专利名称：：嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒(chimerictymovirus-likeparticles,TVLP)，其含有由酸浆斑点芜菁黄花叶病毒组(Physalismottletymovirus,PhMV)的结构蛋白和病毒或激素的肽/抗原决定簇构成的融合蛋白。这些嵌合TVLP被用作抗原。本发明提供了一种从被疫苗接种的动物区分FMDV感染的动物的高度有效手段。本发明还涉及所述嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒用于诊断目的的应用。
背景技术：
：口蹄疫(FMD)是诸如牛、绵羊、山羊和猪等偶蹄动物的传染性最强的急性病毒疾病之一(Brown,2003)。FMD是由口蹄疫病毒(FMDV)所造成的，FMDV属于微小RNA病毒科(Picornaviridae)的口疮病毒属(Aphthovims)。空气传播是常见的传播方式，而该疾病也会随着污染物传播。通过在非流行国家的扑灭方法和通过在流行国家的接种疫苗来控制FMD(Gmbman和Baxt，2004)。目前常规的疫苗是灭活的全病毒制备剂(Doel，2003)。区分被接种疫苗的动物与被感染的动物中所存在的困难使得许多国家不采用FMD接种疫苗的策略作为主要的控制方法。如果在疾病的爆发过程中，非流行国家能够考虑疫苗接种作为控制的方法，则使用可靠和精确的诊断测试来区分被接种疫苗的动物与被感染的动物是必要的。被接种疫苗的动物中主要诱导针对FMDV结构蛋白的抗体，而被感染的动物产生针对结构蛋白和非结构蛋白(NSP)的抗体(Sim等人，2004)。因此，证明针对非结构蛋白的抗体的检验具有区分被感染的动物与被接种疫苗的动物的潜力。已经证明针对聚蛋白3ABC的抗体是FMDV感染的最可靠标记物。利用在大肠杆菌(E.coli)或杆状病毒中所产生的重组蛋白的ELISA被用于区分被接种疫苗的动物与被感染的动物(DeDiego等人，1997;Mackay等人，1998;Sorensen等人，1998;Shen等人，1999;Kitching.，2002;Chung等人，2002;Clavijo等人，2004a，2004b;Sorensen等人，2005;Robiolo等人，2005;Niedbalski，2005)。还对2C和3D多肽的特异性进行了测试，但是发现与3ABC多肽相比敏感度低(Sorensen等人，1998;JaeKuOem等人，2005)。Shen等人(1999)使用含有FMDV非结构蛋白的B细胞抗原决定簇的合成肽，并且报道针对2C肽的免疫反应性主要针对来自该蛋白质N末端区域的B细胞抗原决定簇。最近，将重叠合成肽用于鉴定FMDV感染特异性的线性B细胞抗原决定簇，以区分被感染的牛与被接种疫苗的牛(Hohlich等人，2003;Sun等人，2004)。Shen等人(1999)使用基于合成的长肽(57个氨基酸)的间接ELISA，但是合成长肽是困难的。因此，Hohlich等人(2003)建议20个氨基酸的短肽，由于与固体表面的结合力弱，因此所述短肽具有固有的问题。这是影响使用合成肽作为抗原的固相免疫测定的效率和敏感度的主要因素。除非明确说明，在本说明书中所提到的所有专利、专利申请(以及对其所公布的所有专利，以及所有公开的相应外国专利申请)和出版物的公开内容以参考的方式引入本文。然而需要明确的是，这并不是承认这里以参考方式引入的任何文件教导或公开了本发明。
发明内容本发明涉及嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒(TVLP)，其包含由第一蛋白质和第二蛋白质所构成的融合蛋白，所述第一蛋白质是截断的芜菁黄花叶病毒组外壳结构蛋白。第二蛋白质可以是病毒或激素的肽/抗原决定簇。这些嵌合TVLP可以用作抗原。本发明还提供了用于区分口蹄疫病毒(FMDV)感染的动物与被接种疫苗的动物的高度有效手段。本发明还提供了一种用于生产嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒的方法，以及一种用于确定FMDV的特异性抗体以区分FMDV感染的动物与被接种疫苗的动物的诊断试剂盒。本发明还涉及所述嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒用于诊断目的的应用。本发明的一个方面是提供嵌合TVLP，其包含由酸浆斑点芜菁黄花叶病毒组(PhMV)的结构蛋白和病毒或激素的肽/抗原决定簇构成的融合蛋白。本发明的另一个方面是提供嵌合TVLP，其包含由第一蛋白质和第二蛋白质构成的融合蛋白，所述第一蛋白质是截断的酸浆斑点芜菁黄花叶病毒组(PhMV)外壳蛋白，所述第二蛋白选自由口蹄疫病毒(FMDV)蛋白、犬细小病毒(CPV)外壳蛋白、犬瘟热病毒P35多肽(CDVP35)、促性腺激素释放激素(GnRH)蛋白和它们的组合所组成的组。在另一方面中，本发明提供了一种编码融合蛋白的重组多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34及它们的片段或变体所组成的组。在另一个方面中，本发明是提供一种包含表达盒的重组载体，所述表达盒还包含调控序列和编码融合蛋白的重组多核苷酸序列。在另一方面中，本发明提供了一种生产嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒的方法，其包括a.生产编码融合蛋白的重组多核苷酸序列；b.构建重组载体，所述重组载体包含调控序列和步骤(a)的重组多核苷酸序列；c.用步骤(b)的重组载体转化宿主细胞以生产重组宿主细胞；d.培育步骤(c)的重组宿主细胞以生产嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒；e.纯化步骤(d)的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒。本发明的另一个方面是提供一种用于确定针对FMDV非结构蛋白的特异性抗体的测试试剂盒，所述试剂盒包含a.包含融合蛋白的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，所述融合蛋白选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中所示重组多核苷酸序列所编码的SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9禾口SEQIDNO:11所组成的组；和b.用于检测抗体的试剂。图1:重组质粒pR-PhSET-A的图谱。图2:3B1、3B2、3AB、3D和3ABD的FMDV非结构蛋白(NSP)嵌合构建体的示意图。图3:下列的SDS-PAGE分析a.在大肠杆菌(E.coli)中表达的pRSET-A(阴性对照；NC)、pR-Ph画CP(野生型；WT)、pR-Ph-3Bl、pR-Ph國3B2、pR-Ph画3AB、pR画Ph-3D和pR-Ph-3ABD的未诱导(UI)和诱导(IN)的组分，b.在大肠杆菌(E.coli)中表达的pRSET-A(NC)、pR-Ph-CP(WT)、pR-Ph-3Bl、pR-Ph-3B2、pR-Ph画3AB、pR-Ph-3D和pR画Ph画3ABD的诱导的总组分(T)和可溶组分(S)。M泳道显示标准分子量标记物(MBIFermentas)。图4:嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒Ph-3Bl、Ph-3B2、Ph-3AB、Ph-3D和Ph-3ABD的Western印迹分析。Ph-CP是PhMV野生型空衣壳，其被用作阴性对照。r3AB是在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组3AB，其作为阳性对照。将凝胶进行电印迹，接着使用针对r3AB所产生的兔3AB多克隆抗血清(1:2000)进行探针检测，并使用HRP标记的山羊抗兔抗血清(1:1000)作为二抗。泳道M代表预染的蛋白质分子量标记物(NEB)。图5:嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒的电子显微照片(80X分辨率)A)Ph-3B1D)Ph-3DB)Ph-3B2E)Ph-3ABDC)Ph-3AB具体实施方式本发明涉及嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒(TVLP)，其含有由酸桨斑点病毒(PhMV)的结构蛋白和口蹄疫病毒(FMDV)或任何其他动物/人病毒或激素的3B、3AB、3D和3ABD非结构蛋白的B细胞感染相关抗原决定簇构成的融合蛋白。这些嵌合TVLP被用作抗原，用于区分FMDV感染的动物和接种疫苗的动物。本发明还教导所述嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒用于诊断目的的应用。