所述第一或所述第二寡核苷酸组分、组装易化子或底物的至少之一还包含能够形成发夹结构的部分自互补序列。
83.如权利要求82所述的方法,其中所述发夹结构抑制所述催化活性MNAzyme的自组装。
84.如权利要求83所述的方法,其中在所述适体或适体的部分与所述靶接触时,所述催化活性MNAzyme的自组装的所述抑制被解除。
85.如权利要求71-84中任一权利要求所述的方法,其中所述抑制因子能够与至少一种所述适体或其部分结合。
86.如权利要求71-85中任一权利要求所述的方法,其中所述抑制因子选自RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体或上述的组合。
87.如权利要求73-86中任一权利要求所述的方法,其中所述底物是核酸或蛋白。
88.如权利要求87所述的方法,其中所述核酸包含标记核酸、RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体的至少之一或上述的任意组合。
89.如权利要求87所述的方法,其中所述蛋白包含抗体、多肽、糖蛋白、脂蛋白的至少之一或上述的任意组合。
90.如权利要求73-89中任一权利要求所述的方法,其中所述底物还包含纳米颗粒或微粒的至少之一或上述的组合。
91.如权利要求73-90中任一权利要求所述的方法,其中定量或定性测定所述可检测作用。
92.如权利要求73-91中任一权利要求所述的方法,其中所述可检测作用通过如下方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
93.如权利要求73-92中任一权利要求所述的方法,其中所述底物包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。
94.如权利要求73-93中任一权利要求所述的方法,其中所述修饰选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。
95.如权利要求71-94中任一权利要求所述的方法,其还包括提供至少第三和第四寡核苷酸组分,其中所述至少第三和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的组装易化子和至少一种另外的靶的存在下能够自组装形成至少一种另外的催化活性MNAzyme,和
其中所述样品中存在至少一种另外的底物,所述另外的MNAzyme能够修饰所述另外的底物,其中所述修饰提供另外的可检测作用;
并且其中所述第三或第四寡核苷酸组分或所述另外的组装易化子或所述另外的底物的至少之一还包含至少一种另外的适体,所述适体与所述至少一种另外的靶结合;
其中至少一种另外的抑制因子分子与部分所述另外的适体接触,从而在缺乏所述另外的靶时抑制所述另外的催化活性MNAzyme的所述自组装;和
其中所述至少一种另外的组装易化子与至少部分所述另外的寡核苷酸组分接触。
96.如权利要求95所述的方法,其中所述至少一种另外的可检测作用能独立地检测。
97.如权利要求95或96所述的方法,其中每一另外的底物相同、不同或是其组合。
98.如权利要求95-97中任一权利要求所述的方法,其中每一另外的底物的至少之一附着到不溶性载体上使得在所述另外的MNAzyme修饰所述另外的底物时,所述另外的底物的可检测部分和淬灭基团部分中仅一者仍附着在所述载体上。
99.检测至少一种核酸序列变异存在的方法,其包括
(a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在核酸的序列变异的存在下自组装形成催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);
(b)提供至少一种底物,所述第一MNAzyme能够修饰所述底物,其中所述MNAzyme对所述底物的所述修饰提供可检测作用;
(c)在允许下述情况的条件下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述序列变异的样品接触
(1)所述催化活性MNAzyme的所述自组装,和
(2)所述MNAzyme的所述催化活性;和
(d)确定所述可检测作用的存在,从而检测所述至少一种序列变异的存在。
100.如权利要求99所述的方法,其中所述序列变异选自单核苷酸多态性、多核苷酸多态性、插入、删除、重复、易位、移码序列变异、无义序列变异或上述的任意组合。
101.如权利要求99或100所述的方法,其中所述序列变异存在于DNA或RNA中。
102.如权利要求99-101中任一权利要求所述的方法,其中所述第一寡核苷酸组分和所述第二寡核苷酸组分的任一者或两者由多于一个的分子组成。
103.如权利要求99-102中任一权利要求所述的方法,其中含有所述序列变异的所述样品选自亚硫酸氢盐修饰的甲基化或非甲基化DNA、亚硫酸氢盐修饰的甲基化或非甲基化RNA、亚硫酸氢盐修饰的甲基化或非甲基化DNA的至少一种扩增子、亚硫酸氢盐修饰的甲基化或非甲基化RNA的至少一种扩增子或上述的组合。
104.如权利要求99-103中任一权利要求所述的方法,其中所述多组分核酸酶的自组装要求所述第一和第二寡核苷酸组分的任一者或两者的至少一部分与包含所述序列变异的所述核酸接触。
