专利名称：一种双色荧光定量共扩增聚合酶链反应检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双色荧光定量共扩增聚合酶链反应检测试剂盒，具体是涉及一种21 号染色体倍性检测的双色荧光定量聚合酶链反应体外共扩增PCR试剂盒，属于分子生物学 检测诊断领域。
技术背景唐氏综合征(Down Syndrome, DS)，又称为先天愚型，是活产胎儿中最常见的染色体 异常综合征之一，其发病率约为1/600—1/800。 DS的体征非常多样，通常涉及多种组织 器官的异常，但其最突出、最严重的临床表现为精神发育迟滞。该病的主要临床特征为 严重智力低下，且智力低下的表型随年龄增长逐渐明显，动作发育和性发育迟缓，基本 无生活自理能力。具有独特的面部和身体畸形、先天性心脏病、消化道畸形等，白血病 的发病率也比人群平均发病率高10—30倍。患者的平均寿命在30岁左右。DS绝大多数都是偶发的，每个孕妇都有生患儿的可能，发病无明显的种族差异和家族 聚积现象。世界各地大量群体调查的结果表明种族之间发病率几乎相同，唐氏综合征的每 个体细胞中21号染色体为3条，而其它常染色体为2条，淋巴母细胞或羊水脱落细胞体 外培养和染色体制备观察是其实验室检测的常规方法，该方法虽然准确度高，但技'术复杂 耗时长，不能实现自动化和高通量检测。由于唐氏综合征患者21号染色体上的单拷贝基 因剂量是其它常染色体上的单拷贝基因剂量的1.5倍，而DSCR是唐氏综合征发病的关键 单拷贝区段，因此可以选择21号染色体上的单拷贝基因如DSCR1和常染色体上的单拷贝 基因如GAPDH基因，通过荧光定量PCR技术来检测出它们的相对拷贝数的比值来判断21 号染色体的倍性，从而能从微量DNA标本中检测出唐氏综合征。实时荧光定量PCR技术是近年来发展起来的能够对特异DNA (基因)拷贝数进行精确 定量的最先进的基因剂量定量新技术。其基本原理是在PCR反应体系中同时加入TaqMan 探针(特异寡核苷酸探针)，该探针的5 '端标记了一条荧光报告基团(R)， 3'端标记了一
条荧光淬灭基团(Q)。当这条探针处于完整状态或者没有反应时，R所产生的一部分荧光 将被Q吸收或淬灭。在PCR反应过程中，该探针可与PCR目标基因特异性杂交，然后被Taq DNA聚合酶的5'外切活性降解，使R和Q分离，游离的R发出荧光信号被检测。随着PCR 反应的进行，游离的R与PCR产物相对应的增加。因此，根据每个循环后R产生的荧光信 号的强度，即可实时测量出PCR反应产物的数量。如果同时使用拷贝数已知的DNA标准品 做标准曲线，即可对所检测的标本的耙DNA做精确定量。 发明内容本发明目的在于建立一种操作简便，能够快速准确检测唐氏综合征患者的双色荧光定 量共扩增聚合酶链反应试剂盒。本发明的技术方案是该种双色荧光定量共扩增聚合酶链反应试剂盒，含有扩增21 号染色体特异单拷贝区段DSCR和16号染色体特异单拷贝区段GAPDH体外扩增的荧光定量 PCR试剂，其特征在于，首先根据21号染色体特异DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH 基因序列分别合成其特异引物和双色Taqroan荧光探针，然后将0.1-0. 5咖ol/L DSCR和 GAPDH特异的引物、双色荧光Taqman探针加入同一个PCR扩增缓冲反应体系中，在多色实 时荧光定量PCR仪上进行96。C预变性2 min后，再94。C变性10 sec， 52—56。C复性30 sec，60-7(TC延伸40sec，共45个循环，并在延伸时检测荧光强度，使两对引物分别同时 引导新链合成，实现两对引物的共扩增和其拷贝数的定量检测。上述DSCR和GAPDH特异引物和双色Taqman荧光探针，其特征在于，其序列分别为 DSCR上游引物5， -CAGAAATCCCAGTTC ATGTTGCT-3， ; DSCR下游引物5， -CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT-3, ; DSCR TaqMan探针5， -[FAM]CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC[TAMRA]-3， ; GAPDH上游引物5， -etc cct ctt tct ttg cag caa t-3， ; GAPDH下 游引物5， 一cag etc tea tac cat gag tec t—3， ； GAPDH TaqMan探针5， —[HE幻ctg cac cac caa ctg ctt age [TAMRA]-3，。所用扩增缓冲反应体系，其特征在于，是由引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTPs、 模板DNA、 Mg++、 PCR反应缓冲液、超纯水等组成的，各个成分的浓度含量分别如下DSCR 和GAPDH特异的引物、双色荧光Taqman探针各0.1-0. 5umol/L、Taq DNA聚合酶1-3U/50ul、 dNTPs底物0. 1-0. 5腦ol/L、模板DNA若干、\^++1. 5-3. 5 mmol/L、反应缓冲液0. 5-1. 5XPCR， 其中1XPCR反应缓冲液包括50咖ol/L KC1、 10 mmol/L Tris.HCl PH8. 3、 0.01%明胶。该种双色荧光定量共扩增聚合酶链反应试剂盒实现两对引物的共扩增的同时通过检 测扩增过程中由于降解Taqrnan探针获得的荧光信号的强弱，获得各自的扩增曲线图，进 而得出各个基因的Ct值。根据样品的Ct值和标准曲线，利用以下公式计算分别计算DSCR 区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列含量Nx = No * Y "° —"x;其中Nx为样 本x的靶基因的起始拷贝数，Y为扩增效率，相当于Ct值减少1个循环对应的模板DNA的 增加的倍数，由公式Y40"" (ACt ^靶DNA每稀释10倍，平均增加的Ct值数)计算获得；CtX为扩增管X的靶基因的Ct值；CtO为标准曲线上靶基因拷贝数为No时的Ct值；No为起始拷贝数。根据以下公式计算二者的比值R: R= Nd/ Ng,其中Nd为DSCR拷贝数， Ng为GAPDH拷贝数；最后根据二者的比值R判断21号染色体的倍性。该种双色荧光定量共扩增聚合酶链反应试剂盒与其它检测21号染色体倍性的方法相 比，具有以下优点1、操作简便快速,可以在2-3小时内获得准确的检测结果；2、闭管 检测，不会造成扩增产物污染；3、自动化程度高，人工成本低，还可以高通量检测，每次可 以检测90个以上标本；4、需要的检测样本材料微量,每个反应仅需要待检DNA 50-100 ng， 便于取材。