本发明还涉及生产嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒的方法，以及通过检测所测试血清样品中针对3B、3AB、3D和3ABD非结构蛋白的抗体的存在来开发用于区分FMDV感染的动物和接种疫苗的动物的灵敏、精确的测定。与其它系统相比，植物病毒VLP作为抗原决定簇呈递系统是有利的(1)植物病毒VLP比传统的表达系统制备起来更经济；(2)没有被动物病原体污染的风险；(3)可以非常大规模的生产；(4)具有生产针对不同目的的灵敏特异性诊断试剂盒的潜力；(5)疾病扩散的风险最低或没有；(6)在实验室或者在实地都没有生物安全性的担忧(Johnson,1997;Porta和Lomonossoff，1998)。大多数情况中，对植物、动物感染性病毒进行操作并也将其用作基于VLP的抗原决定簇呈递系统而用作疫苗候选物。将VLP用于检测风疹病毒和猪肠道病毒(Keros和Enders，1997;Guo等人，2001)。据我们所知，还没有开发出基于VLP抗原决定簇呈递系统的诊断试剂盒。这是首次报道芜菁黄花叶病毒组VLP(TVLP)能够呈递TVLP表面上的FMDV3B、3AB、3ABD和3D非结构性抗原决定簇(蛋白质/肽)，并且这些嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒可以用于通过ELISA成功地区分FMDV感染的动物与未感染的或接种疫苗的动物。在一个实施方式中，本发明提供了一种含有融合蛋白的嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述融合蛋白还包含第一蛋白质和第二蛋白质，所述第一蛋白质是截断的芜菁黄花叶病毒组外壳蛋白。在另一个实施方式中，本发明提供了一种含有融合蛋白的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，所述融合蛋白由第一蛋白质和第二蛋白质构成，所述第一蛋白质是截断的芜菁黄花叶病毒组外壳蛋白，其中所述芜菁黄花叶病毒组选自由酸浆斑点病毒、颠茄斑点病毒(BelladonnaMottleVirus)、芜菁黄花叶病毒(TurnipYellowMosaicVirus)、可可树黄花叶病毒(CacaoYellowMosaicVirus)、蝶豆黄脉病毒(ClitoriaYellowVeinVims)、金钱草黄斑点病毒(DesmodiumYellowMottleVirus)、茄子花叶病毒(EggPlantMosaicVirus)和西番莲果黄花叶病毒(PassionFruitYellowMosaicVirus)所组成的组。在另一个实施方式中，本发明提供了一种由第一蛋白质构成的嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒，所述第一蛋白质是截断的芜菁黄花叶病毒组外壳蛋白，其中所述芜菁黄花叶病毒组是酸浆斑点病毒(PhMV)。在另一个实施方式中，本发明提供了一种嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其含有由第一蛋白质和第二蛋白质构成的融合蛋白。另一个实施方式提供了一种包含第一蛋白质和第二蛋白质的融合蛋白，所述第一蛋白质是截断的芫菁黄花叶病毒组外壳蛋白，其中所述第二蛋白质选自由口蹄疫病毒(FMDV)蛋白、犬细小病毒(CPV)外壳蛋白、犬瘟热病毒P35多肽(CDVP35)、促性腺激素释放激素(GnRH)和它们的组合所组成的组。在另一个实施方式中，本发明提供了一种截断的芫菁黄花叶病毒组外壳蛋白，其含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列中的至少149个连续氨基酸，所述SEQIDNO:1是由包含SEQIDNO:2所示至少447个连续核苷酸的多核苷酸序列或其片段或其变体所编码的。本发明的另外一个实施方式中，所述融合蛋白具有选自由SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31和SEQIDNO:33所组成的组的多肽序列，所述多肽序列是由选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32和SEQIDNO:34所组成的组的重组多核苷酸序列所编码的。本发明的其他实施方式提供了选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10禾nSEQIDNO:12所示的重组多核苷酸序列所编码的SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11组成的组的融合蛋白。本发明的另外一个实施方式公开了编码所述融合蛋白的重组多核苷酸序列，其中所述重组多核苷酸序列选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、其片段或变体所组成的组。本发明的另外一个实施方式提供了一种包含表达盒的重组载体，所述表达盒还包含调控序列和重组多核苷酸序列。所述调控序列选自由T7、SP6和T3所组成的组。在另一个实施方式中，本发明提供了一种重组载体，其选自由pR-Ph-CP、pR-Ph-3Bl、pR-Ph-3B2、pR隱Ph画3AB、pR-Ph-3D、pR-Ph-3ABD、pR-Ph画VPl-Cl、pR-Ph画VPl-C2、pR-Ph-VPl画C3、pR-Ph-IC-Cl、pR画Ph-IC-C2、pR-Ph画IC-C3、pR-Ph-CPVl、pR-Ph-CPV2、pR画Ph-CPV3、pR-Ph-CPV4和pR-Ph-CPV5所组成的组。在一个实施方式中，本发明提供了一种包含所述重组载体的宿主细胞。所述宿主细胞选自由大肠杆菌(E.coli)、酵母和杆状病毒组成的组。在另一个实施方式中，本发明提供了大肠杆菌(E.coli)菌株，其选自由JM101、DH5ouBL21、HBIOI、BL21(DE3)pLysS、XL-1Blue和Rossetta所组成的组。在一个实施方式中，本发明涉及一种生产嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒的方法，所述方法包括(a)生产重组多核苷酸序列；(b)构建重组载体，所述重组载体包含调控序列和步骤(a)的重组多核苷酸序列；(c)用步骤(b)的重组载体转化宿主细胞以产生重组宿主细胞；(d)培育步骤(c)的重组宿主细胞以产生嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒；(e)纯化步骤(d)的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒。在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于确定针对FMDV的特异性抗体的测试试剂盒，所述试剂盒包含(a)包含融合蛋白的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，所述融合蛋白选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:lO禾nSEQIDNO:12中所示重组多核苷酸序列所编码的SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11所组成的组；和(b)用于检测抗体的试剂。PhMV是一种小球型植物病毒，是首次由^10^^&Fries(1974)在美国Iowa分离的正链RNA病毒的芜菁黄花叶病毒组属(tymovimsgenus)的成员。正义RNA基因组被包装在由180个相同的CP(20,000kDa)拷贝按照T=3二十面体对称排布所组成的蛋白质衣壳中，其中有3个不同的结合模式。根据所述结合相互作用，化学上相同的亚基被称作A、B和C。5个A型亚基在二十面体12.5次轴上形成五聚体(总共60个亚基)，B和C型亚基在20个二十面体三次轴上形成六聚体(120个亚基)。PhMV与其它芫菁黄花叶病毒组的外壳蛋白序列的比较显示其与颠茄斑点病毒(E)具有52%的同一性，与芜箐黄花叶病毒(TYMV)具有33%的同一性，这显示PhMV(之前被称作颠茄斑点病毒I)是独特的芜菁黄花叶病毒组(Miraet等人，1997;1999)。PhMV具有下列优点(1)基因组小；(2)容易操作；(3)与稳定转染植物的再生相比纯化简单并且快速。在大肠杆菌(E.coli)中PhMV的外壳蛋白非常好地表达为空衣壳，其达到(1)最高达每升培养物100150mg的产率；(2)批次之间的变化是零，因为对于衣壳的完整性来说，会以相似的方式维持对所组装衣壳的每个和每次确认；(3)在4.29.0的宽pH范围内重组Ph-CP是稳定的，并且对于最高达4M的尿素也是稳定的；(4)容易纯化空衣壳；(5)组装空衣壳的机制得以充分研究；以及(6)宿主范围非常窄(Mira等人，1997;1999)。