105.如权利要求99-104中任一权利要求所述的方法,其还包括扩增含有所述序列变异的核酸的步骤。
106.如权利要求105所述的方法,其中所述扩增步骤包括下述的一种或多种聚合酶链反应(PCR)、单链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
107.如权利要求105或106所述的方法,其还包括在所述扩增期间或之后测定所述核酸序列变异的存在。
108.如权利要求99-107中任一权利要求所述的方法,其中所述可检测作用通过下述方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
109.如权利要求99-108中任一权利要求所述的方法,其中所述底物包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。
110.如权利要求99-109中任一权利要求所述的方法,其中所述底物附着到不溶性载体上或在溶液中游离。
111.如权利要求99-110中任一权利要求所述的方法,其中所述修饰选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。
112.如权利要求99-111中任一权利要求所述的方法,其还包括
(a)提供至少第三寡核苷酸组分和至少第四寡核苷酸组分,所述至少第三寡核苷酸组分和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的核酸序列变异的存在下自组装形成至少一种另外的催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);
(b)在允许下述情况的条件下,使所述至少第三和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的底物的存在下与推定含有至少一种另外的核酸序列变异的样品接触,所述至少一种另外的MNAzyme能够修饰所述至少一种另外的底物,其中所述至少一种另外的底物的所述修饰提供至少一种另外的可检测作用
(1)至少一种MNAzyme的所述自组装,和
(2)至少一种MNAzyme的所述催化活性;和
(c)检测所述至少一种另外的可检测作用,从而检测所述至少一种另外的序列变异的存在。
113.如权利要求112所述的方法,其中所述至少一种另外的可检测作用能独立地检测到。
114.如权利要求112或113所述的方法,其中每一所述另外的底物相同、不同或是其组合。
115.如权利要求112-114中任一权利要求所述的方法,其中每一种另外的底物的至少之一附着到不溶性载体上使得在所述另外的MNAzyme修饰所述另外的底物时,所述另外的底物的可检测部分和淬灭基团部分中仅一者仍附着在所述载体上。
116.检测核酸的序列变异存在的方法,其包括
(a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其包含在核酸的存在下能够自组装形成至少第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme)的至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分;
(b)在允许下述情况的条件下,在由所述至少第一MNAzyme修饰的至少第一底物的存在下使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述核酸的样品接触,其中所述底物包含在所述至少第一MNAzyme修饰所述底物时能够提供至少第一可检测作用的可检测部分
(1)所述MNAzyme的所述自组装,和
(2)所述MNAzyme的所述催化活性;和
(c)其中没有所述催化活性提示所述核酸中存在序列变异。
117.检测至少一种甲基化核酸存在的方法,其包括
(a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在甲基化核酸的存在下自组装形成至少一种催化活性多组分核酸酶(MNAzyme);
(b)提供至少第一底物,所述第一MNAzyme能够修饰所述第一底物,其中所述MNAzyme对所述底物的所述修饰提供至少第一可检测作用;
(c)在允许下述情况的条件下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述甲基化核酸的样品接触
(1)所述催化活性MNAzyme的所述自组装,和
(2)所述MNAzyme的所述催化活性;和
(d)确定所述至少一种可检测作用的存在,从而检测所述至少一种甲基化核酸的存在。
118.如权利要求117所述的方法,其中所述条件还包括促进所述MNAzyme与所述甲基化核酸杂交但不与非甲基化核酸杂交的温度。
119.如权利要求117或118所述的方法,其还包括通过使用可检测作用扩增级联扩增所述可检测作用。
120.如权利要求119所述的方法,其中所述可检测作用扩增级联包括一个或多个核酶/连接酶级联、循环核酸酶级联、蛋白质酶级联或附着到载体上的一种或多种酶,或上述的任意组合。
121.如权利要求117-120中任一权利要求所述的方法,其中所述甲基化核酸的来源选自合成、哺乳动物、人类、动物酸、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或上述的任意组合。