具体实施方式
实施例l:1.引物和探针的设计根据genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列设计DSCR的引物如下 上游弓I物DSCRF: 5 ， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 ，； 下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，； TaqMan探针DSCRTM: 5, - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 扩增产物96bp,在基因中的位置如下cacgcgacga ggacgcattc caaatcatac tcacgggagg aatcttttac 34812197 tgtggaggtg gctggtcacg acttcttcgg aggtggcagc cgagatcggg 34812147 gtggc|agaa￡t tcccagttca tgttgct|cag aagagaat|ca aggccgtgtc(:(.'c"gUet aatgctgcac accagttact gttcatggca cccgggaatg34812097 34812047根据genebank中[gi: 32891804]设计内对照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下上游弓l物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3，； 下游弓l物GAPDR:5， -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探针GAPDTM:5， -[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，； 扩增产物112bp，在基因中的位置如下gggtgtgaac catgagaagt atgacaacag cctcaagatc atcaggtgag 6516648 ga鄉caggg cccgtggaga agcggccagc ctggcaccct atggacacgc 6516698tcccctgact tgcgccccgc tccctctttc tttgcagcaa tgcctc|ctgc| 6516748buiiccaat'L gcttagcacc cctggccaag gtcatccatg acaactttgg 6516798tatcgtgga]a ggactcatgg tatgagagct g!gggaatggg actgaggctc 65168482. 双色荧光定量PCR反应混合50 ul反应体系，内含两引物各10 pmol，各探针10 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， IX PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2u， Mg+十终浓度2鹏ol/L，然后在FTC2000实时荧 光定量PCR仪上96。C下预变性2 min，然后94。C变性10 sec, 52。C复性30 see, 60。C延伸 40 sec，共45个循环，并在60。C延伸时照相。每一个标本重复三次实验。3. 荧光定量PCR的标准曲线将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和GAPDH基因的标准 曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。4. 结果实验表明唐氏综合征患者的GAPDH与DSCR1的差值为1. 85±0. 27，而正常人的GAPDH 与DSCR1的差值为1. 06±0.176，用2—M"方法计算换成拷贝数的差异约为1/1. 58 1. 43，两者间的差异有统计学意义。 实施例2:1. 引物和探针的设计根据genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列设计DSCR的引物如下 上游引物DSCRF:5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3'; 下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，； TaqMan探针DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 根据genebank中[gi: 32891804]设计内对照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下:上游弓l物GAPDF:5， _ctccctctttctttgcagcaat_3，； 下游弓I物GAPDR:5， -cagctctc由ccatgagtcct-3，； TaqMan探针GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，； 引物探针和扩增产物在基因中的位置同实施例1。2. 双色荧光定量PCR反应混合50 ul反应体系，内含两引物各15 pmol，各探针15 pmol,患者或正常人DNA 50-100 ng， IX PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg++终浓度3 mmol/L，然后在FTC2000实时荧 光定量PCR仪上96。C下预变性2 min,然后94。C变性10 sec, 56。C复性30 sec， 6(TC延伸 40.sec，共45个循环，并在60。C延伸时照相。每一个标本重复三次实验。3. 荧光定量PCR的标准曲线将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和GAPDH基因的标准 曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。4. 结果实验表明唐氏综合征患者的GAPDH与DSCR1的差值为1. 88±0. 29，而正常人的GAPDH 与DSCR1的差值为1. 16±0. 17，用2-AA"方法计算换成拷贝数的差异约为1/1. 61 1. 53， 两者间的差异有统计学意义。 实施例31.引物和探针的设计 根据genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列设计DSCR的引物如下