使用ELISA对嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒Ph-3AB进行检测以区分被感染的动物与未感染的或接种疫苗的动物。用ELISA对从被感染的动物收集(通过病毒分离)康复期血清样品进行测试，所有的血清与嵌合TVLPPh-3AB充分反应。从未试验过(naive)的动物收集的未感染样品并不与嵌合TVLPPh-3AB反应。所产生的重组抗原对于区分被感染的动物和未感染的动物(接种疫苗的动物或非感染动物)是有用的。还使用ELISA测试了其他嵌合TVLP。抗原的现成、便宜和安全的可用性，简单间接EUSA法的适宜性可以用于1)快速检测载体动物存在或不存在接种疫苗；2)监控FMDV根除程序的进程；以及3)在实施接种疫苗的区域进行流行病学调査。该方法与对植物进行基因转化不同，在对植物进行基因转化时，需要将所感兴趣的基因整合到植物基因组中，并使用基于植物病毒的载体作为输送目的的平台。考虑到生物安全性检测，VLP是安全的，因为没有感染性生物传播的风险。这种方法不需要开发用于对基因组进行操作的感染性cDNA克隆。从GenBank鉴定编码酸浆斑点病毒(PhMV)的DNA序列，其EMBL索取号为S97776(Jocob等人，1992)。截断的PhMV外壳蛋白由野生型PhMV外壳蛋白的159175个氨基酸残基构成。使用本领域中熟知的方法合成生产外壳蛋白。根据现有信息(Hohlich等人，2003;Sun等人，2004)鉴定FMDV非结构蛋白3ABD的B细胞感染相关抗原决定簇。在实验室中使用本领域中熟知的方法合成编码蛋白质3ABD(SEQIDNO:11)的核苷酸序列(SEQIDNO:12)。编码该蛋白质的DNA序列是如在SEQIDNO:ll中所示的序列。实施例1中提供了详细的程序。在用于克隆和表达的质粒载体如pRSET-A、pPCR、pQE、pET系列和pGEX中克隆编码以下物质的基因，所述物质为FMDV的不同抗原决定簇例如3B(SEQIDNO:4禾卩6)、3AB(SEQIDNO:8)、3D(SEQIDNO:10)和3ABD(SEQIDNO:12);FMDVVPl的抗原性抗原决定簇(SEQIDNO:14、SEQIDNO:16和SEQIDNO:18)、促性腺激素释放激素(GnRH)SEQIDNO:20、联合CDVP35的GnRH(SEQIDNO:22和SEQIDNO:24)以及犬细小病毒(CPV)的抗原性肽(SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32和SEQIDNO:34)。所有的构建体都是合成制备的，其中Ndel位点在5'末端，接着是这些抗原决定簇的不同组合作为串联重复(之间具有甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGS)连接子)，以及一部分符合读码框的野生型PhMVCP序列，直到在3'末端的Kpnl位点。实施例2中描述详细的程序。将重组载体即pR-Ph-CP、pR-Ph-3Bl、pR-Ph-3B2、pR-Ph-3AB、pR-Ph-3D和pR-Ph-3ABD转化到宿主细胞中，所述宿主细胞选自由大肠杆菌(E.coli)、酵母和杆状病毒组成的组。详细内容参见实施例3。在适当的培养基中培育含有重组载体的宿主细胞，以进行融合蛋白的过表达(参见实施例4、10和11)，并纯化融合蛋白(实施例5)。用于过表达和纯化融合蛋白的方法是本领域中熟知的。通过本领域中熟知的各种方法对嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒(TVLP)进行免疫学表征。实施例6中提供了详细的程序。己经进行了ELISA以核査PhMVTVLP表面上动物病毒蛋白或激素的展示。进一步，进行Western印迹以核查嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒(TVLP)的特异性。使用透射电子显微镜术对嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒(TVLP)进行表征研究(参见实施例7)。进行间接ELISA以使用嵌合TVLP从接种疫苗的动物中检测FMDV感染的动物。在针对不同血清的间接ELISA模式中，筛选不同的PhMV嵌合抗原即Ph-3B1、Ph-3B2、Ph-3AB、Ph-3D和Ph-3ABD。还包括野生型PhMV抗原和重组大肠杆菌(E.coli)细胞表达的重组抗原Ph-3AB，它们分别作为阴性和阳性抗原对照。实施例8中提供了详细的程序。FMDV是微小RNA病毒科的成员。病毒基因组由正义8.5kbssRNA构成，其被包装在二十面体衣壳内，所述二十面体衣壳由每种60个拷贝的四种结构蛋白构成，所述四种结构蛋白被称作VP1、VP2、VP3和VP4，它们是P1聚蛋白的二级切割产物。在它们中，VP1是免疫显性区，其含有3个重要的抗原位点。衣壳蛋白VP1的B细胞和T细胞抗原决定簇的精确定位已经被确定在氨基酸残基21-40、135-160和200-213的侧翼。进行FMDV-VP1结构蛋白抗原决定簇的表达分析。实施例9中提供了细节。免疫去势是手术去势方法的一种替代。促性腺激素释放激素(GnRH)，一种从下丘脑神经元产生的非常小的十氨基酸蛋白质。这是一种差的抗原，并且需要偶联到载体蛋白上。抗GnRH疫苗被用于降低猪脂肪组织中粪臭素和雄酮的积累，所述粪臭素和雄酮的积累会引起猪肉中的公猪膻味。犬瘟热病毒P35(CDVP35)是融合蛋白的T细胞抗原决定簇，并且显示当与GnRH偶联时会非常有效地引发公狗中的抗GnRH抗体。引入对GnRH特异性的高滴度抗体与精巢的衰退相关。抗GnRH疫苗在癌症治疗中具有潜在应用，所述癌症包括乳癌和前列腺癌。进行了促性腺激素释放激素的表达分析。实施例10中提供了详细的程序。犬细小病毒(CPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)内细小病毒属(Parvorirus)的猫细小病毒亚组。其在犬中引起重要的疾病，并且在全世界流行。犬中CPV感染的特征在于多种严重程度的肠炎，并且通常伴随相关的淋巴细胞减少症(lymphopoenia)。在最高达到16周龄的小狗中出现急性心肌炎，并造成5080%的死亡率。目前的疫苗是基于减毒的活病毒。该病毒的局限性是在小狗中，从母亲获得的抗体阻碍保护性免疫的发展。如果将重组VP2衣壳用作免疫原，则对于重组VP2衣壳也会具有好处。对于这些情况，合成的疫苗或者亚基疫苗可能代表优选的替代方案。衣壳蛋白的抗原决定簇图谱分析显示存在被中和血清识别的许多个抗原位点。分析在大肠杆菌(E.coli)中CPV-VP2抗原决定簇的表达。详细的程序参见实施例11。本发明是重要的，其能够用于呈递其他经济上重要的动物/人病原体抗原决定簇而用于诊断或疫苗或治疗目的。尽管为清楚理解的目的，以说明和例子的方式已经详细描述了前面的发明，但对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是根据本发明的教导，可以对本发明进行某些改变和修饰，而不偏离后面所附权利要求的精神和范围。实施例提供后面的实施例用于为本领域普通技术人员提供如何实施和利用本发明的完整的公开内容和说明，所述实施例不是为了对本发明人所认为的发明范围进行限制，也不是意欲表示下面的实验是所进行的全部实验和唯一的实验。实施例1酸浆斑点病毒外壳蛋白基因的合成从GenBank提取编码酸浆斑点病毒(PhMV)外壳蛋白(CP)的DNA序列(EMBL索取号S97776)。合成制备该基因，其中XhoI和HindIII位点分别在5'和3'末端，并且在读码框的末端有终止密码子，而在该基因的开始没有起始密码子。在该外壳蛋白的44和45位氨基酸引入KpnI位点作为沉默突变，用于与异源序列交换。FMDV非结构肽基因的合成合成产生编码作为3B1、3B2、3AB、3D和3ABD以及连接子的串联重复的抗原决定簇的DNA，所述DNA分别由144、198、147、153和165个核苷酸构成，其具有在5'末端的NdeI以及直到在这些基因的3，末端的KpnI位点的一部分PhMV序列。对于所有的嵌合体如FMDV非结构蛋白(NSP)构建体、FMDV-VP1构建体、GnRH构建体和CPV构建体，克隆程序和策略是相同的。合成产生所有多核苷酸序列，并将其克隆到pPCRScript克隆载体中，所述多核苷酸序列含有串联重复、连接子和直到KpnI位点的一部分PhMV序列，并且在5'末端和3'末端具有NdeI和KpnI位点。实施例2重组载体的构建在载体pRSET-A中克隆外壳蛋白(CP)基因合成制备野生型PhMVCP(SEQIDNO:2)，其中XhoI和HindIII位点分别在5'和3'末端，并将其克隆到质粒载体pPCRScript。通过使用XhoI和HindIII进行消化而从pPCRScript载体释放564bp的野生型CP插入序列，并将其克隆到pRSET-A表达载体的XhoI和HindIII位点。