新型蛋白质和编码该蛋白质的dna的制作方法

专利名称：：新型蛋白质和编码该蛋白质的dna的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有生成下述化合物的活性的蛋白质，该化合物抑制羟甲基戊二酰CoA(MG-CoA)还原酶、具有血清胆固醇降低作用，还涉及编码该蛋白质的DNA、具有该DNA的转化体、以及使用该蛋白质或该转化体制备该化合物的方法。已知式(XI)所示化合物[以下称为化合物(VI-a)]中Ri为氢原子或碱金属的化合物，或者式(XII)所示的、化合物(VI-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(VI-b)]抑制HMG-CoA还原酶、显示降4氐血清胆固醇的作用等(非专利文献l)。皆景技术(式中，R表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>关于通过微生物、由式(IX)所示的化合物[以下称为化合物(V-a)]或式(X)所示的、化合物(V-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(V-b)]生成化合物(VI-a)或化合物(VI-b)的方法已经有很多报道。(式中，W表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属);[化4]式00即，专利文献l中记述了使用丝状菌的方法，专利文献2和3中记述了使用放线菌的方法。但是，这些微生物是延伸菌丝进行生长，因此，在发酵罐中增殖，则培养液的粘度升高。容易发生氧不足，培养液不均勻，容易导致反应效率降低。为了消除该氧不足，使培养液保持均匀，必须提高发酵罐的搅拌速度，但如果提高搅拌速度则有可能发生菌丝断丝，容易使微生物的活性降低(非专利文献2)。作为避免上述问题的方法，专利文献4中记述了使用枯草杆菌的方法，专利文献5中记述了使用不形成孢子且不形成菌丝的微生物的方法。但是任何方法都具有培养/反应需要较长时间或者相对于投入的原料化合物(V-a)或(V-b)的目标化合物(VI-a)或(VI-b)的收率低的问题，难以说是有利于工业化的制备方法。作为解决这些问题的方法，人们考虑通过扩增催化由化合物(V-a)或(V-b)生成化合物(VI-a)或(VI-b)的反应的酶基因，使反应速度或收率提高的方法。催化该反应的酶基因已由本发明人从枯草杆菌中获得(专利文献6)。但是，基因的导入虽然可见生成活性增大的效果，但是在生成速度、收率方面仍未获得令人满意的工业化成绩。非专利文献l:TheJournalofAntibiotics,29,1346(1976)非专利文献2:发酵工学的基础(驟酵工学0基礎)、169-1卯页,P.F.Stansbury,A.Whitaker著、学会出版七7夕一(1988)]专利文献l:日本特开昭57-50894号公报专利文献2:日本特开平1-184670号公报专利文献3:国际公开第96/40863号小册子专利文献4:国际公开第99/07872号小册子专利文献5:国际公开第00/43533号小册子专利文献6:国际公开第00/44886号小册子
发明内容本发明的目的在于提供具有活性的蛋白质，该活性是生成抑制HMG-CoA还原酶、具有血清胆固醇降低作用的化合物的活性；还提供编码该蛋白质的DNA、具有该DNA的转化体、以及使用该蛋白质或该转化体该化合物的有利于工业化的制备方法。本发明涉及下述(l)-(22):(1)蛋白质，该蛋白质具有SEQIDN0.1-3中任一项所示氨基酸序列。但是含有SEQIDN0.4-6所示氨基酸序列的蛋白质除外。(2)DNA,该DNA编码具有SEQIDNO.I-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质。但是，编码含SEQIDN0.4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA除外。(3)DNA，该DNA具有SEQIDN0.7所示碱基序列。(4)重组体DNA，该重組体DNA含有上述P)或p)的DNA。(5)转化体，该转化体是将上述(4)的重組体DNA导入到宿主细胞中得到的。(6)上述(5)的转化体，其中，宿主细胞是属于埃希氏菌属Cfoc/^nc/^a)、芽孢杆菌属(Sa"〃M)、棒状杆菌属(Co^y"e6""en'wm)、链霉菌属(5Vre/^cw27ces)、曲霉属(Js;erg/〃us)或青霉属(尸e"z'c/〃/wm)的樣i:生物。(7)上述(5)的转化体，其中，宿主细胞是属于大肠杆菌(5^c/^nc/z^co/z')、4古草芽孑包斥干菌(S"ci!'〃us1sw6"/")、巨大芽孑包斥干菌(5"c/〃uyweg"&r/w附)、谷氨酸才奉斥干菌(Cc^ywe6acfen'wmg/wtom/cwm)、产氛才奉才干菌(Co^y"e6acfen'wmcww2ow/age"e力、浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、土曲霉(^s/7erg/〃ws、桔青霉(尸训'"'〃/画c"〃力廳)的微生物。(8)化合物(n-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于使上述(l)或(2)的蛋白质与式(I)所示的化合物[以下称为化合物(I-a)]或式(II)所示的、化合物(I-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(I-b)]接触，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(式中，W表示氬原子、取代或无取代的烷基或碱金属，W表示取代或无取代的烷基或芳基)；或式(iv)所示的、化合物(n-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(n-b)],式(in)(式中，W表示氬原子、取代或无取代的烷基或碱金属，W表示取代或无取代的烷基或芳基)；(式中，W表示取代或无取代的烷基或芳基)收集化合物(n-a)或(n-b)。(9)化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于在水性介质中，使上述(5)-(7)中任一项的转化体的培养物或该培养物的处理物与化合物(I-a)或(I-b)接触，使化合物(n-a)或化合物(II-b)在该介质中生成并蓄积，由该介质中收集化合物(n-a)或化合物(n-b)。(10)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(V)所示的化合物[以下称为化合物(III-a)]:[化9]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(式中，Ri表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属，R"表示取代或无取代的烷基或芳基)，化合物(I-b)是式(VI)所示的化合物[以下称为化合物(m-b)]:[化IO]式(VI)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(式中，R"表示取代或无取代的烷基或芳基)，化合物(II-a)是式(VII)所示的化合物[以下称为化合物(IV-a)]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(式中，Ri表示氬原子、取代或无取代的烷基或碱金属，W表示取代或无取代的烷基或芳基)，化合物(II-b)是式(vm)所示的化合物[以下称为化合物(IV-b)]:[化12]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>(vni)(式中，R"表示取代或无取代的烷基或芳基)。(11)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(IX)所示的化合物[以下称为化合物(V-a)]::<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式(X)化合物(II-a)是式(XI)所示的化合物[以下称为化合物(VI-a)]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>式(XI)(式中，W表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，化合物(II-b)是式(XII)所示的化合物[以下称为化合物(IV-b)]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>式(XII)(12)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(XIII)所示的化合物[以下称为化合物(VII-a)]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>式(xin)(式中，W表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，化合物(I-b)是式(XIV)所示化合物[以下称为化合物(VII-b)]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式(XIV)化合物(II-a)是式(XV)所示的化合物[以下称为化合物(Vin-a)]:[化19]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式(xv)(式中，W表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，化合物(II-b)是式(XVI)所示的化合物[以下称为化合物(VIII-b)]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式(XVI)(13)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(II-b)是由化合物(n-a)形成内酯得到的化合物(II-b)。