上游引物DSCRF:5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3，； 下游引物DSCRR: 5 ， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 ，； TaqMan探针DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 根据genebank中[gi: 32891804]设计内对照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下上游弓l物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3，； 下游弓(物GAPDR:5' -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探针GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3,; 引物探针和扩增产物在基因中的位置同实施例1。2. 双色荧光定量PCR反应混合50 ul反应体系，内含两引物各15 pmol，各探针15 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， 1 X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2 u'， Mg+十终浓度3 mmol/L,然后在FTC2000实时 荧光定量PCR仪上96'C下预变性2 min，然后94。C变性10 sec， 53。C复性30 sec， 60。C延 伸40 sec，共45个循环，并在60'C延伸时照相。每一个标本重复三次实验。3. 荧光定量PCR的标准曲线将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和GAPDH基因的标准 曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。4. 结果实验表明唐氏综合征患者的GATOH与DSCR1的差值为1. 78±0. 27,而正常人的GAPDH 与DSCR1的差值为1. 05±0. 25，用2—^"方法计算换成拷贝数的差异约为1/1. 51 1. 43, 两者间的差异有统计学意义。 实施例41.引物和探针的设计根据genebank中DSCR1 [gi:7768679]的序列设计DSCR的引物如下上游引物DSCRF:5' -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3，；下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，；TaqMan探针DSCRTM: 5 ， - [FAM] CMGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 根据genebank中[gi: 32891804]设计内对照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的弓l物如下上游弓i物GAPDF:5' -ctccctctttctttgcagcaat-3'; 下游弓l物GAPDR:5， -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探针GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，； 引物探针和扩增产物在基因中的位置同实施例1。2. 双色荧光定量PCR反应混合50 ul反应体系，内含两引物各15 pmol，各探针15 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， 1.5 X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg+十终浓度3 mmol/L,然后在FTC2000实 时荧光定量PCR仪上96。C下预变性2 min，然后94。C变性10 sec， 53。C复性30 sec, 60。C 延伸40 sec,共45个循环，并在6(TC延伸时照相。每一个标本重复三次实验。3. 荧光定量PCR的标准曲线将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和GAPDH基因的标准 曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。4. 结果实验表明唐氏综合征患者的GAPDH与DSCR1的差值为1. 69±0.15，而正常人的GAPDH 与DSCR1的差值为1.02±0. 12，用2—A^方法计算换成拷贝数的差异约为l/1.53: 1.46， 两者间的差异有统计学意义。 实施例51.引物和探针的设计根据genebank中DSCR1 [gi: 7768679]的序列设计DSCR的引物如下上游引物DSCRF: 5 ， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 ，；下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，；TaqMan探针DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，；根据genebank中[gi: 32891804]设计内对照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下上游弓l物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3'; 下游弓l物GAPDR:5， -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探针GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3'; 引物探针和扩增产物在基因中的位置同实施例1。2. 双色荧光定量PCR反应混合50 ul反应体系，内含两引物各25 pmol，各探针25 pmol,患者或正常人DNA 50-100 ng, 1 X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg十+终浓度2. 5咖ol/L,然后在FTC2000实 时荧光定量PCR仪上96'C下预变性2 min，然后94。C变性10 sec, 53。C复性30 see, 60。