为此，使用XhoI和HindIII酶对pRSET-A载体和含有野生型PhMVCP的质粒载体pPCRScript进行限制性酶切。通过凝胶提取方法洗脱野生型PhMV-CP的XhoI和HindIII片段和经限制性酶切的pRSET-A载体，并进行连接。通过本领域中已知的DNA测序方法确认该重组载体中的插入DNA。在这种情况中，读码框从该载体的NdeI位点内的ATG开始，这样野生型外壳蛋白(SEQIDNO:l)具有来自载体骨架的39个额外的氨基酸，并且在Hindin位点之前具有终止密码子。重组CP载体的长度大小是3435bp。该重组载体被称为pR-Ph-CP。被修饰的病毒/激素基因的克隆编码病毒/激素蛋白质的DNA片段在pR-Ph-CP中NdeI和KpnI限制性位点处被交换。编码病毒蛋白的DNA片段可以来自FMDV的3B1、3B2、3AB、3D和3ABD抗原决定簇，编码激素蛋白的DNA片段可以来自GnRH基因。将合成的编码3ABD的DNA序列插入到限制性酶NdeI和KpnI所形成的位点，以产生重组载体。对此，用NdeI和KpnI酶限制性酶切pR-Ph-CP载体和含有3ABD基因的质粒载体pPCRScript。通过凝胶提取方法洗脱3ABD基因的NdeI和KpnI片段和经限制性酶切的pR-Ph-CP载体，并进行连接。重组载体被命名为pR-Ph-3ABD。通过本领域中已知的DNA测序方法确认在该重组载体中的插入DNA。类似的，编码FMDV的3B1、3B2、3AB和3D抗原决定簇、FMDV的VP1抗原决定簇的DNA片段，编码联合有CDVP35抗原决定簇和CPVVP2抗原决定簇的来自GnRH基因的激素蛋白的DNA片段被克隆在pR-Ph-CP中NdeI和KpnI位点。这些重组载体被命名为pR-Ph-CP、pR-Ph-3Bl、pR-Ph-3B2、pR-Ph-3AB、pR-Ph画3D、pR画Ph-3ABD、pR國Ph-VPl-Cl、pR画Ph-VPl-C2、pR-Ph-VPl-C3、pR-Ph隱IC誦Cl、pR-Ph画IC-C2、pR画Ph-IC画C3、pR-Ph画CPVl、pR画Ph-CPV2、pR-Ph-CPV3、pR-Ph-CPV4和pR-Ph-CPV5。将连接混合物转化到大肠杆菌(E.coli)DH5a菌株中。从含有重组载体的大肠杆菌(E.coli)DH5ot菌株分离质粒，并通过测序确认重组体的真实性。将阳性克隆转化到BL-21(DE3)pLysS菌株中用于表达所述融合蛋白。所有的病毒/激素基因插入序列在200-300个核苷酸范围内，并合成制备具有NdeI和KpnI位点，并在NdeI和KpnI消化的载体pR-Ph-CP进行交换，以使部分野生型CP被异源序列所置换，野生型蛋白的其余部分保持在所有的构建体中，而不干扰读码框(图l)。图2代表FMDV非结构蛋白(NSP)嵌合构建体即3B1、3B2、3AB、3D和3ABD，其中用连接子串联的B细胞感染相关抗原决定簇3A、3B、3D和3ABD在PhMV野生型外壳蛋白的N末端部分被置换。实施例3大肠杆菌(E.coli)的转化使用Sambrook等人(1989)所描述的氯化钙法制备大肠杆菌(E.coli)的感受态细胞。为了进行转化，将DH5-a或BL21(DE3)pLysS感受态细胞与DNA在冰上进行混合，接着在42'C短暂热激45秒。将细胞与丰富培养基孵育，并铺板之前在37'C生长3060分钟。为了克隆目的，将含有在T7聚合酶控制下的重组基因的构建体转化到DH5-(x中，但为了表达重组蛋白的目的，需要转化到不同的细菌株BL21(DE3)pLysS中。将重组载体pR-Ph-3ABD转化到大肠杆菌(E.coli)DH5a菌株中以产生重组大肠杆菌(E.coli)细胞。将这些重组大肠杆菌(E.coli)细胞命名为r-Ph-3ABD。类似的，将其他重组载体pR-Ph-3Bl、pR-Ph画3B2、pR-Ph-3AB和pR-Ph-3D转化到大肠杆菌(E.coli)DH5-a菌株中以产生重组大肠杆菌(E.coli)细胞，分别命名为r-Ph-3Bl、r-Ph-3B2、r-Ph-3AB和r-Ph-3D。:合芜菁黄花叶病毒组样微粒在大肠杆菌(E.coli)中的过表达和纯化将重组大肠杆菌(E.coli)r-Ph-3ABD在37。C在适当的培养基中生长过夜。通过离心收获细胞。使用本领域中熟知的方法，从含有不同质粒的重组细胞中分离质粒，所述质粒例如pR-Ph-3ABD、pR-Ph-3Bl、pR-Ph-3B2、pR-Ph-3AB和pR-Ph-3D。通过所描述的碱裂解法(Sambrook等人，1989)进行质粒DNA分离。为了进行表达研究，将pRSET-A载体(阴性对照)、野生型和重组载体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS菌株中。该转化得到具有重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)细胞。使用本领域中熟知的方法，将所述重组大肠杆菌(E.coli)细胞生长在生长培养基中用于表达融合蛋白。将所述融合蛋白命名为Ph-3B1、Ph-3B2、Ph-3AB、Ph-3D和Ph-ABD。使用本领域中熟知的方法分离融合蛋白。使用板凝胶电泳设备采用Laemmli(Laemmli，1970)所描述的不连续缓冲系统进行SDS-PAGE。在整个该研究中，将含有0.1%SDS的1mm厚15%聚丙烯酰胺(30:0.8，丙烯酰胺:双丙烯酰胺比例)凝胶用于蛋白质的电泳分离。将蛋白质样品与等体积的2X样品缓冲液(100mMTris-HClpH6.8，其含有2%SDS，0.02%溴酚蓝、10%P-ME和20%甘油)进行混合，并在95r加热5分钟，并上样到精确的聚丙烯酰胺凝胶的孔中。使用含有0.1%SDS的0.025MTris和0.2M甘油缓冲液(pH8.8)在100V的稳定电压下进行电泳。电泳后，使用考马斯亮蓝将凝胶染色，或者将处理凝胶以用于进行Western印迹。将重组大肠杆菌(E.coli)菌株的单菌落接种到含有100(xg/ml氨苄青霉素和33pg/ml氯霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中。用1%过夜培养物接种5mlLB培养基，37。C生长3小时，并使用0.5mM异丙基-l-硫代-(3-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。两小时之后，收获细胞，并将其重悬浮在500^蒸馏水中。取出一份细胞进行蛋白质分析。将等体积的2xSDS-PAGE上样缓冲液加入到20pl重悬浮的细胞中，并用于通过使用SDS-PAGE分析进行总细胞蛋白的分析(图3)。使用细胞超声仪将剩余细胞超声处理10分钟，并在27，000g离心10分钟，收集可溶组分，并将不可溶组分重悬浮在500pl蒸馏水中。通过SDS(w/v)15%PAGE(Laemmli,1970)对总组分和可溶组分进行分析。如本领域中已知的，进行蛋白质的分析方法。嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒的纯化为了大规模纯化野生型和嵌合TVLP，进行本领域中已知的程序(Mira等人，1997，1998)。将细胞悬浮在50mM拧檬酸钠缓冲液(pH5.5)中，超声处理并将可溶组分进行10。/。(w/v)聚乙二醇(6000)沉淀，接着进行高速超离心(140,000g，3小时)。将沉淀重悬浮在50mM柠檬酸钠缓冲液中，并在10%40%蔗糖梯度上分层。收集光散射区，洗脱并进行超离心(140,000g，3小时)。将所获得的沉淀重悬浮在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)中。通过SDS/15%PAGE(Laemmli，1970)核査嵌合TVLP的纯度。对在大肠杆菌(E.coli)中表达的pRSET-A、野生型、3B1、3B2、3AB、3D、3ABD的未诱导组分、诱导组分，以及pRSET-A、野生型、3B1、3B2、3AB、3D、3ABD的诱导总组分和可溶组分进行SDS-PAGE分析(图3)。泳道M显示标准分子量标记物。所有的重组质粒与野生型PhMV外壳蛋白一起充分表达。诱导蛋白质表达，并将所诱导的蛋白组分与未诱导的组分进行比较(图3A)，在仅表达载体(pRSET-A;阴性对照)的组分中没有观察到表达。将仅载体、野生型CP和嵌合质粒的可溶蛋白组分与总蛋白成分进行比较，发现在可溶组分中存在显著量的蛋白质(图3B)。实施例6嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒(TVLP)的免疫学表征在SDS15。/。丙烯酰胺凝胶上分离野生型和嵌合TVLP，并转移到硝酸纤维素膜上。使用针对r-3AB(在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组3AB)所产生的兔3AB抗血清(1:2000)进行western印迹分析，并且使用HRP标记的山羊抗兔抗血清(1:1000)作为二抗。