专利名称：：耐热碱性磷酸酶(Tthxm-AP)基因及其编码蛋白的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种来自高温菌(77^rmM^/^nnop/u'^XM)的碱性磷酸酶基因的核苷酸序列以及该基因所编码的氨基酸序列。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的蛋白功能及其应用。
背景技术：
：碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)(EC3.1.3.1)是一种非特异的磷酸单酯酶，能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酰基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酣转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷元素的生物地球化学循环过程中，碱性磷酸酶起了极其重要的作用。碱性磷酸酶广泛存在于各种生物体内，目前在微生物界和动物界中都检测到碱性磷酸酶的存在。碱性磷酸酶作为一种工具酶广泛应用于诊断学、免疫学、生物化学和分子生物学的研究领域。目前最常用的碱性磷酸酶是小牛肠道碱性磷酸酶和大肠杆菌碱性磷酸酶，虽然具有比活力高等特点，但是热稳定性差，限制了酶在某些领域的应用。而来自髙温菌的耐热碱性磷酸酶具有良好的热稳定性，可以在高温条件下操作，因此可广泛应用于诊断学分子生物学等领域。
发明内容申请人从厦门海边热泉分离到一个菌株高温菌7Tienmwf/imnopMiwXM，申请人己将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCM207031，保藏日2007年4月2日，保藏于中国武汉的武汉大学中国典型生物保藏中心，其最适生长温度在70—75。C之间，该菌株能产生耐热的碱性磷酸酶，具有很高的应用潜力。但是野生的高温菌所产生的耐热碱性磷酸酶量很少，而且菌株培养条件苛刻，不易大规模发酵培养获得，因此基因工程重组表达是大量获取耐热碱性磷酸酶的最佳选择。本发明首次提取了高温菌77iermwf/ie/vnop/u'/iwXM的基因组DNA,从中克隆和鉴定了耐热碱性磷酸酶(Tthxm-AP)基因，并在大肠杆菌工程菌中得到重组表达，从而对重组酶进行了纯化以及性质测定，为该酶的实际应用提供了基础。本发明中的编码Tthxm-AP活性多肽的核苷酸序列是如此获得的。以77ienmf/ier/nop/n'/MJXM基因组DNA为模板，根据合成序列SEQIDNo.3和SEQIDNo.4作为引物，经PCR扩增所得到了SEQIDNo.1的序列。然后通过重组表达Tthxm-AP基因，纯化Tthxm-AP基因的表达产物，生物学方法证明Tthxm-AP基因编码的多肽(SEQIDNo.2)具有耐热碱性磷酸酶的活性。本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该核苷酸编码一种新的耐热碱性磷酸酶，此酶被命名为Tthxm-AP。本发明的另一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的Tthxm-AP的方法。本发明还提供了这种Tthx迈-AP基因序列和其所编码的多肽。在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括一种分离出的DNA分子，它包括编码Tthxm-AP酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNo.l中1-1506的核苷酸序列由至少70%的相似性；或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQIDNo.l中1-1506的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQIDNo.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQIDNo.l中1-1506位的核苷酸序列。在本方面的另一方面，提供了一种分离的Tthxm-AP酶，它包括具有SEQIDNo.2氨基酸序列的多肽、或者其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQIDNo.2序列的多肽。在本发明的另一方面，提供了一种产生具有Tthxm-AP酶的方法。在本发明的一个具体实施方案中，本发明中分离的多核苷酸全长为1506个核苷酸，其详细序列见SEQIDNo.l，其中开放阅读框位于l-1506位核苷酸。