(14)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(II-a)是使化合物(n-b)的内酯开环得到的化合物(II-a)。(15)上述(10)的制备方法，其中，化合物(III-b)是由化合物(in-a)形成内酯得到的化合物(ni-b)。(16)上述(10)的制备方法，其中，化合物(IV-a)是使化合物(IV-b)的内酯开环得到的化合物(IV-a)。(17)上述(ll)的制备方法，其中，化合物(V-b)是由化合物(V-a)形成内酯得到的化合物(V-b)。(18)上述(ll)的制备方法，其中，化合物(VI-a)是使化合物(VI-b)的内酯开环得到的化合物(VI-a)。(19)上述(12)的制备方法，其中，化合物(vn-b)是由化合物(vn-a)形成内酯得到的化合物(VII-b)。(20)上述(12)的制备方法，其中，化合物(vin-a)是使化合物(vm-b)的内酯开环得到的化合物(vm-a)。(21)上述(9)-(12)中任一项的制备方法，其中，转化体培养物的处理物是培养物的浓缩物、培养物的干燥物、培养物的冻干物、由培养物得到的菌体，选自该菌体的干燥物、该菌体的冻干物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎物、该菌体的溶剂处理物的菌体处理物，菌体的蛋白分级产物，以及选自菌体和菌体处理物的固定化物的处理物。(22)蛋白质的制备方法，其特征在于将上述(5)-(7)中任一项的转化体在培养基中培养，使上述(l)的蛋白质在培养物中生成并蓄积，由该培养物中收集该蛋白质。根据本发明，可以高效、工业化制备抑制HMG-CoA还原酶、具有血清胆固醇降低作用的化合物。图l是表示pSC6的制备步骤的图。图2是表示pSYN2-39上的yjiB基因的变异位置和限制酶切位点的图。箭头表示yjiB基因区，粗线表示变异位置。具体实施例方式以下详细说明本发明。1.本发明的蛋白质本发明的蛋白质是除了包含SEQIDN0.4-6所示氨基酸序列的蛋白质之外的、具有SEQIDNO.1-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质。本发明的蛋白质也包含下述蛋白质包含在SEQIDN0.1-3所示的任一氨基酸序列中，Xaa所示的氨基酸以外的l50个，优选120个，更优选115个，进一步优选110个，特别优选15个，更特别优选13个氨基酸残基置换、缺失或附加得到的氨基酸序列，且具有将上式(I)(式中，W表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属，W表示取代或无取代的烷基或芳基)所示的化合物[以下称为化合物(I-a)]、或上式(II)(式中，R2表示取代或无取代的烷基或芳基)所示的、化合物(I-a)的闭环内酯体(以下称为化合物(I-b))转化为式(m)(式中，W表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属，W表示取代或无取代的烷基或芳基)所示化合物[以下称为化合物(II-a)]、或式(iv)(式中，rs表示取代或无取代的械或芳基)所示的、化合物(n-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(II-b)]的活性。2.本发明的DNA本发明的DNA可列举除了编码含SEQIDN0.4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA之外的、编码具有SEQIDN0.1-3所示氨基酸序列的蛋白质的DNA,以及具有SEQIDN0.7所示碱基序列的DNA。不过，含有SEQIDN0.8和9所示碱基序列的DNA可以排除在本发明的DNA之外。3.本发明的DNA的制备方法通过公知的化学合成方法合成编码具有SEQIDN0.1-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质的DNA,可以制备本发明的DNA。DNA的合成可以使用市售的DNA合成装置(例如PE、BioSystems公司制造的ABI-381A等)。也可以分成几个部分合成，以取代一次性地合成全长，将各片段依次连接组合，来制备本发明的DNA。合成含有SEQIDN0.9所示碱基序列的DNA之后，通过公知的方法向该DNA导入变异，由此也可以制备本发明的DNA。或者是利用限制酶等将上述得到的各变异部位进行组合，也可以制备本发明的DNA。具体来说，可通过以下方法制备本发明的DNA。DNA的操作、大肠杆菌的转化、由大肠杆菌回收质粒等可按照常规方法、例如Molecularcloning,Alaboratorymanual,ThirdEdition,ColdHarborLaboratoryPress(2001)(以下简称为分子克隆第3版)、CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1-38,JohnWiley&Sons(1987-1997)、DNACloning1:CoreTechniques,APracticalApproach,SecondEdition,OxfordUniversityPress(1995)等中记载的方法、或者使用市售试剂盒等进行。首先合成将SEQIDN0.9的碱基序列分割而成的部分序列。为了使后面的连接操作容易进行，优选以突出位点的形式导入与该部分序列互补的碱基序列，或者适当加入限制酶切位点。该部分序列例如可以是具有SEQIDNO.10-33所示石咸基序列的DNA。如图l所示，该部分序列可以分成末端具有限制酶切位点的5个链段(block)。限制酶切;末端，然后与适当的载体连:，转化大肠杆菌、例如大肠杆菌DH5a(购自东洋纺社)。作为载体，只要是可在大肠杆菌中自主复制即可，没有特别限定，具体可列举pBluescriptIISK(+)[NucleicAcidsResearch,17，9494(1989)]、LambdaZAPII[X卜，夕^一7公司制备]、Xgt10、Xgtll[DNACloningAPracticalApproch,1,49(1985)]、pT7T313U(77At'二7*社制)、pcD2[H.OkayamaandP.Berg;Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]、pMW218(和光纯药制)、pUC118、pUC119、pSTV28、pSTV29(宝酒造社制)、pEG400[J.Bac.,172，2392(1990)]、pHMV1520(MoBiTec社制)、pQE-30(QIAGEN社制)等。由所得转化体回收目标质粒，用适当的限制酶切断后，通过琼脂糖凝胶电泳等分离链段部分的DNA片段。将这些DNA片段连接，可以制备具有SEQIDN0.9所示碱基序列的DNA片段。如果将3个以上的链段一次性连接较为困难时，可以通过将连续的链段依次附加的方法(图1)制备目标片段。通过向该片段中导入变异，可以制备具有SEQIDN0.7所示碱基序列的DNA片段。导入变异的方法有易错PCR法、使用羟氨的方法、使例如，采用易错PCR法时，以整合了具有SEQIDN0.9所示碱基序列的DNA片段的质粒作为模板，以SEQIDNO.34和35作为引物，在锰(Mn)盐浓度比通常高的反应液中进行PCR反应。Mn盐浓度可以使用0.1mmol/L-lmmol/L左右的浓度。4.本发明的蛋白质的制备方法
技术领域：
：本发明的蛋白质可通过将上述3的方法中制备的本发明的DNA在宿主细胞中表达来制备。为了使该DNA在宿主细胞中表达，首先将作为目标的该DNA用限制酶或DNA分解酶等制成含有编码区的适当长度的DNA片段，然后插入到表达载体的启动子下游，接着将该表达载体导入到适合表达载体的宿主细胞中。宿主细胞只要是细菌、酵母、丝状菌、动物细胞、植物细胞等可表达目标基因的细胞，则可以使用任何细胞。作为表达载体，使用可以在上述宿主细胞中自主复制或者是整合到染色体DNA中，在可转录上述目标DNA的位置含有启动子的表达载体。使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，用于使该DNA表达的表达载体优选是可在该细胞中自主复制、同时由启动子、核糖体结合序列、该DNA和转录终止序列构成的重组载体。也可以含有控制启动子的基因。