专利名称：一种在dna载体中同时引入多个dna片段的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种在DNA载体中同时引入多个DNA片段的方法。
背景技术：
对现有的DNA载体进行改造，如改变多克隆位点的序列、引入一个或多个外源DNA片段、以外来片段置换原载体部分(如改变抗性基因的构成)等是分子生物学最基本的操作之一。
经典的DNA载体改造方法的基本步骤是(1)将原载体和待引入片段以产生相同粘端、或产生可以互补粘端、或者同时产生钝末端的限制性内切酶进行处理；(2)将两个或多个目的片段进行琼脂糖凝胶电泳，将目的片段切割下来后，将DNA进行回收；(3)两个或多个目的片段在T4连接酶作用下进行连接；(4)连接产物转化大肠杆菌的电转化或化学转化的感受态细胞，转化溶液涂布在相应的含有抗生素的平板上，温育培养；(5)挑取若干生长出的菌落至含抗生素的液体培养基中，振荡培养；(6)离心收集菌体，质粒提取，以限制性内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果来判断是否获得重组克隆即DNA载体的改造是否成功。
在此经典的实验过程中，寻找在载体上进行合适切割同时又不会破坏外源片段的限制性内切酶是个关键的步骤，然而这常常复杂、耗时甚至难以进行。实验中DNA片段限制性内切酶的酶切、胶回收等都有可能引入碱基的突变。尤其是在需要引入一个以上片段时，所花费的时间和可能引入的碱基突变均是相应成倍增加的。因此，上述经典方法烦琐、耗时、效率低、限制因素多。
为了寻找一种简便、快捷、高效的DNA载体改造方法，尤其是同时将两个目的片段同时引入原载体的方法。本发明利用了采用一种在大肠杆菌内的寡核苷酸之间的重组技术来实现这一目的的。其作用原理是基于两个基因λ噬菌体的redα和redβ基因。redα是DNA链的5’-＞3’核酸外切酶，其作用于双链DNA而产生3′单链突出端的DNA分子；redβ是单链结合蛋白，结合在DNA突出的3′端而阻止单链DNA核酸酶对的DNA消化，redβ同时表现出重组酶活性，即促使单链同源DNA之间的退火。重组系统还包含gam基因和recA基因，前者抑制宿主菌的RecBCD的核酸外切酶活性，阻止其对外源线性双链DNA分子的降解，后者则可以提高重组酶的活性。
发明内容
本发明的目的是提供了一种引入两个以上片段而同时取代原载体上部分序列的直接对DNA载体进行改造的方法。
所说的在DNA载体中同时引入多个DNA片段的方法，其步骤是通过聚合酶链式反应扩增两个或两个以上带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，同时转化至含重组酶载体和待改造的载体的感受态细胞，通过寡核苷酸的同源重组而一步直接获得改造后的载体；所说的两个或两个以上带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，其中第一个片段的5′端有与靶载体待替换部位左侧相同的序列，最后一个3′端有与靶载体待替换部位右侧相同的序列，从第二个片段起的每个片段的5′端有与上一个片段3′端反向互补的序列。
当在DNA载体中同时引入两个DNA片段时，其步骤是通过聚合酶链式反应扩增两个带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，同时转化至含重组酶载体和待改造的载体的感受态细胞，通过寡核苷酸的同源重组而一步直接获得改造后的载体；所说的两个带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，其中第一个片段的5′端有与靶载体待替换部位左侧相同的序列，第二个片段的5′端有与第一个片段3′端反向互补的序列，3′端有与靶载体待替换部位右侧相同的序列。
上述方法中所说的两个带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，其中与载体同源交换的同源臂是50个碱基，两个片段之间的同源臂是30个碱基。
要得到本发明中所说的两个带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，可以按照以下原则设计引物引物1约70个碱基，前50个是与靶载体待替换部位左侧相同序列，后20个左右为扩增第一个待引入片段的5′端序列。这样，引物1即含有与载体左侧相同的50个碱基“同源臂”。
引物230个碱基，为扩增第一个待引入片段的3′端序列；由引物1和引物2扩增第一个待引入片段。
引物3约50个碱基，前30个为引物2的反向互补序列，后20个左右为扩增第二个待引入片段的5′端序列。这样，引物3即与引物2共有30个碱基的“同源臂”。
引物4约70个碱基，前50个是靶载体待替换部位右侧方向的反向互补序列，后20个左右为扩增第二个待引入片段的3′端序列。这样，引物4即含有与载体右侧相同的50个碱基“同源臂”。
由引物3和引物4扩增第二个待引入片段。
当要引入的片段为两个以上时，本领域技术人员同样可参照上述方法设计引物。