122.如权利要求117-121中任一权利要求所述的方法,其中所述甲基化核酸选自甲基化RNA或甲基化DNA。
123.如权利要求117-122中任一权利要求所述的方法,其中所述多组分核酸酶的所述自组装要求所述甲基化核酸与所述第一和第二寡核苷酸组分的一者或两者接触。
124.如权利要求117-123中任一权利要求所述的方法,其还包括提供其上附着有所述底物或所述第一或第二寡核苷酸组分的至少之一或上述的组合的不溶性载体。
125.如权利要求117-124中任一权利要求所述的方法,其中所述可检测作用通过如下方法检测荧光光谱,表面等离子体共振,质谱,核磁共振,电子自旋共振,荧光偏振光谱,圆二色谱,免疫测定,色谱法,辐射线测定,光度测定,闪烁扫描法,电子方法,紫外、可见光或红外光谱,酶促方法或上述的任意组合。
126.如权利要求117-125中任一权利要求所述的方法,其中所述底物包含可检测部分和淬灭基团部分,其中当所述MNAzyme修饰所述底物时,所述可检测部分提供的可检测作用增加或减少。
127.如权利要求117-126中任一权利要求所述的方法,其中所述修饰选自酶切、连接、卟啉金属化,形成碳碳键、酯键或酰胺键。
128.如权利要求117-127中任一权利要求所述的方法,其还包括提供至少第三和第四寡核苷酸组分,其中所述至少第三和至少第四寡核苷酸组分在至少一种另外的甲基化核酸的存在下能够自组装形成至少一种另外的催化活性MNAzyme,和
其中所述样品中存在至少一种另外的底物,所述另外的MNAzyme能够修饰所述另外的底物,其中所述修饰提供所述另外的可检测作用。
129.如权利要求128所述的方法,其中所述至少一种另外的可检测作用独立地检测到。
130.如权利要求128或129所述的方法,其中每一所述另外的底物相同、不同或是其组合。
131.如权利要求128-130中任一权利要求所述的方法,其中所述另外的底物的至少之一附着到不溶性载体上使得在所述另外的MNAzyme修饰所述另外的底物时,所述另外的底物的另外的可检测部分和另外的淬灭基团部分中仅一者仍附着在所述载体上。
132.使用扩增级联检测至少一种组装易化子的方法,其包括
(a)提供两种或更多种寡核苷酸组分,其包括在至少第一组装易化子的存在下自组装形成至少第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme)的至少第一寡核苷酸组分和至少第二寡核苷酸组分;
(b)提供其上附着有至少第一底物的不溶性载体,所述MNAzyme能够修饰所述第一底物,其中所述第一底物包含至少第三分子,所述第三分子包含在所述第一MNAzyme修饰所述第一底物时被释放的至少第一催化活性酶;
(c)在允许下述情况的条件下,在其上附着有所述第一底物的所述不溶性载体的存在下,使所述两种或更多种寡核苷酸组分与推定含有所述组装易化子的样品接触
(1)所述MNAzyme的所述自组装,和
(2)所述MNAzyme的所述催化活性;和
(d)提供其上附着有至少第二底物的不溶性载体,所述第二底物能由所述第一催化活性酶酶切,其中所述第二底物包含含有至少可检测部分的至少第四分子,所述可检测部分在所述第一酶修饰所述第二底物时被释放;
(e)其中所述第一催化活性酶修饰多种所述第二底物从而释放多个可检测部分;
(f)其中所述可检测部分在所述第一催化活性酶修饰所述第二底物后能够检测到;
(g)其中检测到所述可检测部分提示存在所述组装易化子。
133.如权利要求132所述的方法,其中所述可检测部分还包含另外的第二催化活性酶,所述另外的第二催化活性酶能够修饰所述第一底物,从而释放另外的催化活性酶。
134.如权利要求133所述的方法,其中所述第一或所述第二催化活性酶的至少之一选自MNAzyme、DNA酶、核酶、产生水解作用的酶、限制性内切酶、外切酶、蛋白酶、蛋白酶类、水解酶(hydrolases)、溶细胞酶、肽酶、二肽酶、酯酶、半胱天冬酶(caspases)、组织蛋白酶、脱巯基酶、酰胺酶、糖苷酶。
135.如权利要求132-134中任一权利要求所述的方法,其中所述组装易化子是待鉴定、检测或定量的靶。
136.使用MNAzyme介导的信号扩增级联检测靶的方法,其包括
(a)提供在所述靶的存在下自组装形成第一催化活性多组分核酸酶(MNAzyme)的第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分;
(b)提供其上附着有第一和第二底物的不溶性载体,所述第一MNAzyme能够修饰所述第一和第二底物,其中所述第一和第二底物各自包含能够形成第二催化活性MNAzyme的至少第三和第四寡核苷酸组分,其中所述第三和第四寡核苷酸组分在所述第一MNAzyme修饰所述第一和第二底物时被释放;
(c)提供其上附着有第三和第四底物的所述不溶性载体,所述第二MNAzyme能够修饰所述第三和第四底物,其中所述第三和第四底物各自包含能够形成第三催化活性MNAzyme的至少第五和第六寡核苷酸组分,其中所述第五和所述第六寡核苷酸组分在所述第二MNAzyme修饰所述第三和第四底物时被释放,和;
(d)提供能够促进所述第二和所述第三MNAzyme的所述组装的组装易化子,和;