表达载体可列举pBTrp2、pBTacl、pBTac2(均由《一卩》方、一t>/、^厶社制)、pKK233-2(777社制)、pGEX(77VkT'〉7*社制)、pSE280(4》tT卜口-工7社制)、pGEMEX-l(7°口乂#社制)、pQE-8(《7y乂社制)、pET誦3(乂W^工》社制)、pKYP10(日本特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Bio.Chem,48,669(1984)]、pLSAl[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGELl[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，82,4306(1985)]、pBluescriptnSK+(只卜，夕'7工>社制)、pBluescriptIISK(-)卜，夕^工》社制)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERMBP-5407)制]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERMBP-5408)制]、pUC19[Gene,33,103(1985)〗、pSTV28(夕力才社制)、pUCU8(夕力，7《4才社制)、pPAl(日本特开昭63-233798)、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pHW1520(MoBiTec社制)、pCS299P(WO00/63388)等。启动子只要是可在宿主细胞中发挥功能即可，可以使用任何启动子。例如可以使用迪启动子(PtiE)、i^启动子(P1^)、PL启动子、PR启动子、PsE启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子，SP01启动子，SP02启动子，penP启动子等。还可以使用将P迎两个串联的启动子(PtiEx2),t^启动子、i^T7启动子、嵐I启动子这样的进行了人工设计改变的启动子等。并且，为了在芽孢杆菌属细菌中表达，可以使用sdA启动子，或为了在棒状杆菌属细菌中表达，可使用P54-6启动子等。优选使用将作为核糖体结合序列的SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密码子之间调节为适当距离(例如6-l8个碱基)的质粒。本发明的重组体DNA中，本发明的DNA的表达不一定需要转录终止序列，但优选在结构基因的紧下游配置转录终止序列。用作宿主细胞的原核生物，可列举属于埃希氏菌属、棒状杆菌属、4豆4干菌(^wW6a"enwm)属、芽孢才干菌属、孩史斥干菌(M/'cro6a"en'wm)属、沙、雷氏菌(^erra"a)属、4叚单月包菌(尸"wc/owoway)属、土壤杆菌(」gro6""en.ww)属、脂环酸芽孢杆菌(J/z'cyc/o6ac/〃uy)属、鱼腥藻(J加Z)(^加)属、组嚢蓝纟田菌(jw"c"to)属、节牙f菌(^W/zro6"c7^)属、固氮杆菌(JzoZ"c&r)属、着色菌(C7zram"〃wm)属、欧文氏菌(5HWm.")属、甲基斥干菌(M^/zy/o6a"en'ww)属、席蓝细菌(尸/zw7W^'ww;)属、红细菌(^/zc^o^c&r)属、红假单胞菌(i/zo6fo/^ew(iomowas)属、纟工纟田菌(A/0(io5^z'n'〃wm)属、4牛生才册》莱(Sce加^fe纖—属、链霉菌属、聚球藻咏朋ecocc—属或发酵单胞菌(Zymomomw)属等的微生物，优选属于埃希氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属等的微生物。该微生物的具体例子例如可列举大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、枯草芽孢杆菌ATCC33712、巨大芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌FERMBP國6030(万ac/〃w取FERMBP-6030)、解淀粉芽孢杆菌(Sac/〃usamy/o/^we々"力e力、产氨4豆才干菌(5reW6a"er/wm、^^w力ac/enwmzmman'o//^7wmATCC14068、解糖短杆菌ATCC14066(SreWkz"enwmracc/wra/_y"cwmATCC14066)、黄色短杆菌ATCC14067(5rm^a"enw附y/avwmATCC14067)、乳发酵短杆菌ATCC13869(BrevibacteriumlactofermentumATCC13869)、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870(Cw7"e^"en'wmacetoa"t/o/7/7wwATCC13870)、产氨棒杆菌ATCC6872(C07脱6""en'ww^TW2om力gew^ATCC6872)、产氨才奉杆菌ATCC21264、嗜氨樣i杆菌ATCC15354(Mz'cro6ac化nwwawmomap/n'/wmATCC15354)、无花果沙雷氏菌(&rra"a、居泉沙雷氏菌(Se簡".a/b油'co/a)、液化沙雷氏菌(Serra"a/一咖c/e"s)、粘质沙雷氏菌(Se/ra^廳rc^ce"力、假单胞菌细菌D-0110(Pseudomonassp.D-0110)、放射形土i襄杆菌(^grak/c^7wwra<^'o6(3c/^r)、发才艮土壤斥干菌(^4gn6ac&〃'w附r/n'zogewe力、'悬钩子土)泉斥干菌(Jgn^GCfen'wwrw&)、才主孑包鱼月星蓝纟田菌04"a6ae"a<qy//"<in'cfl)、才甬形鱼月星蓝细菌(J"ak3fe"Gdo/z'o/應)、水华鱼腥蓝细菌(J"a6ae"ayos,w—、金黄节才干菌(」W/zro6""er"w/rjce"力、冲宁檬节4干菌W/zro^a"er"Y,ew力、J求形节4干菌(jW/zra6a"erg/o6/bnm's)、Jr/7zra6a"er/zj^raca^Jog/wta/m'cuy、迈索尔节杆菌(^4rt/2raZ^c^m"ormy)、烟草节杆菌(y4/Y/zra6a"erm'coto"ae)、石错节杆菌(JW/roZ)a"er、原玻璃錄节杆菌(*/zrotefer/ro啤/zonm'—、政瑰色石错节軒菌(^4W/ro6a"erms^o/araW"—、疏碌节杆菌(/1wAra6a"er仰^i/re—、产脲节杆菌(/1W/^o6ac^"'ern1)、(CAnwwO'wm6w(ien')、樣i5显着色菌(C7zroma〃wm^/Wwm)、酒色着色菌y/w/a"/e、噬夏孢欧文氏菌wr^fovora)、胡萝卜软腐欧文氏杆菌carafovora)、菠萝欧文氏斥干菌(5HWma""a"os)、草生欧文氏斥干菌(￡>vP7'm.aAe/^/co/a)、E"rwz'm'a/ww加to、f^reus、罗得西亚甲基軒菌(A/ef/iy/o6""6r/wwr/zo(ie57."www)、4丑脱甲基4干菌(A/W/^/oZ^c&n'wwe;ctowe"力、席藻属细菌ATCC29409(尸/orm/^'ww^.ATCC29409)、荚膜红细菌(i^ot/oZ)a"erca/ww/a^^)、球形红细菌(i/zot/o6a"ersp/wero^fey)、生芽红细菌(Rhodopseudomonasblastica)、海红菌(朋。(io/wew(i謹o"tw1mar/"a)、沼泽红假单胞菌("/zc><io/wew<io,"cw/a/"Wn力、深红红螺菌(i^ocfo^zW〃wmra^wm)、需盐红螺菌(A/zo(ias/^n'〃wmsa/e:n'ge"s)、盐场纟工虫累菌(^/zot/os/^V7'〃wmsa/z'wari/m)、产二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)、生金色链霉菌(57te/^om;/cesG"re咖"'e"力、金色链霉菌(5Vr一麵ycesawre—、杀真菌链霉菌(S化，蘭yces/wwg/cWc附)、灰产色链霉菌(5^，ow;/cmgr^eocAromoge"^)、灰色链霉菌(5Yr，omycesgr&e—、'浅青紫链霉菌(iSV厂，o，c^/ZWd"朋)、棵榄灰链霉菌(5Vr，謹j^yo//vog/7^—、枝链霉菌(S/r，謂j/c^rawe—、田无链霉菌(5V，^wycesto"cw/n'ms7力、酒红链霉菌(57re/^omycwv/waceuy)和运动发酵单胞菌(Z;vwo附ci"as1wo6//^)等。重组载体的导入方法只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法均可使用，例如有使用4丐离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110(l972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394)、电穿孔法或Gene，17,107(1982)或Molecular&GeneralGenetics,168,111(1979)中记载的方法等。使用酵母作为宿主细胞时，表达载体例如有YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、p腦5等。启动子只要是可在酵母中发挥功能的即可，例如有PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gall启动子、gal10启动子、热休克蛋白启动子、MFal启动子、CUP1启动子等启动子。酵母有酉良酒酵母(5Vcc/z"rom少ce51cewWsae)、粟酒裂歹直酵母(5"c/z/my"cc/^cw^ces/om6e)、乳克鲁维氏酵母(^7w"eromyces/acto)、茁芽丝孑包酵母(7Wc/zos/ora"/w〃w/a朋)、河岸许旺氏酵母(Sc/z而"m'o，c^s1a〃謂W)等。