在本发明中所说的靶载体待替换部位的碱基数可以为零，当碱基数为零时，实际上是不去除靶载体任何片段，而直接插入目的片段。
已知的重组酶载体都可以用于发明所述的方法，在本发明具体的方案中优选重组酶质粒pSC101-gba-tet。
上述所说的待改造的载体包括但不限于pBluescript KS(-)，其它的DNA载体同样可以用本发明的方法来进行改造。
本发明的一个例子是以将oriT-Am基因盒和rpsL基因克隆至pBluescript KS(-)，同时去除pBluescript KS(-)的氨苄青霉素抗性基因部分为具体的内容。pBluescript KS(-)是最常用的基因克隆载体之一。为了构建在放线菌中使用的基因阻断载体，需将oriT-Am基因盒和rpsL基因克隆至pBluescript KS(-)上，oriT片段负责细菌DNA之间接合转移功能，Am基因为阿普霉素抗性基因，为放线菌基因操作中常用的选择性标记，rpsL基因即30S核糖体的S12蛋白(在天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)基因组中的基因编号为SCO4659)，为链霉素抗性基因。运用本发明的方法可一步将此两段克隆至pBluescriptKS(-)，时间从两个片段的分步克隆(假设实验设计顺利的话)所需的约十天的时间缩短至在三天以内完成。如果计算上本发明所设计的寡核苷酸引物合成需七天，而常规较短的引物需三天的话，本发明的时间较经典方法减少了四天。
因此本发明避免了限制性内切酶的限制，以及凝胶回收等可能引入碱基突变的步骤。简便快速，重组效率极高。
图1是本发明同源重组示意图。
图2是pLS205的质粒图谱，其中21-327单链形成区(fl(-)ori)；460-816LacZ(β半乳糖苷酶α片段)；1851-2658接合转移片段(oriT)；2862-3638阿普霉素(Am)抗性基因的开放阅读框；3879-4250链霉素(rpsL)抗性基因的开放阅读框；1158-1825载体的复制区(pUCori)；SacI(652)-KpnI(754)；多克隆位点(MCS)；SacI，NotI，XbaI，SpeI，BamHI，EcoRI，EcoRV，HindIII，ClaI，XhoI，KpnI均为限制性内切酶位点。
图3是pLS205酶切的琼脂糖凝胶电泳结果具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例中所用到的质粒，均为已公开载体pBluescript KS(-)(Alting-Mees，M.A.and Short，J.M.(1989)pBluescript IIgene mappingvectors。Nucleic Acids Res.17(22)，9494.)购于Novagen公司。
pOJ446(Bierman，M.，R.Logan，et al.(1992).″Plasmid cloning vectors for the conjugaltransfer ofDNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.″Gene 116(1)43-9.)，本实施例中所用pOJ446来自英国John Innes Institute，David Hopwood教授。
pSC101-gba-tet(Zhang，Y.，F.Buchholz，et al.(1998).″A new logic for DNA engineeringusing recombination in Escherichia coli.″Nat Genet 20(2)123-8.)；本实施例中所用pSC101-gba-tet来自德国Dresden University，Youming Zhan博士。
rpsL基因来自天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)，为模式菌株，基因组测序文献Bentley，S.D.，K.F.Chater，et al.(2002).″Complete genome sequence of the modelactinomycete Streptomyces coelicolor A3(2).″Nature 417(6885)141-7。本实施例中所用Streptomyces coelicolor A3(2)来自英国John Innes Institute，David Hopwood教授。
实施例1将oriT-Am基因盒和rpsL基因克隆至pBluescript KS(-)，同时去除pBluescript KS(-)的氨苄青霉素抗性基因部分扩增带同源臂的oriT-Am基因盒引物CT15′-AAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAACTGCAGGTCCCCGGGGATCGGTC-3′前面50个碱基是pBluescript KS(-)的1801至1850部分，后面约23个碱基为质粒pOJ446中2517-2540扩增oriT-Am基因盒的5′端序列；引物CT25′-TCAGCCAATCGACTGGCGAGCGGCATCGCA-3′30个碱基为pOJ446的4255-4284扩增oriT-Am基因盒的3′序列；以pOJ446为模板，CT1和CT2一对引物通过PCR(聚合酶链式反应)扩增出2.0kb的带同源臂的oriT-Am基因盒。