C 延伸40 sec，共45个循环，并在6(TC延伸时照相。每一个标本重复三次实验。3. 荧光定量PCR的标准曲线将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和GAPDH基因的标准 曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。4. 结果实验表明唐氏综合征患者的GAPDH与DSCR1的差值为1. 85±0. 22,而正常人的GAPDH 与DSCR1的差值为1. 24±0. 32，用2_^"方法计算换成拷贝数的差异约为1/1. 55: 1. 48，两者间的差异有统计学意义。 实施例61.引物和探针的设计根据genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列设计DSCR的引物如下-上游引物DSCRF:5， -CAGMATCCCAGTTCATGTTGCT-3，；下游引物DSCRR: 5 ， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 ，；TaqMan探针DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，；根据genebank中[gi: 32891804]设计内对照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下上游引物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3，；
下游弓l物GAPDR:5' -cagctctcataccatgagtcct-3'; TaqMan探针GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，；引物探针和扩增产物在基因中的位置同实施例1。2. 双色荧光定量PCR反应混合50 ul反应体系，内含两引物各20 pmol,各探针20 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， 1 X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶1. 5 u， Mg十+终浓度2. 5 mmol/L，然后在FTC2000 实时荧光定量PCR仪上96。C下预变性2 min，然后94。C变性10 sec， 56。C复性30 sec, 60 。C延伸40 sec，共45个循环，并在60'C延伸时照相。每一个标本重复三次实验。3. 荧光定量PCR的标准曲线将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和GAPDH基因的标准 曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。4. 结果实验表明唐氏综合征患者的GAPDH与DSCR1的差值为1. 75±0. 28，而正常人的GAPDH 与DSCR1的差值为1, 15±0. 12，用2—A^方法计算换成拷贝数的差异约为l/1.65: 1.55, 两者间的差异有统计学意义。
权利要求
1、一种双色荧光定量共扩增聚合酶链反应试剂盒，含有扩增21号染色体特异单拷贝区段DSCR和16号染色体特异单拷贝区段GAPDH体外扩增的荧光定量PCR试剂，其特征在于，首先根据21号染色体特异的DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列分别合成其特异引物和双色Taqman荧光探针，然后将0.1-0.5umol/L DSCR和GAPDH特异的引物、双色荧光Taqman探针加入同一个PCR扩增缓冲反应体系中，在多色实时荧光定量PCR仪上进行96℃预变性2min后，再94℃变性10sec，52-56℃复性30sec，60-70℃延伸40sec，共45个循环，并在延伸时检测荧光强度，使两对引物分别同时引导新链合成，实现两对引物的共扩增和其拷贝数的定量检测。
2、 根据权利要求1所述的一种双色荧光定量共扩增聚合酶链反应试剂盒，其特征在 于，所述DSCR和GAPDH特异引物和双色Taqman荧光探针的序列分别为DSCR上游引物 5， -CAG AAA TCC CAG TTC ATG TTG CT-3， ; DSCR下游引物5， -CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT-3， ; DSCR TaqMan探针5， -[FAM]CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC[TAMRA]-3，; GAPDH上游引物5， -etc cct ctt tct ttg cag caa t-3， ; GAPDH下游引物5' -cag etc tea tac cat gag tec t-3， ； GAPDH TaqMan探针5， -[HEX] ctg cac cac caa ctg ctt age [TAMRA]-3，。
3、 根据权利要求3所述的一种双色荧光定量共扩增聚合酶链反应试剂盒，其特征在 于，扩增缓冲反应体系中，各个成分及其浓度含量分别如下DSCR和GAPDH特异的引物、 双色荧光Taqman探针各0.1-0. 5咖ol/L、 Taq DNA聚合酶1-3U/50ul、 dNTPs底物0.1-0. 5 ,1/L、模板DNA若干、Mg++1.5-3.5 ,1/L、反应缓冲液0. 5-1. 5XPCR，其中1XPCR反 应缓冲液包括50 mmol/L KCl、 10咖ol/L Tris.HCl PH8. 3、 0. 01%明胶。
全文摘要
本发明公开了一种双色荧光定量共扩增聚合酶链反应试剂盒，首先根据21号染色体特异DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列分别合成其特异引物和双色Taqman探针，然后在同一扩增缓冲反应体系中，经过45个PCR循环，使两对引物分别同时引导新链合成，实现两对引物的共扩增。在PCR扩增的同时检测扩增过程中由于降解Taqman探针获得的荧光信号的强弱变化情况，获得各自的扩增曲线图，进而得出各个基因的Ct值。从而计算它们的拷贝数比值，再根据两个基因拷贝数的比值进一步判断21号染色体的倍性。
文档编号C12Q1/68GK101105454SQ200710014390
公开日2008年1月16日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者夏庆杰, 林 杨 申请人:山东亚大药业有限公司