在本发明中，术语"Tthxm-AP编码序列"是指编码具有耐热碱性磷酸酶活性的核苷酸序列，如SEQIDNo.l中的l-1506位序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNo.l序列的编码框1-1506位核苷酸中，由一个和多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNo.l中1-1506位核苷酸相似性低至约70%的简并序列也能编码出SEQIDNo.2所述的序列。该术语还包括与SEQIDNo.l中1-1506的核苷酸序列的相似性至少70%，较佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与Tthxm-AP相同功能的SEQIDNo.l序列变异形式。这些形式包括若干个(通常为l-90个，较佳地l-60个，更佳地l-20个，最佳地l-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地IO个以内，最佳地5个以内)核苷酸。在本发明中，术语"Tthxm-AP蛋白多肽"指具有耐热碱性磷酸酶活性的SEQIDNo.2序列的多肽。该术语还包括具有Tthxm-AP酶功能的SEQIDNo.2序列变异形式。这些变异形式包括(但不限于)若干个(通常为l-50个，较佳地l-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Tthxm-AP酶的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、修饰形式、在高或低的严谨度条件下能与Tthxm-AP基因杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Tthxm-AP酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽，如包含Tthxm-AP酶或者其片段的融合蛋白。本发明还涉及Tthxm-AP酶的类似物，这些类似物与天然Tthxm-AP酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传突变体，诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生的随机诱变，还可通过定点诱变法或其他己知的分子生物学技术。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基的序列，还包括被修饰后提高了其酶的活性或抗蛋白水解性能。在本发明中，可选用本领域己知的各种载体，如已商品化的载体。在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。图lTthxm-AP重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。说明如下M:低分子量Marker;1:重组载体pQE30-TAP在菌株XL-Blue的加IPTG诱导表达；2:重组载体pQE30-TAP在菌株XL-Blue的未加IPTG表达3:空载体pQE30在菌株XL-Blue的诱导作为对照；4:经Ni-NTA纯化所得的目的蛋白Tthxm-AP;图2重组酶Tthxm-AP的最适pH值测定。说明如下测定的pH范围从7.0-12.5，结果该酶的最适pH值是12.0。图3重组酶Tthxm-AP的最适反应温度测定。说明如下测定的温度范围从40-95°C，结果该酶的最适温度为75-80'C。图4重组酶Tthxm-AP的热稳定性测定。说明如下将该酶分别在50、65、80和95'C下保温，每隔30分钟取一次样进行残余酶活力测定，结果发现在50、65和80'C下保温6小时，酶的活性仍然保留50%以上，但是在95'C时，酶活力下降的却很快。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是1.7TiermiisAermopA〃MSXM基因组DNA的提取用接种环挑取-80'C保存的7Tie/7nMSAermop/n'ZiuXM菌种，在LB培养基平板(一种细菌培养基，含有1%的胰化蛋白胨，1%的氯化钠，0.5%的酵母提取物，1.5%的琼脂糖)上划线分离单菌落。待划线后的平板置75'C培养过夜，挑取一个单菌落接种到5ml的LB培养液管中(一种细菌培养基，含有1%的胰化蛋白胨，1%的氯化钠，0.5%的酵母提取物)，75'C摇动培养过夜，收集菌，6000g离心8分钟后弃去上清，沉淀重新悬浮于200^1缓冲液U00mMNaCl,50mMTris-HCl，5mMEDTA，pH8.0),加入少量溶菌酶，然后加入4ml裂解液(4M异硫氰酸胍)，轻轻混匀，放置约10分钟后加入100^11MMgCl2和2ml体积的异丙醇，待出现白色絮状沉淀后，1000g离心30秒，弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，吸干，分别加800^1TES(10迈MTris-HCl,lmMEDTA，10mMNaCl，pH8.0)，10^1RNaseA(10mg/ml)和40^110%SDS。