重组载体的导入方法只要是可以向酵母中导入DNA的方法均可使用，例如有电穿孔法[Methods.Enzymol.,194，182(1990)]、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75，1929(1978)]、乙酸锂法[J.Bacteriol.,153,163(1983)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75，1929(1978)]记载的方法等。使用动物细胞作为宿主细胞时，表达载体例如有pcDNAI、pcDM8(7大-少社销售)、pAGE107[日本特开平3國22979;Cytotechnology,3"133，(1990)]、pAS3-3(日本特开平2國227075)、pCDM8[Nature,329,840，(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen社制)、pREP4(Invitrogen社制)、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pAGE210等。启动子只要是可在动物细胞中发挥功能即可，均可使用，例如有巨细胞病毒(人CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40的早期启动子、反转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRa启动子等。还可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。宿主细胞有那马瓦细胞(Namalwacell)、HBT5637(日本特开昭63-299)、COSl细胞、COS7细胞、CHO细胞等。向动物细月包中导入重组载体的方法可以使用可向动物细胞中导入DNA的任何方法，例如可采用电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钓法(日本特开平2-227075)、脂转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,84,7413(1987)、Virology,52,456(1973)]中记载的方法等。转化体的获得和培养可按照日本特开平2-227075号公报和日本特开平2-257891号公报所记载的方法进行。表达方法除了使本发明的蛋白质直接表达的方法之外，还可按照分子克隆第3版所记载的方法，以分泌型蛋白或融合型蛋白的形式表达。通过酵母、动物细胞表达时，可以获得加成有糖或糖链的蛋白质。将保有整合了本发明的DNA的上述重组体DNA的转化体在培养基中培养，使本发明的蛋白质在培养物中生成并蓄积，由该培养物中收集该蛋白质，由此可以制备本发明的蛋白质。用的通常的方法进行。该转化体为以原核生物、或酵母等微生物作为宿主细胞的转化体时，培养这些微生物的培养基只要含有该微生物可以同化的碳源、氮源、无机盐类等，且可高效地进行转化体的培养即可，可以是天然培养基、合成培养基的任一种。碳源只要是各微生物可以同化的均可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜，淀粉或淀粉水解产物等碳水化合物，乙酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类。氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等各种无机酸或有机酸的铵盐，其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化物等。无机物可以使用磷酸二氬钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。培养在振荡培养或深度通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度可以是15-50。C，培养时间通常为16小时-7天。培养中的pH保持在3.0-9.0。pH的调节可以使用无机或有机酸、碱溶液、尿素、7碳酸钙、氨等进行。培养中还可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素或四环素等抗生素。对用使用i;培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导物。例如，对于用使用M启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-P-D-硫代半乳吡喃糖普(IPTG)等；对用使用li2启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加巧I哚丙烯酸(IAA)等；对于用使用xylA启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添力口木糖。对于以动物细胞作为宿主细胞得到的转化体进行培养时，培养基可使用通常所使用的RPMI1640培养基[TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation,199,519(1967)]、Eagle的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、DMEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[ProceedingoftheSocietyfortheBiologicalMedicine,73,1(1950)]或这些培养基中添加胎牛血清等所得的培养基等。培养通常在pH6-8、30-40°C、5%(:02存在下等条件下进行1-7天。培养中还可以根据需要添加卡那霉素、青霉素等抗生素。由培养物中分离纯化本发明的蛋白质时，可以采用通常的酶的分离、纯4匕方法。例如，本发明的蛋白质以在细胞内溶解的状态表达时，可以在培养结束后通过离心分离回收细胞，悬浮于水系緩冲液中，然后通过超声波破碎机、弗氏细胞压碎机、7>卜》方、々卩》匀浆器、Dyno-mill等进行细胞破碎，获得无细胞的提取液。将该无细胞提取液离心分离获得上清，由该上清将常规酶的分离纯化方法，即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、有机溶剂沉淀法、二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、使用DIAIONHPA-75(三菱化学社制)等树脂的阴离子交换色谱法、使用S-琼脂糖FF(77Vk"T、:>7社制)等树脂的阳离子交换色谱法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、层析聚焦法、等电位电泳等电泳法等方法单独或组合使用，可获得纯化的标准品。该蛋白质在细胞内形成不溶物表达时，同样地回收细胞后进行破碎，进行离心，按照通常的方法，从所得沉淀组分中回收该蛋白质，然后通过蛋白质改性剂使该蛋白质的不溶物可溶。将该溶解液稀释为不含有蛋白质改性剂、或者蛋白质改性剂的浓度不会导致蛋白质改性程度的稀溶液，或者进行透析，使该蛋白质形成正常的立体结构，然后通过与上述同样的分离纯化法获得纯化标准品。本发明的蛋白质或其糖修饰物等衍生物分泌到细胞外时，可以在培养上清中回收该蛋白质或其糖链加成物等衍生物。即，通过与上述同样的离心等方法对该培养物进行处理，由此可获得可溶性组分，通过使用与上述同样的分离纯化法，可以从该可溶性组分中获得纯化标准品。上述获得的蛋白质例如有具有SEQIDN0.1-3所示氨基酸序列的蛋白质。通过上述方法表达的蛋白质还可以通过Fmoc法(药曱氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化学合成方法制备。另外，也可以利用桑和贸易(美国AdvancedchemTech制造)、川一矢>工A^—,-弋乂《；/(美国Perkin-Elmer公司制造)、77'>7*乂《4才r夕(瑞典PharmaciaBiotech乂^司制造)、7*口力(美国ProteinTechnologyInstrument制造)、夕，求^(美国Synthecell國Vega公司制)、日本A—七7°^4卩、；r少卜'(美国PerSeptive公司制造)、岛津制作所等的肽合成仪进行合成。5.化合物(n-a)或化合物(II-b;)的制备方法在介质中，将按照上述4的方法培养得到的细胞、该细胞的培养物、该培养物的处理物或纯化的本发明的蛋白质等与化合物(I-a)或化合物(I-b)接触，在该介质中生成并蓄积化合物II-a或化合物II-b,从该介质中收集化合物(II-a)或化合物(II-b)，由此可制备化合物(II-a)或化合物(n-b)。本发明的细胞培养物的处理物有培养物的浓缩物、培养物的干燥物、培养物的冻干物，将培养物离心等得到的菌体，该菌体的干燥物、该菌体的冻干物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的酶处理物、该体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎物等粗酶提取物、以及来自该细胞的蛋白质分级物和酶的固定化物等的粗纯化酶等。介质可以使用水、水性介质或有机溶剂，或者是水或水性介质与有机溶剂的混合液。水性介质例如可使用磷酸緩冲液、HEPES(N-2-羟基乙基哌嗪-N-乙磺酸)緩冲液、三[三(羟曱基)氨基曱烷]盐酸緩冲液等緩冲液。有才几溶剂只要不阻碍反应即可，例如可^f吏用丙酮、乙酸乙酯、二曱基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。