在存在0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH4.8)中的过氧化氢的情况下，使用二氨基联苯胺(DAB)使印迹显色，所述缓冲液含有痕量的氯化钴。将Ph-3Bl、Ph-3B2、Ph-3AB、Ph-ABD以及阳性对照r3AB与3AB抗血清充分反应。野生型PhMVCP和Ph-3D不与3AB抗血清反应(图4)。实施例7电子显微镜术将野生型CP和嵌合TVLP如Ph-3Bl、Ph-3B2、Ph-3AB、Ph-3ABD和Ph-3D(0.5mg/ml)施加到碳覆网格上，并使用醋酸双氧铀(2%;w/v)进行染色。使用高分辨率电子显微镜(HitachiH7500)在80X的放大倍数下使这些网格可见。在电子显微镜下，嵌合TVLP看上去与野生型PhMV空衣壳(Mira等人，1997)完全一致(图5)。实施例8使用嵌合TVLP进行间接ELISA以区分FMDV感染的动物与接种疫苗的动物使用在碳酸盐-碳酸氢盐包被缓冲液中最佳稀释的纯化嵌合3ABTVLP抗原(40ng/50pl/孔)或野生型的纯化PhMVTVLP抗原(40ng/50p1/L)在4"C孵育过夜对ELISA板进行敏化。对每个样品留出一个孔作为没有抗原的对照。用于ELISA的试剂是本领域中熟知的。在适当的试管中，通过在封闭ELISA稀释剂中以1:5的稀释度制备预稀释液来在4"对所有测试和对照血清进行封闭过夜(40pl封闭缓冲液中10pi血清)。作为替换方式，制备血清并在平板摇动器上37。C孵育2小时。第二天，使用洗涤缓冲液(具有吐温20(0.05%)的磷酸盐缓冲液)对平板进行洗涤，并轻拍干燥。将50pl每种预稀释的封闭血清转移到ELISA板上有记号的孔中。将平板在平板摇动器上37t:孵育1小时。使用洗涤缓冲液对平板进行洗涤，并轻拍干燥。将在封闭ELISA稀释剂中的HRP偶联的抗物种IgG(anti-speciesIgG)的50pl适当稀释液加入到平板中，并在平板摇动器上37X:孵育1小时。接着用洗涤缓冲液对平板进行洗涤，并轻拍干燥。将适当稀释的50pi冰冷色素原/底物混合物即OPD/H202在黑暗中室温下孵育5分钟。使用1MH2S04停止反应。使用ELISA读板器在492nm对平板进行读取。抗原空白孔和含有野生型酸浆斑点病毒VLP抗原的孔必须显示SO.IOO的OD。检测大约100份阴性血清，截留值获自所计算的平均值和标准偏差(SD)。一旦获得了截留值，使用嵌合TVLP3AB测试40份已知的阳性样品(通过在原代器官细胞培养物中进行病毒分离所确认的FMDV载体状态)。测试具有已知FMD史的80份样品。还测试了80份未知史的样品。使用其它嵌合蛋白进行ELISA。该测定清楚显示，根据这些阴性和阳性样品，ELISA是高度特异性的。使用嵌合TVLP区分接种疫苗的动物和被感染的动物(DIVA)FMDV-NSP嵌合TVLP与实验血清样品的反应性在间接ELISA模式中，针对不同的血清筛选不同的嵌合TVLP即Ph-3B1、Ph-3B2、Ph-3AB、Ph-3ABD和Ph-3D。还包括野生型PhMVVLP和大肠杆菌(E,coli)表达的重组3AB(E.colir-3AB)作为阴性和阳性抗原对照。已知牛康复期血清(BCS)是FMDV-NSP抗体的阳性牛血清；测试中还包括从被感染的和未感染的牛来源动物中获得的每一种血清。正常的牛血清被用作阴性对照。还将抗原的反应性与其它血清进行比较，所述其它血清包含针对E.colir-3AB抗原所产生的免疫小鼠和免疫兔血清，而未免疫的小鼠和兔血清则作为对照。所使用的其它对照是生长培养基对照和磷酸盐缓冲液。实验血清Ph-3B1Ph-3B2Ph-3ABPh-3ABDPh-3DPh-CP(野生型)E.colir-3ABO型BCS0.2580.2750.1640.1540.2300.2370.2790.2610.1090.1250.0460.0450.4790.448A型BCS0.1860.2170.0930.1150.1020.1200.1680.1790.0820.0840.0420.0440,3360.271C型BCS0.2980.2970.1820.1720.2290.2360.2910.2800.2530.2850.0460.0460.4860.493ASIA1型BCS0.2790.2620.1440.1460.2200.2250.2340.2480.1220.1190.0450.0460.2460.415已知阳性BS0.2940.3120.1960.1960.2790.2560.2%0.2940.1200.1200.0450.0440.4980.499已知阴性BS0.0430.0420.0470.0460.0440.0420.0510.0440.0420.0460.0400.0430.1740.168正常BS0.0470.0500.0460.0530.0470.0490.0470.0480.0450.0430.0430.0430.0590.0560056005800540068006()005600580.0490.0480.0440.0410.0410.0880.096r-3AB脇0.2980.3230.1440.1380.1830.1880.1940.178O週0.2050.0490.0540.4600.462^3^^7MAb0.1200.1250.1110.1120.1080.1050.1040.1000.0950.0950.0430.0430.3930.441正常MS0.0490.0470.0500.0600.0560.0460.0430.0410.0420.0410.0420.0440.0550.051r-3ABIRS0.3070.3370.1130.1270.1470.1260.1160.1070.1350.1340.059O細0.0970.100r-MVA3AB:S0.4240.4150.1470.1480.1760.1650.1510.1300.1550,1550.0520.0550.083O週正常RS0.0760.0540.0500.0500.0640.0530.0570.0420.0430.0420.0540.0730,0600.056PBS对照0.0650.0620.0710.0630.0560.0580.0560.0500.0520.0490.0490.0680.0520.065注BCS-牛康复期血清；BS—牛血清；IMS-免疫小鼠血清；MAb-单克隆抗体；MS—小鼠血清；IRS—免疫兔血清；RS-兔血清；PBS-磷酸盐缓冲液PhMV嵌合TVLP与不同的血清以不同的灵敏度反应。Ph-3B2、Ph-3AB和Ph-3ABD与所有的血清充分反应。Ph-3B2不与A型BCS、r-3ABIMS、r-3ABIRS和r-MVA3ABIRS(MVA:修饰的安卡拉痘苗(ModifiedVacciniaAnkara))反应。Ph-3D不与除C型BCS和r-3ABIMS外的任何阳性血清反应。使用Ph-3AB和Ph-3ABD抗原与BCS观察到的持续一致反应揭示FMDVNSP抗原决定簇很好地展示在PhMVTVLP的表面上。嵌合TVLP均不与抗3ABMAb3C7单克隆抗体反应。野生型PhMVTVLP不显示与不同血清的任何反应，而E.colir-3AB抗原与除r-MVA3ABIRS外的几乎所有血清充分反应。测定的标准化使用已知的阳性样品和已知的阴性样品对测定进行标准化(IAH提供的样品，PirbrightLab，UK)。从通过病毒分离测试为阳性的动物收集的血清被认为是已知的阳性样品(n=40)，而从通过病毒分离测试为阴性的动物收集的血清被认为是已知的阴性样品。使用50ngPh-3AB抗原进行间接ELISA。40个已知阳性样品中有36个对Ph-3AB是阳性的，而所有100个已知阴性样品对Ph-3AB都是阴性的。截留值的估测对于Ph-3AB和Ph-3ABDELISA，截留值被估计为平均值+三次标准偏差一0.150。因为Ph-3DELISA不灵敏，所以将其中断。对通过病毒分离为阴性的54份山羊血清和36份绵羊血清进行测试，并将截留值固定在0.230。血清测试使用已知的阳性样品和已知的阴性样品进行该测定(从各种牛攻击实验获得的3哮品)。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>77份己知阳性样品中有74份对Ph-3AB抗原是阳性的，而仅有67份对Ph-3ABD抗原是阳性的。Ph-3D抗原仅检测到77份阳性样品中的52份。所有90份已知的阴性样品在所有三次测试中都表明是阴性。将测试与阳性样品的Ceditest进行比较，结果显示Ph-3AB比其它两种嵌合抗原更特异。iii.PhMV嵌合体的比较-已知的阳性血清<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>在通过三种嵌合抗原所测试的77份样品中，66份对Ph-3AB和Ph-3ABD都是阳性的，而2份则对两种测试都是阴性的。然而，8份被Ph-3AB表明是阳性的样品被Ph-3ABD表明是阴性的，仅有1份被Ph-3ABD表明是阳性的样品被Ph-3AB表明是阴性的。