放置过夜，再加入50nl蛋白酶K(20mg/ral),55'C消化2小时，用酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提两次，15000g离心IO分钟，上清小心转移至另一个离心管中。用异丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗漆两次，沉淀溶于重蒸水中，-20'(:保存。2.耐热碱性磷酸酶基因(Tthxm-AP基因)的PCR扩增和序列分析以提取的T7t"m"s^ermop/n'/MsXM基因组DNA为模板，用引物tapN和tapC扩增全长的Tthxm-AP基因。tapN:5，-GGGGGATCCAAGCGAAGGGACATCCTG-3，(SEQIDNo.3);tapC:5，-GGGAAGCTTTTAGGCCCAGACGTCCTC-3，(SEQIDNo.4);划线部分GGATCC代表fl頻HI酶切位点，AAGCTT代表酶切位点。PCR反应条件为在25^1的反应体系中含，lOOng模板，400nMtapN,400nMtapC，200nMdNTP，2.5mMMg2+，1.25ULA-TaqDNA聚合酶(TaKARa公司)；PCR扩增程序为25个循环94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸2分钟。PCR产物经纯化后与T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞XL-Blue中，挑取有插入DNA片段的阳性，经测序，Tthxm-AP基因序列详见SEQIDNo.l。根据得到的核苷酸序列推导出的Tthxm-AP酶的氨基酸序列，共501个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQIDNo.2。3.重组Tthxm-AP的表达和纯化将含有Tthxm-AP基因的质粒用BamHI和fli/idlll酶切，胶回收Tthxm-AP基因片段，同时将质粒pQE30(Qiagen)也用相同的酶进行酶切。将两者连接过夜(12-16小时)。连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞XL-Blue中，提取质粒，测序验证。将含有Tthxm-AP基因的重组表达质粒pQE30-tap转化大肠杆菌XL-Blue,选取阳性克隆在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37。C摇培至八60()=0.6时，加入异丙基硫代-e-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度O.lmmol/L，37°C诱导6h后将菌液收集至250ml的离心管中，5000g离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在15迈1的缓冲液A(0.5MNaCl，30mM咪唑，0.5%TritonX-lOO，20mMTris-HCl，pH7.9)中，超声波处理至菌液成半透明，再18000g离心20分钟，上清与预先用裂解缓冲液平衡的Ni-NTAAgarose混匀，4。C结合3小时，纯化过程按照纯化试剂盒说明进行(Qiagen公司)。纯化的蛋白经10%的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为54kDa，纯度达95%以上。结果见图1。4.重组Tthxm-AP的酶学性质酶活力的测定方法是1.5Pg的重组酶加入到800^1的含100mM二乙醇胺(pH12.0)和6mM的底物对硝基苯磷酸二钠盐(pNPP)的反应体系中，75'C反应10分钟后快速冰浴终止反应。根据测定的反应产物对硝基苯酚在410nm的消光值的大小换算成酶活力。4.1最适反应pH值测定在70'C下，酶反应溶液的pH被调整在7.0-12.5的范围。在其他条件完全一样的情况下，结果显示重组酶在pH12.0时活性最高，见图2。因此下述实验均在最适pH12.0下进行。4.2最适反应温度测定在其他条件完全一样的情况下，酶促反应在40-951C的范围内进行，结果显示重组酶在反应温度在75-80'C时活性最高，见图3。因此下述实验均选择在75'C下进行。4.3重组酶的热稳定性将重组酶分别在50°C、65°C、80。C和95。C温育，每隔30分钟取一次样进行残余酶活力测定，结果发现在50。C、65°C、80'C下保温6小时，酶的活性仍然保留50%以上，但是在95'C时，酶活力下降的却很快，l小时后其活力下降到50%以下，见图4。