水或水性介质与有机溶剂的混合液例如在使用化合物(I-b)时优选使用。水性介质有培养本发明的细胞的培养液、以及培养得到的培养液。将化合物(I-a)或化合物(I-b)添加到介质中时，可以将化合物(I-a)或化合物(I-b)溶解于可溶解化合物(I-a)或化合物(I-b)的水、水性介质或有机溶剂、或者水或水性介质与有机溶剂的混合液中，然后添加到介质中。有机溶剂只要不阻碍反应即可，例如可使用丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二曱苯、曱醇、乙醇、丁醇等。使用培养本发明的细胞的培养液作为介质时，在培养开始前可以预先将化合物(I-a)或化合物(I-b)添加到培养液中，也可以在培养中或培养结束后将化合物(I-a)或化合物(I-b)添加到培养液中。将化合物(I-a)或化合物(I-b)添加到培养液中时，化合物(I-a)或化合物(I-b)可以在培养的起始或中途、每lml培养基中添加0.1-10mg、优选0.2-1mg。化合物(I-a)或化合物(I-b)优选溶解于水或甲醇、乙醇等有机溶剂中之后再添加到培养液中。在制备本发明的化合物(II-a)或化合物(II-b)的方法中，所使用的酶源的量根据其比活性等而不同，例如使用细胞的培养物或其处理物作为酶源时，1mg化合物(I-a)或化合物(I-b)中添加湿重量5-1000mg、优选10-400mg。反应优选在20-50。C下进行，特别优选在25-37。C下进行。反应时间根据所使用的酶源的量和比活性等而不同，通常为2-150小时，优选6-120小时。化合物(I-b)或化合物(II-b)可通过下述所列举的内酯的开环方法，分别容易地转化成化合物(I-a)和化合物(II-a)。化合物(I-b)或化合物(II-b)还可以通过下述所列举的内酯的生成方法分别容易地转化成化合物(I-b)和化合物(11七)。内酯的开环方法有将化合物(I-b)或化合物(II-b)溶解于水性介质中，添加酸或碱进行开环的方法。水性介质例如有水、磷酸緩冲液、Tris緩冲液等含有不阻碍反应的盐类的水溶液。该水溶液中可以含有不阻碍反应的浓度的甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。酸有乙酸、盐酸、硫酸等酸，碱有氢氧化钠、氢氧化钾、氨等。内酯的生成方法有将化合物(I-a)或化合物(II-a)溶解于非水系的溶剂中，添加酸或碱催化剂，形成内酯的方法。非水系的溶剂只要是用实质上不含有水的有机溶剂可溶解化合物(I-a)或化合物(II-a)的溶剂均可使用。溶剂例如有二氯甲烷、乙酸乙酯等。催化剂只要是催化内酯化反应、对底物或反应产物没有内酯化以外的作用即可，可以使用任何催化剂。该催化剂有三氟乙酸或对曱苯磺酸等。反应温度没有特别限定，优选0-100。C,特别优选20-80。C。从介质中收集化合物(II-a)和(II-a)可以通过常规的有机合成化学中所使用的方法、例如有机溶剂的提取、结晶、薄层层析、高效液相色谱等进行。本发明的方法所制备的化合物(II)的确认或定量方法只要是可对化合物化合物(n)、优选(n-a)和/或(n-b)进行确认或定量的方法即可，可以使用任何方法，例如可以通过"C-NMR谙、^-NMR谱、质镨、高效液相色谱(HPLC)等方法进行。6.本发明中的化合物各基团的定义在式(I)-(IX)、(XI)、(XIII)和(XV)所示化合物的各基团中，烷基是直链或支链的碳原子数为1-10、优选为l-6的烷基，例如有曱基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、异己基、庚基、4,4-二甲基戊基、辛基、2,2,4-三甲基戊基、壬基、癸基、上述的各种支链异构体等。芳基有苯基、萘基等。取代烷基中的取代基可以相同或不同，可列举l-3个的卣素、羟基、氨基、烷氧基、芳基等。取代芳基中的取代基可以相同或不同，可列举l-3个的卣素、羟基、氨基、烷基、烷氧基等。卤素有氟、氯、溴和碘。烷氧基中的烷基部分与上述烷基定义相同。取代烷基中的芳基与上述芳基定义相同。取代芳基中的烷基与上述烷基定义相同。碱金属表示锂、钠、钾、铷、铯、钫各元素。以下给出本发明的参考例和实施例，但本发明并不受这些实施例的限定。参考例载体质粒的制备以含有来自产氨棒杆菌的启动子区的质粒pFM54-6(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679,2000)作为模板，以含有SEQIDN0.36所示碱基序列的DNA、和含有SEQIDN0.37所示碱基序列的DNA作为引物进行PCR,扩增含有启动子区的0.7kbDNA片段。将该片段用EcoRV和BamHI消化，然后插入到市售的大肠杆菌载体pTZ18R(ProteinEngineering,1,67-74,1986)的HincII-BamHI区,得到质粒pRI107。将该质粒用EMl和BamHI消化,将所得的约0.7kb的Pstl誦BamfflDNA片段导入到pCS299P(WO00/63388)的Sse8387I誦BamHI区,得到pRI109。实施例l反应底物的制备将IOOmg化合物(VII-b)O夕't公司制)溶解于9.5ml曱醇中，然后加入0.5ml1mol/L氬氧化钠，在室温下振荡l小时。将所得反应液干燥固化，加入5ml去离子水进行溶解，然后使用约O.lml的lmol/L盐酸，将pH调节至约pH6.5-7.5，再加入4.9ml去离子水，得到10ml终浓度为10mg/ml的化合物(VII-a)[式(XIII)中，W为钠的化合物]。实施例2pRIyjiB和pSYN2-39的获得以pWyjiB(WO00/44886以及对应的US7049111、EP1148122)为才莫板，使用含有SEQIDN0.38所示碱基序列的DNA和含有SEQIDN0.39所示碱基序列的DNA作为引物对，进行PCR。PCR是在96。C下保温1分钟，然后将含有95。C30秒、50。C45秒、72°C3分钟的步骤进行25次，然后在72。C下保温10分钟进行。通过该PCR,可以得到约1.4kb的扩增DNA片段。将该DNA片段用SalI和BamHI切断，然后与同样用SalI和BamHI切断的pRI109连接。使用电穿孔法，将连接的重组体DNA导入到大肠杆菌DH5a中。从大肠杆菌中分离所得质粒，通过电穿孔法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032抹中。如下测定10抹所得转化体的各抹的由化合物(VII-a)转化为化合物(vm-a)的转化活性。即，将各抹接种于装入了3ml含有100ng/ml卡那霉素的KM102培养基(2%普通肉汤、0.5%酵母提取物)的试管中，在30。C下培养过夜。将所得培养物中的0.5mL添加到装入了5ml含有100昭/ml卡那霉素的LMC培养基[3%葡萄糖、0.1%NH4C1、0.1%KH2PO4、0.3%K2HP04、0.01%MgS04.7H20、0.05%酵母提取物、1%玉米浆、2mg/LFeS04、2mg/LMnS04、50i!g/L生物素、0.05mg/L硫胺素(pH7.2)]的试管中，在30。C下振荡培养5小时，然后添加实施例l中制备的化合物(VII-a),使终浓度为500mg/L,再在3(TC下振荡培养6小时。将所得培养物中的0.5ml转移至1.5ml离心管中，以15,000rpm离心2分钟，分离菌体。将所得上清部分用曱醇稀释至5-20倍，以15,000rpm离心2分钟，然后将一部分进行HPLC分析[柱Inertsil0DS-2(5(xm，4x250mm,、-一工A廿4工；/义社制)、柱温60°C、流动相乙腈:水:磷酸=55:45:0.05,流速0.9ml/分钟，检测波长237nm],对化合物(VIII-a)(式(XV)中，W为钠的化合物)进行定量。选择转化活性最高的株[化合物(Vm-a)的生成量为56mg/L,转化率16°/。],将该林命名为ATCC13032/pRIyjiB。根据由该抹提取的质粒pRIyjiB,进一步使SD序列与起始密码子的距离最佳化，制备将yjiB基因的N末端一侧第2、3、4和7密码子变更为适合谷氨酸棒杆菌的密码子的表达质粒。接着，以pRIyjiB为模板，使用含有SEQIDNO.40和39所示碱基序列的DNA作为引物对进行PCR。PCR是在96。C下保温1分钟，然后将95。C30秒、50。C45秒、72。C3分钟的步骤进行25次，然后在72。C下保温10分钟进行。通过该PCR得到约1.4kb的扩增DNA片段。将该DNA片段用Xhol和BamHI切断后，与用SalI和BamHI切断的pRI109连接，得到重组体DNA。用电穿孔法将该重组体DNA导入到大肠杆菌DH5a中，获得转化体。从该转化体中分离质粒，使用电穿孔法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032林中。将30抹所得转化体与上述同样地培养，测定由化合物(VII-a)转化为化合物(vm-a)的转化活性，选择转化活性最高的抹[化合物(Vin-a)的生成量80mg/L,转化率28%]，将该林所保持的质粒命名为pSYN2-39,将该抹命名为ATCC13032/pSYN2-39。实施例3使用限制酶进行的变异位点的分离在确定实施例2所得的pRIyjiB和pSYN2-39的yjiB基因的编码区的碱基序列时，与公知的yjiB基因的碱基序列相比，表明分别有2个碱基、8个碱基不同。这些变异表示在表l中。以下碱基的位置是分别将yjiB基因的翻译起始密码子ATG的A、氨基酸残基的位置是将yjiB基因所编码的蛋白质的N末端的Met(SEQIDN0.4所示氨基酸序列中的第l号Met)作为l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>研究这些变异对于转化活性的影响。