类似的，在通过三种嵌合抗原所测试的77份样品中，52份对Ph-3AB和Ph-3D都是阳性的，而2份对两种测试都是阴性的。然而，23份被Ph-3AB表明是阳性的样品被Ph-3D表明是阴性的，仅有1份被Ph-3ABD表明是阳性的样品被Ph-3AB表明是阴性的。这显示Ph-3AB比其它两种嵌合抗原更灵敏。使用Ph-3AB和Ph-3ABDELISA对从实地收集的随机血清样品进行筛选使用Ph-3AB和Ph-3ABDELISA对从不同地点从牛随机收集的89份血清样品进行测试，<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>与被Ceditest表明是阳性的25份样品相比，23份样品被Ph-3AB表明是阳性，13份样品被Ph-3ABD表明是阳性，仅有1份被Ph-3D表明是阳性。ii)PhMV-嵌合体的比较_实地血清<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在被Ceditest表明是阳性的25份样品中，Ph-3AB中有23份样品与其一致，Ph-3ABD中有10份样品与其一致，而Ph-3D中仅有1份样品与其一致。在Ceditest表明是阴性的64份样品中，Ph-3AB和Ph-3D中观察到与其完全一致的结果，而Ph-3ABD的结果中仅有61份样品与其一致。这显示Ph-3ABD测试可能不与其他测试一样特异。在Ceditest为阳性的样品中，在PhMV-3AB中有两份样品被表明是阴性，而分别有15份和24份样品被Ph-3ABD和Ph-3D表明是阴性，这说明与Ceditest或Ph-3AB相比，这两种测试的特异性低。开发Ph-3ABELISA的内部参照用Ph-3AB测试40份己知的阳性血清和40份已知的阴性血清，以开发内标。结果这些结果与Ph-3AB和Ph-3ABDELISA的结果以及Ceditest的结果类似。牛、水牛、绵羊和山羊的基于Ph-3AB的ELISA绵羊样品(『61):进行Ph-3ABELISA以筛选从TamilNadu有组织的农场随机收集的绵羊样品。下面提供了与Ceditest的比较结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>结果显示24份样品被两种测试都表明是阳性，而24份样品被两种测试都表明是阴性的。然而，关于10份样品，两份测试不一致。猪样品(『39):进行Ph-3ABELISA以筛选从不同地方收集的39份猪样品。下面提供了与Ceditest的比较结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>根据所测试的阴性样品，基于Ph-3AB的ELISA非常特异。基于Ph-3AB的ELISA与Ceditest—样灵敏。与Ceditest相比，Ph-3ABELISA的灵敏度为95.80%，而与Ph-3ABELISA相比，Ceditest的灵敏度为98.21。几乎没有被Ceditest表明是NSP抗体阴性的样品，被基于Ph-3AB的ELISA表明是阳性的，反之亦然。实施例9FMDV-VP1结构蛋白抗原决定簇的表达分析将编码FMDV-VP1中和抗原决定簇的DNA片段克隆到pR-Ph-CP中的NdeI和KpnI限制性位点，以产生重组载体pR-Ph-VPl-Cl、pR-Ph-VPl-C2和pR-Ph-VPl-C3。通过本领域中已知的DNA测序方法确认该重组载体中的插入DNA。将这些重组载体转化到大肠杆菌(E.coli)DH5ot菌株中。含有所述重组载体的重组大肠杆菌(E.coli)被命名为r-Ph-VPl-Cl、r-Ph-VPl-C2和r-Ph-VPl-C3。从含有重组载体的大肠杆菌(E.coli)DH5a菌株中分离质粒，并将其转化到大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS菌株中用于表达融合蛋白。具有如SEQIDNO:13、15和17中所示氨基酸序列的嵌合TVLP被命名为Ph-VPl-Cl、Ph-VPl-C2和Ph-VPl-C3。实施例3提供了详细的程序。将重组的大肠杆菌(E.C0li)细胞生长在生长培养基中用于产生实施例4所描述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒。使用实施例5所描述的程序对嵌合TVLP进行纯化。实施例10促性腺激素释放激素的表达分析将编码GnRH蛋白的DNA片段克隆到pR-Ph-CP中的NdeI和KpnI限制性位点以产生重组载体pR-Ph-IC-Cl，还将GnRH的DNA片段联合CDVP35DNA序列以串联重复的形式克隆到pR-Ph-CP中的NdeI和KpnI限制性位点以产生重组载体pR-Ph-IC-C2和pR-Ph-IC-C3。通过本领域中已知的DNA测序方法确认在该重组载体中的插入DNA。将这些重组载体转化到大肠杆菌(E.coli)DH5-a菌株中。将含有所述重组载体的重组大肠杆菌(E.coli)细胞命名为r-Ph-IC-Cl、r-Ph-IC-C2和r-Ph-IC-C3。从含有重组载体的大肠杆菌(E.coli)DH5-a菌株中分离质粒，并将其转化到大肠杆菌(DE3)pLysS菌株中用于表达融合蛋白。将具有如SEQIDNO:19、21和23中所示氨基酸序列的嵌合TVLP命名为Ph-IC-Cl、Ph-IC-C2和Ph-IC-C3。实施例3提供了详细的程序。将重组的大肠杆菌(E.coli)细胞生长在生长培养基中用于产生实施例4所描述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒。使用实施例5所描述的程序对嵌合TVLP进行纯化。实施例11CPV-VP2VLP的表达将编码犬细小病毒(CPV)抗原肽位点的DNA片段克隆到pR-Ph-CP中的NdeI和KpnI限制性位点以产生重组载体pR-Ph-CPV。将串联重复的CPV抗原肽位点的DNA片段克隆到pR-Ph-CP中的NdeI和KpnI限制性位点，以产生重组载体pR-Ph-CPVl、pR-Ph-CPV2、pR-Ph-CPV3、pR-Ph-CPV4和pR-Ph画CPV5。通过本领域中已知的DNA测序方法确认在该重组载体中的插入DNA。将这些重组载体转化到大肠杆菌(E.coli)DH5-a菌株中。将含有所述重组载体的重组大肠杆菌(E.coli)命名为r-Ph-CPVl、r-Ph-CPV2、r-Ph-CPV3、r-Ph-CPV4和r-Ph-CPV5。从含有重组载体的重组大肠杆菌(DH5-a)细胞中分离质粒，并将其转化到大肠杆菌(DE3)pLysS菌株中用于表达融合蛋白。将具有如SEQIDNO:25、27、29、31和33中所示氨基酸序列的嵌合TVLP命名为Ph-CPVl、Ph-CPV2、Ph-CPV3、Ph-CPV4和Ph-CPV5。实施例3提供了大肠杆菌(E.coli)转化的详细程序。将重组的大肠杆菌(E.coli)细胞生长在生长培养基中用于产生实施例4所描述的嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒。使用实施例5所描述的程序对嵌合TVLP进行纯化。参考文件1.BrownF,2003.口蹄疫研究历史(Thehistoryofresearchinfoot-and-mouthdisease).VirusResearch.91:3-7.2.ChungW，KJSorensen，PLiao,PYang和MJong.2002.通过使用非结构蛋白3AB作为抗原的酶联免疫吸附测定来区分口蹄疫病毒感染的猪与被接种疫苗的猪，以及用于根除程序(Differentiationoffoot-and-mouthdiseasevirus-infectedfromvaccinatedpigsbyenzyme-linkedimmunosorbentassayusingnonstructuralprotein3ABastheantigenandapplicationtoaneradicationprogram).JofClinicalMicrobiology40(8):2843隱2848.3.ClavijoA，PWright和PKitching.2004a.口蹄疫中区分感染与接种疫苗的诊断技术的进展(Developmentsindiagnostictechniquesfordifferentiatinginfectionfromvaccinationinfootandmouthdisease).TheVeterinaryJournal167:9-22.4.ClavijoA,ZhouE，HoleK,GalicB，KitchingP2004b.固相竞争ELISA中的生物素化3ABC重组蛋白的开发和应用以检测针对口蹄疫病毒的抗体(Developmentanduseofabiotinylated3ABCrecombinantproteininasolid-phasecompetitiveELISAforthedetectionofantibodiesagainstfoot-and-mouthdiseasevirus).JofVirologicalMethods120:217-227,5.DeDiego等人，1997.