(e)提供能够被所述第二MNAzyme修饰以提供可检测作用的第五底物;
(f)在允许下述情况的条件下,在所述组装易化子的存在下,和在其上附着有所述第一、第二、第三和第四底物的所述不溶性载体的存在下,使所述第一和第二寡核苷酸组分与推定含有所述靶的样品接触
(1)所述第一、第二和第三MNAzyme的自组装,和
(2)所述第一、第二和第三MNAzyme的催化活性;和
(g)其中所述第三MNAzyme修饰所述第一和第二底物从而进一步提供所述第二MNAzyme,其中所述第二MNAzyme进一步修饰所述第三、第四和第五底物中的至少之一从而进一步提供所述第三MNAzyme,从而进一步提供所述可检测作用,和;
(h)其中检测到所述可检测作用提示所述靶的存在。
137.如权利要求136所述的方法,其中所述靶待鉴定、检测或定量。
138.如权利要求136或137所述的方法,其中所述第五底物与所述第一、第二、第三或第四底物中的任何一种相同或不同。
139.如权利要求132-138中任一权利要求所述的方法,其中所述靶选自核酸、蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、核酸或上述的任何衍生物、部分或组合。
140.如权利要求139所述的方法,其中所述核酸选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、短干扰RNA、短发夹RNA、信使RNA、转运RNA、核仁小分子RNA、小型临时RNA、调节性小RNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA,衍生物、其扩增子或上述的任意组合。
141.如权利要求136-140中任一权利要求所述的方法,其中每一所述第一、第二、第三或第四底物存在于相同固体载体上或不同固体载体上或上述的任意组合。
142.如权利要求136-141中任一权利要求所述的方法,其中所述第一、第二、第三或第四底物中的至少之一的所述修饰还提供可检测作用。
143.用于制备多种多组分核酸酶(MNAzyme)的方法,每一种所述多组分核酸酶识别至少一种组装易化子并修饰底物,所述方法包括
(a)提供待鉴定、检测或定量的多种组装易化子,
(b)设计两种或更多种寡核苷酸组分,其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在组装易化子的存在下自组装形成催化活性多组分核酸酶(MNAzyme),其中每一所述至少第一和第二寡核苷酸组分包含底物臂部分、催化核部分和感应臂部分,
其中当自组装时,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述感应臂部分形成所述MNAzyme的感应臂,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述底物臂部分形成所述MNAzyme的底物臂,所述第一和第二寡核苷酸组分的所述催化核部分形成所述MNAzyme的催化核;
并且其中所述MNAzyme的所述感应臂与组装易化子相互作用,以便维持所述第一和第二寡核苷酸组分的邻近使得它们各自的催化核部分缔合形成所述MNAzyme的所述催化核,所述催化核能够作用于至少一种底物,并且其中所述MNAzyme的所述底物臂接合底物使得所述MNAzyme的所述催化核能够修饰所述底物;
(c)改变所述两种或更多种寡核苷酸组分使得所述第一和第二寡核苷酸组分的所述底物臂部分和所述催化核部分恒定不变,并且所述第一和第二寡核苷酸组分中的至少之一的所述感应臂部分适合于识别所述多种组装易化子中的另一种,和
(d)对所述多种组装易化子中的每一种重复所述改变步骤。
144.用于检测多种靶的存在的试剂盒,其包含多种被设计用于组装多种MNAzyme的多种寡核苷酸组分和至少一种底物,每一种所述MNAzyme对应于多种靶中的至少之一。
145.用于组装多种MNAzyme的试剂盒,其包含多种组装易化子、被设计用于组装多种MNAzyme的多种寡核苷酸组分和至少一种底物,每一种所述MNAzyme对应于所述多种组装易化子中的每一种。
146.用于检测靶的试剂盒,其包含多种寡核苷酸组分和底物,所述寡核苷酸组分被设计用于组装对应于所述靶的MNAzyme。
全文摘要
本发明涉及多组分核酸酶(MNAzyme)及其使用方法。MNAzyme包含两种或更多种寡核苷酸组分,所述组分在一种或多种MNAzyme组装易化子分子的存在下自组装形成催化活性结构。本发明提供制备MNAzyme的组合物以及MNAzyme集。本发明还提供使用MNAzyme检测、鉴定和/或定量一种或多种靶的方法。所述方法能够在以溶液为基础的分析或将一种或多种反应组分附着到载体结构上的分析中实践。该方法允许使MNAzyme检测复合以便在单一反应中检测多种靶。还提供制备所述组合物以及实践在此提供的方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101341260SQ200680045926
公开日2009年1月7日 申请日期2006年10月6日 优先权日2005年10月7日
发明者伊丽莎·莫卡尼, 唐纳德·约翰·伯基特, 艾莉森·威尔彦·托德, 崔姆·比奇·多恩 申请人:强生研究有限公司