首先，将与pSYN2-39相同结构的无变异型的yjiB基因插入到pRI109中，制备质粒。以枯草芽孢杆菌168抹的染色体DNA(WO00/44886)为模板，使用含有SEQIDN0.38和39所示碱基序列的DNA作为引物对，进行PCR。PCR是在96。C下保温1分钟，然后将含有95。C30秒、50。C45秒、72。C3分钟的步骤进行25次，之后在72。C下保温10分钟进行。通过该PCR，得到了约1.2kb的扩增DNA片段。将该DNA片段与pT7blue(Novagen社制)连接，将得到的重組体DNA用电穿孔法导入到大肠杆菌DH5a中。由所得转化体中提取质粒，确定质粒yjiB基因的编码区的碱基序列，确认没有变异。将该质粒用SalI和Bamffl切断,将所得的含有yjiB的约1.2kb的DNA片段与用SalI和BamHI切断的pRI109和pBluescriptIISK+连接，获得重组体DNA,分别命名为pN9和pN9SK。将pN9SK的Clal-Bamffl部分替换为pRIyjiB的相应部分，得到pN5SK,还将pN5SK的SalI-BamHI片段导入到pRI109中,制备pN5。接着，以pSYN2-39为模板，使用含有SEQIDNO.40和39所示碱基序列的DNA作为引物对，进行PCR,扩增yjiB区域。将所得的1.2kb的DNA片段与pT-Blue(Novagen社制)连接，获得重组体DNA。确定该重組体DNA的碱基序列，确认保持了pSYN2-39所具有的变异，然后将该重组体DNA的SalI-BamHI片段与pRI109和pBluescript11SK+连接，获得重组体DNA，分别命名为pNl和pNlSK。通过将pNlSK、pN5SK和pN9SK的Clal-BamHI片段或EcoRI國BamHI片段分别交换，可得到命名为pNlC9SK、pN9ClSK、pNlE9SK和pN9ElSK的质粒，再将这些质粒的含有viiB部分的SalI-BamHI片段导入到pRI109中，获得命名为pNlC9、pN9Cl、pNlC5、pNlE9和pN9El的质粒。将pNl、pN5以及pN9的DraI-BamHI区域与pNlSK、pN5SK、pN9SK的对应区域置换，获得命名为pNlD9、pNlD5、pN9Dl和pN5D9的质粒。再将pNlC9和pNlC5的DraI-Bamffl区与pNl交换,得到命名为pNlC9Dl和pNlC5Dl的质粒。还将DNlC9SK和pNlC5SK的EcoRI-BamHI片段与pNl置换，得到了命名为pNlC9ElSK和pNlC5El的质粒，再将这些质粒的含有yjiB部分的SalI-BamHI片段导入到pRI109中,获得命名为pNlC9El和pNlC5El的质粒q存在于与上述质粒所具有的yjiB基因对应部分的变异点和限制酶切位点的位置关系如图2所示。上述得到的pNl、pN5、pN9、pNlC9、pNlC5、pNlE9、pNlD9、pNlD5、pN9Cl、pN9El、pN9Dl、pN5D9、pNlC9Dl、pNlC5Dl、pNlC5El和pNlC9El通过电穿孔法可分别导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中。将所得转化体按照与实施例2同样的方法培养，测定由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的转化活性。结果如表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>变异点表中的O表示具有上段所示的氨基酸残基的变异，-表示不具有。消耗化合物(VII-a):从500mg/L添加量中减去反应终止时的残留化合物(VII-a)所得的值。转化率生成化合物(VIII-a)的量比消耗化合物(VII-a)的量如表2所示，8个变异具有使yjiB基因产物导致的由化合物(VII-a)转化为(VIII-a)的转换反应的转化率和转化速度改变的效果，变异效果具有叠加性。例如，与野生型yjiB(pN9)相比，具有QllP变异的pNlC9显示高转化率，由此可知该变异具有提高转化率的效果。另一方面，pN5具有V104A和F232L变异，与pN9相比，化合物(VIII-a)的生成量多，由此可知具有提高转化速度的效果。结合具有这些变异的pN1C5同时兼具高转化率和转化速度两性质。作为另一个例子，将pNlC9与pNlE9相比，则转化速度、转化率稍微降低，可以认为在pNlE9中所含的N83S和V104A两者或其中一方是有害变异。只具有V104A变异的pN5D9与野生型相比，转化率稍微降低，但转化速度提高。因此，可以推定N83S是有害或者是无效变异。事实上，从pNl中只除去该变异得到的pNlC5E1显示与pNl同等的成绩。pSYN2-39cod的制备如下，在棒状杆菌中表达的密码子。首先，使用DNA合成仪合成SEQIDNO.10-33所示的序列。接着，将含有SEQIDNO.10-13所示石咸基序列的DNA退火，将所得约200bp的DNA片段用SalI和HindIII消化,然后导入到市售的大肠杆菌载体pUC119的SalI-HindIII位点,获得pSCl。再将含有SEQIDNO.14-19所示碱基序列的DNA退火，将所得约280bp的DNA片段用SphI和HindIII进行消化，然后插入到dSC1的SDhI-HindIII位点，获得pSC2。接着，将含有SEQIDNO.20-23所示碱基序列的DNA退火，将所得约200bp的DNA片段用Sail和BamHI消化，然后导入到pUC119的SalI-BamHI位点，获得pSC3。再将含有SEQIDN0.24-27所示碱基序列的DNA退火，将所得约200bp的DNA片段用SalI和EcoRV进行消化,然后插入到pSC3的SalI-EcoRV位点,获得pSC4。再将含有SEQIDN0.28-33所示碱基序列的DNA退火，将所得约200bp的DNA片段用SalI和Eco811消化，然后导入到pSC4的SalI-Eco81I位点，获得pSC5。最后，将pSC2用SalI和BglII进行消化,然后将所得约490bp的DNA片段导入到pSC5的SalI-BglII位点，由此制备在pUCl19的SalI画BamHI位点具有约1.2kb的插入序列的质粒pSC6。pSC6的制备过程如图1所示。将pSC6用BamHI和Sail消化,然后取约1.2kb的DNA片段，与用BamHI和Sail消化的pRI109连接,获得pSYN2-39cod。通过电穿孔法(WO00/44886)，将pSYN2-39cod导入到产氨棒杆菌ATCC21264株中。将所得转化林命名为产氨棒杆菌ATCC21264/pSYN2-39cod,如下测定由VII-a转换为化合物(VIII-a)的转化活性。即，将产氨棒杆菌ATCC21264/pSYN2-39cod接种于加入了3ml含有100昭/ml卡那霉素的ASB培养基[5。/o葡萄糖、0.5%(NH4)2S04、0.1%KH2P04、0.1%K2HPO4、0.1%MgS(V7H2O、1%酵母提取物、1°/。聚胨、0.1%尿素、20mg/LFeSO4、40mg/LMnS04、10mg/LZnS04、2mg/LCuS04、20mg/LL-半胱氨酸盐酸盐、15mg/L卩丙氨酸、100mg/L生物素、15mg/L硫胺素、100mg/L腺嘌呤、100mg/L鸟噪呤(pH7.2)]的试管中，在30。C下振荡培养过夜。将所得培养物中的0.2ml添加到加入了1.8ml含有IOO昭/L卡那霉素的APB培养基[4。/。葡萄糖、0.35°/。(NH4)2S04、0.43%KH2PO4、1.45%K2HP04、0.4%MgS04'7H20、2%玉米浆、10mg/LFeS04、4mg/LMnS04、20mg/LZnS04、0.5mg/LCuS04、20mg/LL國半胱氨酸盐酸盐、10mg/L泛酸钓、60pg/L生物素、15mg/L硫胺素、90mg/L腺噪呤、90mg/L鸟嘌呤(pH7.2)]的试管中，在3(TC下振荡培养5小时，然后添加实施例l制备的化合物(VII-b)，使终浓度为500mg/L,再在30。C下振荡培养20小时。与实施例2同样地测定所得培养液中的化合物(Vm-a)和(VII-a)(表3)。化<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>变异点表中的o表示具有上段所示的氨基酸残基的变异，-表示不具有。消耗化合物(VII-a):从500mg/L添加量中减去反应终止时的残留化合物(vn-a)所得的值。转化率生成化合物(VIII-a)的量比消耗化合物(VII-a)的量实施例5第一代变异型基因的制备为了提高由产氨棒杆菌ATCC21264/pSYN2-39cod的由化合物(VII-a)转化为化合物(VII-a)的转换率，通过易错PCR法向相当于pSYN2-39cod中的yjiB基因的基因编码区导入变异。即，以pSC6为模板，使用SEQIDN0.41和42所示碱基序列作为引物对，在含有0.3mmol/LMnCl2的反应液中进行PCR。PCR是在96。C下保温l分钟，然后将含有95。C30秒、58。C30秒、72。C2分钟的步骤进行25次，然后在72。C下保温10分钟进行。通过该PCR,获得了向约1.2kbDNA的部分随机导入变异的DNA片段。将该DNA片段用SalI和BamHI切断后，与用SalI和BamHI切断的pSYN2-39cod的载体部分连接，制备重组体DNA,^使用电穿孔法将该重组体DNA导入到大肠杆菌DH10B中。用96孔滴定板(夕^夕一:/V—h)、在LB培养基(l。