扩增带同源臂的rpsL基因引物CT35′-TGCGATGCCGCTCGCCAGTCGATTGGCTGACGGTGTCGCCCATTTGTTTTG-3′前面30个碱基是CT2的反向互补序列，后面21个碱基为扩增rpsL基因5′端序列；引物CT4
5′-TGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTGCCCTTACGAGGCATTCTTAC-3′前面50个碱基是pBluescript KS(-)的2911-2960的反向互补序列，后面约21个碱基为扩增rpsL基因3′端序列。
以天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)的基因组DNA为模版，CT3和CT4一对引物通过PCR(聚合酶链式反应)扩增出0.6kb的带同源臂的rpsL片段。
以上50μl PCR反应体系33μl dH2O5μl 10×PCR反应缓冲液1.25μl 10mM dNTP1.5μl上游引物(终浓度0.7μM)1.5μl下游引物(终浓度0.75μM)2μl模板(质粒～100ng，基因组DNA～200ng)0.5μl pfu聚合酶(5U/μl)PCR反应条件95℃变性5分钟，(95℃ 45秒，60℃ 1分钟，72℃ 3分钟)，共30个循环，72℃延伸10分钟。使用仪器为MJ researcher公司的PTC-200型号的PCR仪。
反应结束后，以加入20mg/ml的溴乙锭(EB)染料的0.7％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。验明正确后，在溶液中加入1/10倍体积的pH5.2的醋酸钠溶液和2.5倍体积的4℃预冷的无水乙醇，混匀沉淀，离心去上清，室温干燥后，溶于10mM pH8.0的Tris.Cl(三羟甲基氨基甲烷，以浓盐酸调节pH至8.0)，OD260测定DNA浓度，调节浓度为300ng/μl。
含重组酶质粒pSC101-gba-tet的大肠杆菌DH10B的电转化感受态的制备将在-70℃冻存的DH10B/pSC101-gba-tet划线于含10μg/ml四环素的LB固体平板上，30℃培养20小时以上。挑取单菌落至10ml 10μg/ml四环素的LB液体培养基，于30℃过夜振荡培养，12,000rpm，4℃离心3分钟，弃上清，以10％的甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于100μl的10％的甘油中。
pBluescript KS(-)的转化将约100ng pBluescript KS(-)加至50μl冰上融化的DH10B/pSC101-gba-tet的电转化感受态细胞中，轻弹混匀。将混合液转移至冰上预冷的1mm电转池中，电击转化。电转化条件1mm电转池，200Ω，1300V，Bio-Rad公司Gene Pulser IIR电转化仪。加1ml LB液体培养基至电转池，吹打混匀，将溶液转移至一个无菌的1.5ml eppendorf管中，37℃振荡培养60分钟后，转化液涂布与含100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml四环素的LB抗性平板上，30℃培养20小时以上。所获菌株为DH10B/pSC101-gba-tet+pBluescript KS(-)。
DH10B/pSC101-gba-tet+pBluescript KS(-)电转化感受态细胞的制备将在-70℃冻存的菌株划线于含100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml四环素的LB抗性平板，30℃培养20小时以上。挑单菌落至2ml含100μg/ml氨苄青霉素和10μug/ml四环素的LB液体培养基，于30℃振荡过夜培养，按1/50的体积转接至20ml同样的培养基，30℃振荡培养，至OD260为0.2时，加入终浓度为0.15％的L-阿拉伯糖，37℃振荡培养至OD260为0.4时，12,000rpm，4℃离心3分钟，弃上清，以10％的甘油洗涤沉淀两次，最终悬浮于200μl 10％的甘油中。
两个片段的转化将0.3μg 2.0kb的oriT-Am基因盒DNA片段和0.3μg 0.6kb rpsL DNA片段加至50μlDH10B/pSC101-gba-tet+pBluescript KS(-)冰上融化的电转化感受态细胞中，轻弹混匀。将混合液转移至冰上预冷的1mm电转池中，电击转化。电转化条件1mm电转池，200Ω，1300V，Bio-Rad公司Gene Pulser IIR电转化仪。加1ml LB液体培养基至电转池，吹打混匀，将溶液转移至一个无菌的1.5ml eppendorf管中，37℃振荡培养70分钟后，涂布在含50μg/ml阿普霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。其同源交换示意图如图1所示。