口蹄疫病毒的非结构性聚蛋白3ABC作为ELISA中的诊断抗原以从被接种疫苗的牛区分被感染的牛(Thenon-structuralpolyprotein3ABCoffootandmouthdiseasevirusasadiagnosticantigeninELISAtodifferentiateinfectedfromvaccinatedcattle).ArchVirol142:2021-2033.6.DoelTR.2003.FMD疫苗(FMDvaccines).VirusResearch.91:81-89.7.Grangeot-KerosL和GEnders1997.对根据重组风疹病毒样颗粒的新型酶免疫测定以检测风疹病毒的免疫球蛋白M抗体的评估(Evaluationofanewenzymeimmunoassaybasedonrecombinantrubellavirus-likeparticlesfordetectionofimmunoglobulinMantibodiestoRubellavirus).JofClinicalMicrobiology.35(2):398-401.8.GrubmanMJ禾tlBaxtBarry.2004.口蹄疫(Foot-and-mouthdisease).ClinicalMicrobiologyReviews.465-493.9.GuoM，YQian，KChang和LJSaif.2001.猪肠道杯状病毒衣壳在杆状病毒中的表达和自身组装成病毒状颗粒，以及它们在用于猪中抗体检测的酶联免疫测定中的应用(Expressionandself-assemblyinbaculovirusofporcineentericcalciviruscapsidsintovirus-likeparticlesandtheiruseinanenzyme-linkedimmunoassayforantibodydetectioninswine).JournalofClinicalMicrobiology39(4)1487-1493.10.Hohlich等人，2003.鉴定口蹄疫病毒特异性的线性B细胞抗原决定簇用于区分被感染的牛和疫苗接种的牛(Identificationoffootandmouthdiseasevirus-specificlinearB-cellepitopestodifferentiatebetweeninfectedandvaccinatedcattle).JVirol,77:8633-8639.11.Jocob等人，1992.颠茄斑点病毒-Iowa(重命名为酸浆斑点病毒)RNA的3'末端区域的核苷酸序列，以及芫菁黄花叶病毒组外壳蛋白关系的分析(Nuceotidesequenceofthe3'terminalregionofbelladonnamottlevirus-Iowa(renamedphysalismottlevirus)RNAandananalysisoftherelationshipsofatymoviralcoatproteins).ArchivesofVirology.123:367-377.12.JaeKuOem等人，2005.根据口蹄疫病毒的非结构蛋白2C开发合成月太ELISA(DevelopmentofsyntheticpeptideELISAbasedonnonstructuralprotein2Coffootandmouthdiseasevirus)JVetSci6:'317-325.13.Johnson等人，1997.在植物病毒上呈递异源肽遗传学、结构禾口功能(Presentationofheterologouspeptidesonplantviruses:Genetics,structureandflmction).Annu.Rev.Phytopathol.，35:67-86.14.KitchingRP.2002.口蹄疫病毒载体和亚临床感染的动物的鉴定，和与接种疫苗的动物的区分(Identificationoffootandmouthdiseaseviruscarrierandsubclinicallyinfectedanimalsanddifferentiationfromvaccinatedanimals).RevSciTech.21:531-538.15.Laemmli，UK.1970.在噬菌体T4头部组装的过程中结构蛋白的剪切(CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofthebacteriophageT4).Nature.227:680-685,16.Mackay等人，1998.在ELISA中使用一系列重组非结构蛋白来区分口蹄病中的感染与疫苗接种(Differentiatinginfectionfromvaccinationinfoot-and-mountdiseaseusingapanelofrecombinantnon-structuralproteinsinELISA).Vaccine16:446-459.17.MiraS，RameshK，GopinathK,RanjithKumarCT，JagathJR禾口HSSavithri.1997.酸浆斑点病毒衣壳蛋白在大肠杆菌内的组装，以及氨基和羧基末端在形成二十面体颗粒中的作用(AssemblyofphysalismottleviruscapsidproteininEscherichiacoliandtheroleofaminoandcarboxyterminiintheformationoftheicosahedmlparticles).JMolBiol"272:541-552.18.MiraS.SrihariReddyD，SriKrishnaS,MurthyMRN和HSSavithri.1999.通过突变分析鉴定酸浆斑点芜菁黄花叶病毒组的装配/解装酉己中的不连续中间体(Identificationofadiscreteintermediateintheassembly/disassemblyofphysalismottletymovirusthroughmutationalanalysis).JMolBiol.，289:905-918.19.MolineHE和FriesRE.1974.从Iowa的异叶酸浆分离的颠莉斑点病毒株(AstrainofbelladonnamottlevirusisolatedfromPhysalisheterophyllainIowa).Phytopathology.64:44-48.20.NiedbalskiW.2005.在疫苗接种的牛中检测口蹄疫病毒感染(Detectionoffoot-andmouthdiseasevirusinfectioninvaccinatedcattle).PolishJournalofVeterinarySciences.8:283-287.21.Porta和Lomonossoff.1998.使用植物病毒呈递来自动物病原体的抗原决定簇的范围(Scopeforusingplantvirusestopresentepitopesfromanimalpathogens).RevMedVirol".8:25-41.22.Robiolo等人，2005.在阿根廷的牛中，通过联合应用液相和3ABC-ELISA测试来分析对FMDV结构和非结构蛋白的免疫应答(AnalysisoftheimmuneresponsetoFMDVstructuralandnon-structuralproteinsincattleinArgentinabythecombineduseofliquidphaseand3ABC-ELISAtests).Vaccine(在线).23.SambrookI，EFFritisch和TManiatis.1989.实验室手册，分子克隆(MolecularcloninginALaboratoryManual)第2版.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY.24.Shen等人，1999.通过肽ELISA从抗口蹄疫接种的动物区分康复期的云力物(Differentiationofconvalescentanimalsfromthosevaccinatedagainstfoot-and-mountdiseasebyapeptideELISA).Vaccine17:3039-3049.25.Sorensen等人，1998.