/o细菌用胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1。/。NaCl)中分别培养所得转化株的集落，然后将培养物混合，用碱法提取质粒。将保有该随机变异基因的质粒通过电穿孔法导入到产氨棒杆菌ATCC21264株中，制备具有导入了随机变异的基因的重组林文库。将上述文库的各林通过实施例4的方法培养，测定由化合物(VII-a)转化为化合物(vm-a)的转化活性。将数千林用于反应实验，选择显示高转化活性的4抹。将各株所具有的质粒命名为pEP77、pEP129、pEP139和pEP268。这4林的实验结果如上表3所示。如表3所示，与保有pSYN2-39cod的株相比，转化速度、转化率大幅提高。分别分离pEP77、pEP129、pEP139和pEP268,确定yjiB基因相当部分的编码区的碱基序列。各质粒相对于pSYN2-39cod具有表4所示的变异。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>如表4所示，pEP77、pEP129、pEP139和pEP268所具有的变异包含有利于由化合物(VII-a)转化为化合物(vm-a)的转化效率提高的变异。实施例6第二代变异型基因的制备为了获得具有更高转化效率的变异型pSYN2-39cod，将pEP77、pEP129、pEP139和pEP268所具有的变异进行组合。将pEP77用SalI和Bamffl消化，获得约1.2kb的DNA片段。将其与用SalI和BamHI消化的大肠杆菌的载体pHSG299(夕力才公司制)连接，转化大肠杆菌DH5a,由此制备重组体DNA。按照同样的顺序，将pEP129、pEP139和pEP268中的约1.2kb的MI和BamHI消化DNA片段分别插入到pHSG299的SalI-BamHI位点，分别制备pl29、pl39和p268。将p268用EcoRV和BamHI消化得到约3.7kb的DNA片段；将pl39用EcoRV和BamHI消化得到约0.2kb的DNA片段，将它们连接，制备重组体DNA，使用该重组体DNA转化大肠杆菌DH5a，由此制备p268上的约0.2kb的EcoRV-BamHI区域被来自pl39的EcoRV-BamHI区置换的p268a。按照同样的步骤，将p268a的约0.05kb的NcoI-Hpal区用来自pl39的约0.05kb的Ncol-Hpal区置换,制备p346;将p268a的约0.5kb的BglII-EcoRV区用来自p77的约0.5kb的Bglll-EcoRV区置才灸,制备p509;将p268a的约0.5kb的BglII-EcoRV区用来自p139的约0.5kb的BglII-EcoRV区置换,制备p709;将p268a的约1.4kb的CfrlOI-CfrlOI(—方存在于载体一侧)区用来自pl29的约1.4kb的gf[10I-QiyOI区置换，制备p849。将上述取得的p346、p509、p709和p849分别用SalI和BamHI消化，获得约1.2kb的SalI-BamHIDNA片I殳，与用SalI和BamHI消化的DRI109连接，制备重組体DNA，然后使用该重组体DNA转化大肠杆菌DH5a，由此制备pES346、pES509、pES709和pES849。将上述质粒通过电穿孔法导入到产氨棒杆菌ATCC21264株中，获得转化林。将各转化林用实施例2的方法培养，测定由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的转化活性(表3)。如表3所示，任何林均比保有第一代变异型基因的转化株显示高转化率，表明通过变异的組合可以进一步提高转化效率。实施例7第三代变异基因的制备由实施例3的结果显示，将由pSYN2-39cod所具有的约1.2kb的SalI-BamHI片段所编码的、催化由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的酶的第83号丝氨酸残基置换为天冬酰胺，可能可以提高转化效率。因此，向实施例6制备的质粒中进一步导入该置换变异。以pES346为模板，以含有SEQIDN0.43和44所示碱基序列的DNA作为引物，进行PCR。PCR是在96。C保温1分钟之后，将含有96。C1分钟、58。Cl分钟、72。Cl分钟的步骤进行25个循环，然后在72。C下保温10分钟进行。将该PCR所得的约330bp的扩增DNA片段用Sall-Hpal消化,与pES346所对应的SalI-HpaI部分置换,制备pES78-l。pES78-l中，催化由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的酶的第83号丝氨酸残基变换为天冬酰胺，除此之外与pES346相同。同样，制备pES849-l，该pES849-l是将催化由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的酶的第83号丝氨酸残基变换为天冬酰胺。再将pES503的约0.3kb的Sall-Html区用来自pES78-l的约0.3kb的Sall-Hpal区置换，制备pES503-l。通过电穿孔法，分别将pES78-l、pES849-l和pES503-l导入到产氨棒杆菌ATCC21264抹中，获得转化株。将各转化林按照实施例2的方法培养，测定由化合物(vn-a)转化为化合物(vm-a)的转化活性。结果如上表3所示。如表3所示，将笫83号丝氨酸置换为天冬酰胺的酶、以及将pES78-l和pES849-l所具有的变异进行组合得到的酶使由化合物(VII-a)转换为化合物(vm-a)的转化效率提高。由以上结果表明，通过改变yjiB基因，可以使由化合物(VII-a)转换为(vm-a)的转化速度、转化效率提高，带来这样性质变化的变异具有叠加的效果。因此，推断具有上述各变异的任意组合的酶也具有优异的转化速度或/和转化效率。产业实用性通过使用本发明的蛋白质，可以工业化有利地制备抑制HMG-CoA还原酶、具有血清胆固醇降低作用的化合物。序列表自由文本SEQIDNO.l-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.2-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.3-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.5-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.6-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.7-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.8-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.9-人工序列的说明合成DNASEQIDNO.10-人工序列的说明合成DNASEQIDNO.ll-人工序列的说明合成DNASEQIDNO.12-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.13-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.14-人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.15-人工序歹寸的说明合成DNASEQIDN0.16画人工序列的说明合成DNASEQIDN0.17國人工序列的说明合成DNASEQIDN0.18-人工序歹'J的说明合成DNASEQIDNCU9誦人工序歹'j的说明合成DNASEQIDNO.20-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.21画人工序列的说明合成DNASEQIDN0.22-人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.23國人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.24國人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.25國人工序歹寸的说明.合成DNASEQIDN0.26-人工序歹寸的说明合成DNASEQIDN0.27-人工序列的说明:合成DNASEQIDN0.28-人工序列的说明:合成DNASEQIDN0.29-人工序歹'J的说明合成DNASEQIDNO.30-人工序列的说明:合成DNASEQIDN0.31-人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.32誦人工序列的说明-合成DNASEQIDN0.33-人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.34-人工序歹l！的说明合成DNASEQIDN0.35画人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.36画人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.37隱人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.38-人工序列的说明合成DNASEQIDN0.39-人工序歹'J的说明合成DNASEQIDNO.40誦人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.41國人工序歹'J的说明合成DNASEQIDN0.42國人工序列的说明:合成DNASEQIDN0.43-人工序歹"的说明:合成DNASEQIDN0.44-人工序歹'J的说明:合成DNA权利要求1.