在平板上约长出100个菌落，随机挑起12个接种至含50μg/ml阿普霉素的液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按碱裂解法提取质粒，限制性酶切鉴定，证明有11个是正确的克隆，克隆正确率为92％，将正确的克隆命名为pLS205，其结构如图2示。酶切的琼脂糖凝胶电泳结果见图3(粗体的为单酶切位点)。
权利要求
1.一种在DNA载体中同时引入多个DNA片段的方法，其步骤是通过聚合酶链式反应扩增两个或两个以上带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，同时转化至含重组酶载体和待改造的载体的感受态细胞，通过寡核苷酸的同源重组而一步直接获得改造后的载体；所说的两个或两个以上带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，其中第一个片段的5′端有与靶载体待替换部位左侧相同的序列，最后一个3′端有与靶载体待替换部位右侧相同的序列，从第二个片段起的每个片段的5′端有与上一个片段3′端反向互补的序列。
2.如权利要求1所说的方法，其特征在于所说的目的DNA片段为两个，其中第一个片段的5′端有与靶载体待替换部位左侧相同的序列，第二个片段的5′端有与第一个片段3′端反向互补的序列，3′端有与靶载体待替换部位右侧相同的序列。
3.如权利要求2所说的方法，其特征在于，所说的两个带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，其中与载体同源交换的同源臂是50个碱基，两个片段之间的同源臂是30个碱基。
4.如权利要求3所说的方法，其特征在于，所说的第一个带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，由引物1和引物2扩增得到；第二个带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，由引物3和引物4扩增得到；其中引物1约70个碱基，前50个是与靶载体待替换部位左侧相同序列，后20个左右为扩增第一个待引入片段的5′端序列；引物230个碱基，为扩增第一个待引入片段的3′端序列；引物3:约50个碱基，前30个为引物2的反向互补序列，后20个左右为扩增第二个待引入片段的5′端序列；引物4:约70个碱基，前50个是靶载体待替换部位右侧方向的反向互补序列，后20个左右为扩增第二个待引入片段的3′端序列。
5.如权利要求4所说的方法，其特征在于，所说的目的DNA是oriT-Am基因盒和rpsL基因，所说的靶载体是pBluescript KS(-)，所说的待替换部位是pBluescript KS(-)的氨苄青霉素抗性基因部分。
6.如权利要求5所说的方法，其特征在于，扩增oriT-Am基因盒的引物引物CT15′-AAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAACTGCAGGTCCCCGGGGATCGGTC-3′，引物CT25′-TCAGCCAATCGACTGGCGAGCGGCATCGCA-3′；扩增rpsL基因的引物引物CT35′-TGCGATGCCGCTCGCCAGTCGATTGGCTGACGGTGTCGCCCATTTGTTTTG-3′，引物CT45′-TGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTGCCCTTACGAGGCATTCTTAC-3′。
全文摘要
本发明涉及一种在DNA载体中同时引入多个DNA片段的方法。该方法的步骤是通过聚合酶链式反应扩增两个或两个以上带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，同时转化至含重组酶载体和待改造的载体的感受态细胞，通过寡核苷酸的同源重组而一步直接获得改造后的载体；所说的两个或两个以上带寡核苷酸同源臂的目的DNA片段，其中第一个片段的5′端有与靶载体待替换部位左侧相同的序列，最后一个3′端有与靶载体待替换部位右侧相同的序列，从第二个片段起的每个片段的5′端有与上一个片段3′端反向互补的序列。。本发明的方法设计简单，实验过程简便快速，无需DNA限制性内切酶的作用和DNA片段的回收，避免了可能引入的突变，本发明可能成为通用的改造DNA载体的方法。
文档编号C12N15/66GK101016551SQ20071001986
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月1日 优先权日2007年2月1日
发明者尚广东, 谢峰 申请人:南京师范大学