通过使用杆状病毒中表达的抗原的ELISA检测针对非结构蛋白3D、3AB和3ABC的抗体，从口蹄疫疫苗接种区分感染(Differentiationofinfectionfromvaccinationinfootandmouthdiseasebythedetectionofantibodiestothenon-structuralproteins3D,3ABand3ABCELISAusingantigensexpressedinbaculovirus).ArchVirol"143:1461-1476.26.Sorensen等人，2005.使用基于杆状病毒表达的FMDV3ABC抗原和3ABC单克隆抗体的封闭ELISA，从被接种疫苗的动物区分口蹄疫病毒感染的动物(DifferentiationoffootandmouthdiseasevirusinfectedanimalsfromvaccinatedanimalsusingablockingELISAbasedonbaculovirusexpressedFMDV3ABCantigenanda3ABCmonoclonalantibody).ArchVirol150:805-814.27.Sim等人，2004.感染相关抗原决定簇在口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC上的定位，以及串联抗原决定簇的应用(Localizationofinfection-relatedepitopesonthenon-structuralprotein3ABCoffoot-and-mouthdiseasevirusandtheapplicationoftandemepitopes).Jo匿alofVirologicalMethods119:79-86.权利要求1.一种含有融合蛋白的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述融合蛋白包含第一蛋白质和第二蛋白质，所述第一蛋白质是截断的芜菁黄花叶病毒组外壳蛋白。2.如权利要求1所述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述芜菁黄花叶病毒组选自由酸浆斑点病毒(PhMV)、颠茄斑点病毒、芜菁黄花叶病毒、可可树黄花叶病毒、蝶豆黄脉病毒、金钱草黄斑点病毒、茄子花叶病毒和西番莲果黄花叶病毒所组成的组。3.如权利要求2所述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述芜菁黄花叶病毒组是酸桨斑点病毒。4.如权利要求1所述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述截断的芜菁黄花叶病毒组外壳蛋白含有SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的至少149个连续氨基酸。5.如权利要求1所述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述截断的芫菁黄花叶病毒组外壳蛋白是由SEQIDNO:2中所示多核苷酸序列、其片段或其变体所编码的。6.如权利要求5所述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述多核苷酸序列包含至少447个连续的核苷酸。7.如权利要求1所述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述第二蛋白质选自由口蹄疫病毒(FMDV)蛋白、犬细小病毒(CPV)外壳蛋白、犬瘟热病毒P35多肽(CDVP35)、促性腺激素释放激素(GnRH)和它们的组合所组成的组。8.如权利要求1所述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述融合蛋白选自由SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31和SEQIDNO:33所组成的组。9.如权利要求1所述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述融合蛋白选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中所示重组多核苷酸序列所编码的SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11组成的组。10.如权利要求1所述的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述融合蛋白是由重组多核苷酸序列所编码的。11.如权利要求10所述的嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒，其中所述重组多核苷酸序列选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、其片段或变体所组成的组。12.—种编码融合蛋白的重组多核苷酸序列，其中所述重组多核苷酸序列选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、其片段或变体所组成的组。13.—种包含表达盒的重组载体，其中所述表达盒包含调控序列和权利要求12所述的重组多核苷酸序列。14.如权利要求13所述的重组载体，其中所述调控序列选自由T7、SP6和T3所组成的组。15.如权利要求13所述的重组载体，其中所述重组载体选自由pR-Ph-CP、pR-Ph-3Bl、pR-Ph-3B2、pR画Ph-3AB、pR-Ph-3D、pR画Ph画3ABD、pR-Ph-VP1-C1、pR-Ph-VPl画C2、pR-Ph画VPl-C3、pR-Ph-IC-Cl、pR-Ph-IC-C2、pR-Ph-IC-C3、pR-Ph-CPVl、pR國Ph-CPV2、pR-Ph-CPV3、pR-Ph-CPV4和pR-Ph-CPV5所组成的组。16.—种宿主细胞，其含有权利要求13所述的重组载体。权利要求书第3/3页17.如权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由大肠杆菌(E.coli)、酵母和杆状病毒组成的组。18.如权利要求17所述的宿主细胞，其中所述大肠杆菌(E.coli)选自由JM101、DH5a、BL21、HBIOI、BL21(DE3)pLysS、XL-lBlue和Rossetta所组成的组。19.一种生产嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒的方法，该方法包括a.生产权利要求12所述的重组多核苷酸序列；b.构建重组载体，所述重组载体包含调控序列和步骤(a)的所述重组多核苷酸序列；c.用步骤(b)的所述重组载体转化宿主细胞以产生重组宿主细胞；d.培育步骤(c)的所述重组宿主细胞以产生嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒；和e.纯化步骤(d)的所述嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒。20.如权利要求19所述的生产嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒的方法，其中所述调控序列选自由T7、SP6和T3所组成的组。21.如权利要求19所述的生产嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒的方法，其中所述重组多核苷酸序列选自由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32禾卩SEQIDNO:34所组成的组。22.如权利要求19所述的生产嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒的方法，其中所述重组载体选自由<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>所组成的组。23.—种用于确定针对FMDV的特异性抗体的测试试剂盒，所述试剂盒包含(a)权利要求9所述的嵌合芫菁黄花叶病毒组样微粒；和(b)用于检测抗体的试剂。全文摘要本发明涉及含有融合蛋白的嵌合芜菁黄花叶病毒组样微粒(TVLP)，所述融合蛋白进一步包含第一蛋白质和第二蛋白质，所述第一蛋白质是截断的芜菁黄花叶病毒组外壳蛋白。这些嵌合TVLP可以用作抗原。本发明提供了用于从接种疫苗的动物区分口蹄疫病毒(FMDV)感染的动物的高度有效手段。本发明还提供了用于生产嵌合TVLP的方法，以及用于确定FMDV的特异性抗体以区分FMDV感染的动物和被接种疫苗的动物的诊断试剂盒。本发明还提供了嵌合TVLP用于诊断目的的应用。文档编号C12N15/41GK101400795SQ200680053885公开日2009年4月1日申请日期2006年9月11日优先权日2006年3月17日发明者多雷莱安·蒂亚加拉安,欣加纳鲁尔·巴拉苏布拉马尼亚安·纳根德拉库马尔,维鲁帕诺尔·奥尔沃·斯里尼瓦桑,赫马·马萨莱普申请人:印度免疫有限公司