蛋白质，该蛋白质具有SEQIDNO.1-3中任一项所示氨基酸序列，但是含有SEQIDNO.4-6所示氨基酸序列的蛋白质除外。2.DNA,该DNA编码具有SEQIDN0.1-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质，但是，编码含SEQIDN0.4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA除外。3.DNA,该DNA具有SEQIDN0.7所示石咸基序列。4.重组体DNA,该重组体DNA含有上述P)或。)的DNA。5.转化体，该转化体是将上述(4)的重组体DNA导入到宿主细胞中得到的。6.权利要求5的转化体，其中，宿主细胞是属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、链霉菌属、曲霉属或青霉属的微生物。7.权利要求5的转化体，其中，宿主细胞是属于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌、浅青紫链霉菌、土曲霉、桔青霉的微生物。8.化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于使权利要求l或2的蛋白质与式(I)所示的化合物[以下称为化合物(I-a)]或式(II)所示的、化合物(I-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(I-b)]接触，[化21]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>(式中，W表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属，R"表示取代或无取代的烷基或芳基)；[化22]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(式中，R卩表示取代或无取代的烷基或芳基)生成式(ni)所示的化合物[以下称为化合物(II-a)]或式(IV)所示的、化合物(II-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(II-b)]，[化23]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式(m)(式中，W表示氩原子、取代或无取代的烷基或碱金属，W表示取代或无取代的烷基或芳基)；[化24]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(IV〉(式中，W表示取代或无取代的烷基或芳基)收集化合物(II-a)或(II-b)。9.化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于在水性介质中，使权利要求5-7中任一项的转化体的培养物或该培养物的处理物与化合物(I-a)或(I-b)接触，使化合物(II-a)或化合物(II-b)在该介质中生成并蓄积，由该介质收集化合物(II-a)或化合物(n-b)。10.权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(V)所示的化合物[以下称为化合物(III-a)]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(式中，W表示氩原子、取代或无取代的烷基或石咸金属，112表示取代或无取代的烷基或芳基)，[化25]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>[化26]式(v丄)(式中，RS表示取代或无取代的烷基或芳基)，化合物(II-a)是式(VII)所示的化合物[以下称为化合物(IV-a)]:[化27〗<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(vn)(式中，W表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属，W表示取代或无取代的烷基或芳基)，化合物(n-b)是式(vm)所示的化合物[以下称为化合物(iv-b)]:[化28]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(vm)(式中，W表示取代或无取代的烷基或芳基)。11、权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(IX)所示的化合物[以下称为化合物(V-a)]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>[化29](式中，W表示氬原子、取代或无取代的烷基或4^金属)，化合物(I-b)是式(X)所示的化合物[以下称为化合物(V-b)]:[化30]式(X)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物(II-a)是式(XI)所示的化合物[以下称为化合物(VI-a)]:[化31]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(式中，W表示氢原子、取代或无取代的烷基或4^金属),[化32]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式(xn)12、权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(XIII)所示的化合物[以下称为化合物(VII-a)]:[化33]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式(xm〉(式中，W表示氬原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，化合物(I-b)是式(XIV)所示化合物[以下称为化合物(VII-b)]:[化34]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式(XIV)化合物(II-a)是式(XV)所示的化合物[以下称为化合物(Vin-a)]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(xv)(式中，w表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，化合物(n-b)是式(xvi)所示的化合物[以下称为化合物(vm-b)]:13.权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(n-b)是由化合物(II-a)形成内酯得到的化合物(n-b)。14.权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(n-a)是使化合物(II-b)的内酯开环得到的化合物(II-a)。15.权利要求io的制备方法，其中，化合物(m-b)是由化合物(m-a)形成内酯得到的化合物(III-b)。16.权利要求10的制备方法，其中，化合物(IV-a)是使化合物(IV-b)的内酯开环得到的化合物(IV-a)。17.权利要求ll的制备方法，其中，化合物(V-b)是由化合物(V-a)形成内酯得到的化合物(V-b)。18.权利要求ll的制备方法，其中，化合物(IV-a)是使化合物(VI-b)的内酯开环得到的化合物(IV-a)。19.权利要求12的制备方法，其中，化合物(vn-b)是由化合物(vn-a)形成内酯得到的化合物(VII-b)。20.权利要求12的制备方法，其中，化合物(VIII-a)是使化合物(Vin-b)[化36]的内酯开环得到的化合物(vni-a)。21.权利要求9-12中任一项的制备方法，其中，转化体培养物的处理物是培养物的浓缩物、培养物的干燥物、培养物的冻干物、由培养物得到的菌体，选自该菌体的干燥物、该菌体的冻干物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎物、该菌体的溶剂处理物的菌体处理物，菌体的蛋白分级产物，以及选自菌体和菌体处理物的固定化物的处理物。22.蛋白质的制备方法，其特征在于将权利要求5-7中任一项的转化体在培养基中培养，使权利要求l的蛋白质在培养物中生成并蓄积，由该培养物中收集该蛋白质。全文摘要本发明提供使用具有SEQIDNO.1-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质(含有SEQIDNO.4-6所示氨基酸序列的蛋白质除外)、以及编码具有SEQIDNO.1-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(编码含有SEQIDNO.4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA除外)的、抑制IMG-CoA还原酶、具有血清胆固醇降低作用的化合物的工业上有利的制备方法。文档编号C12N1/15GK101351551SQ20068004961公开日2009年1月21日申请日期2006年11月29日优先权日2005年11月29日发明者前田匡毅,桥本信一,米谷良之申请人:协和发酵工业株式会社