4.4金属离子对酶活力的影响用Cu2+、Co2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、K+分别在O.lmmol/L,2.0mmol/L的浓度下测定其对TAP活性的影响，看各种常见的金属离子对TAP有无促进或抑制作用(表1)。结果显示在这两种情况下，金属离子Co2+、Mg2+、Mn2+和Fe"的存在可以是TAP的活性有不同程度增加(125-243%)。而Cu2+、Ca2+、Zn"和K+则不同程度的抑制TAP的活性。表1常见的金属离子对重组酶Tthxm-AP活性的影响，表中所示为Cu2+，Co2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+，Fe2+,K+分别在0.lmmol/L,2.0mmol/L的浓度下测定其对TAP活性的影响。可以看出金属离子(:02+,Mg2+，Mn2+和Fe"的存在可以是TAP的活性有不同程度增加(125-243%)。而Cu2+,Ca2+,Zn"和K+则不同程度的抑制TAP的活性。表l金属离子对重组酶活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>Co2+243.474.7Cu2+96.470.5Fe2+125.011.3Mg2+127.8157.4Mn2+130.8667.8Zn2+77.248.6*不含金属离子的对照的活性定义为100%。序列表1.SEQIDNo.1的信息1)名称T7e/，M/st/e/m//^7i/sXM耐热碱性磷酸酶基因2)分子类型DNA3)序列特征A)长度1506bpB)类型核酸C)链性双链D)拓扑结构线性4)序列描述SEQIDNo.11ATGMGCGMGGGACATCCTGAAAGGTGGCCTGGCTGCGGGGGCCCTGGCCCTCCTGCCC61CGGGGCCATACCCAGGGGGCTCTGCAGMCCAGCCTTCCTTGGGAAGGCGGTACCGCMC121CTCATCGTCTTCGTCTACGACGGGTTTTCCTGGGAGGACTACGCCATCGCCCAGGCCTAC181GCCCGGAGGCGGCAGGGCCGGGTCCTGGCCCTGGAGCGCCTCCTCGCCCGCTACCCCMC241GGGCTCATCAACACCTACAGCCTCACCAGCTACGTCACCGAGTCCAGCGCTGCGGGGAAC301GCCTTCTCCTGCGGGGTGMAACGGTGMCGGAGGTCTCGCCATCCACGCGGACGGCACC361CCCTTGAGGCCCTTCTTCGCCGCGGCCAAGGAGGCGGGGAAGGCCGTGGGGCTCGTGACC421ACCACCACCGTCACCCACGCCACCCCGGCGAGCTTCGTGGTGTCCAATCCCGACCGGMC481GCCGAGGAGAGGATCGCCGAGCAGTACCTGGAGTTCGGGGCCGAGGTGTACCTTGGGGGC541GGGGACCGCTTTTTCMCCCCGCCAGGCGCAAGGACGGGAAGGACCTCTACGCCGCCTTC601GCCGCCAAGGGGTACGGGGTGGTGCGCACCCCCGAGGAGCTCGCCCGTTCCAACGCCACC661CGGCTCCTGGGCGTCTTCGCCGACGGCCACGTGCCCTACGAGATTGACCGCCGCTTCCAG721GGCCTTGGGGTGCCGAGCCTCMGGAAATGGTCCAGGCCGCTTTGCCCCGGCTTGCCGCC781CACCGCGGGGGCTTCGTCCTTCAGGTGGMGCGGGGCGGATTGACCACGCCMCCATTTG841MCGACGCCGGGGCCACCCTTTGGGACGTGCTGGCGGCGGACGAGGTCCTGGAGCTCCTC901ACCGCCTTCGTGGACCGGMCCCGGACACCCTCCTCATCGTGGTCTCGGACCACGCCACC961GGGGTAGGGGGGCTTTACGGGGCCGGGCGGAGCTACCTGGAGAGCTCCCGAGGGGTGGAC1021CTCCTGGAGCCGCAGCGGGCGAGCTTTGAGCACATGCTCCGCGTCCTCGGCCAGGCTCCG1081GAGGCCTCCCAGGTCAAGGAGGCCTTCCGGGCCATGMGGGGGTGGACCTCGAGGACGCC1141GAGGCGGAAAGGGTGGTGCGGGCCATCCGGGAGMGGTCTACTGGCCGGAGGGGGTGCGC1201CAGGGGGTCCAGCCCGCCMCACCCTGGCCTGGGCCATGGCGCAGCGGAACGCCCAGAAG1261CCCGACCGACCCMCATCGGCTATAGCTCCGGCCAGCACACGGCAAGCCCCGTGATGCTC1321CTCCTCTACGGCCAGGGCCTGCGCTTTGTGMCCTGGGCCTCGTGGACMCACCCACGTC1381TTCCGCCTCATGGGGGAGGCCCTTGGCCTCCGCTACCAGAACCCGGTGATGAGCGAGGAG1441GAGGCCCTGGAGATCCTCMGGCCAGGCCCCAGGGGATGCGCCACCCCGAGGACGTCTGG1501GCCTM2.SEQIDNo.2的信息1)名称T^e/7wst力e/m;p/i7iAsXM耐热碱性磷酸酶2)分子类型蛋白质3)序列特征A)长度501B)类型氨基酸4)序列描述SEQIDNo.21MKRRDILKGGLAAGALALLPRGHTQGALQNQPSLGRRYRNLIVFVYDGFSWEDYAIAQAY61ARRRQGRVLALERLLARYPNGLINTYSLTSYVTESSMGNAFSCGVKTVNGGLAIHADGT121PLRPFFAAAKEAGKAVGLVTTTTVTHATPASFVVSNPDRNAEERIAEQYLEFGAEVYLGG181GDRFFNPARRKDGKDLYMFAAKGYGVVRTPEELARSNATRLLGVFADGHVPYEIDRRFQ241GLGVPSLKEMVQAALPRLAA服GGFVLQVEAGRIDH腿LNDAGATLTOVLAADEVLELL301TAFVDRNPDTLLIVVSDHATGVGGLYGAGRSYLESSRGVDLLEPQ隨EHMLRVLGQAP361EASQVKEAFRAMKGVDLEDAEAERWRAIREKVYWPEGVRQGVQP鍵LAWAMAQ腿QK421PDRPNIGYSSGQHTASPVMLLLYGQGLRFVNLGLVDNTHVFRLMGEALGLRYQNPVMSEE481EALEILKARPQGMRHPEDVWA*3.SEQIDNo.3的信息1)分子类型寡核苷酸2)序列特征A)长度27bpB)类型核酸C)链性单链D)拓扑结构线性4)序列描述SEQIDNo.31GGGGGATCCAAGCGAAGGGACATCCTG4.SEQIDNo.4的信息1)分子类型寡核苷酸2)序列特征A)长度27bpB)类型核酸C)链性单链D)拓扑结构线性4)序列描述SEQIDNo.41GGGGGATCCAAGCGAAGGGACATCCTG权利要求1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码来自高温菌ThermusthermophilusXM的耐热碱性磷酸酶(Tthxm-AP)的核苷酸序列，或者所述核苷酸序列与SEQIDNO.1中1-1506位的核苷酸序列有至少70％的相似性，或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQIDNo.1中1-1506位的核苷酸序列杂交。2.如权利1中要求的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQIDNo.2所示的序列。3.—种分离的Tthxm-AP蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。4.一种产生具有Tthxm-AP蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括a.将编码具有Tthxm-AP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地与表达调控序列连接，形成Tthxm-AP基因表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNo.1中从核苷酸l-1506位的核苷酸序列有至少70%的相似性；b.将步骤a中的表达载体转入宿主细胞，形成Tthxm-AP活性多肽的重组细胞；c.在适合表达Tthxm-AP活性多肽的条件下，培养步骤b中的重组细胞；d.分离出具有Tthxm-AP的活性多肽。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该重组的编码多肽的核苷酸序列为SEQIDNo.l中从核苷酸1-1506位。全文摘要本发明从一株高温菌ThermusthermophilusXM基因组中克隆了一耐热碱性磷酸酶基因，该基因所编码的活性多肽(酶)或者基因工程改造酶能广泛应用于诊断学、免疫学、生物化学和分子生物学的研究领域。本发明首先涉及ThermusthermophilusXM基因组DNA的提取，其次是耐热碱性磷酸酶基因(tap基因)的PCR扩增和序列分析，第三是耐热碱性磷酸酶的表达和纯化，第四是对重组碱性磷酸酶的酶学性质进行了测定。文档编号C12P21/02GK101255437SQ200710008959公开日2008年9月3日申请日期2007年5月9日优先权日2007年5月9日发明者徐丽美,李建波,丰杨申请人:国家海洋局第三海洋研究所