专利名称：水稻hpfr基因、表达产物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻hpfr基因、表达产物及其用途，属农业生物技术领域，用于防治植物病虫害、促进植物生长和提高作物产量。
背景技术：
hrp基因是植物病原细菌中决定在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitiveresponse，HR)和在寄主植物上致病性的基因[Lindgren P B，The role of hrp genes duringplant-bacterial interaction.Annu Rev Phytopathol，1997，35129～152]。过敏反应是植物产生的一种局部的、快速的细胞编程死亡(programmed cell death，PCD)形式。PCD可以引发一种或多种信号传导途径，赋予植物多种抗环境胁迫能力。
国内外对植物病原细菌的hrp基因做了较详细的研究。Wei等人首次发现梨火疫病菌Erwinia amylovora的hrpN基因编码的一种新蛋白质能诱导植物产生过敏反应，并将其命名为Harpin。该蛋白质的特点是富含甘氨酸和缺乏半胱氨酸，热稳定，具有诱导植物产生过敏反应、诱导抗病和促进作物生长等生物活性[Wei Z M，Laby R J，Zumoff C H，et al.Harpin，elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora.Science，1992.25785～88]。现已陆续从丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和黄单胞菌Xanthomonasoryzae等多种植物病原细菌中鉴定出具有harpin活性的蛋白质。它们是由相应的植物病原细菌hrp基因簇中特定hrp基因编码的。
闻伟刚等从水稻白叶枯病菌X.oryzae pv.oryzae中克隆了hrp基因，即hrfAXoo基因，该基因核苷酸序列大小为420bp，编码产物harpinXoo分子量为15.6kD，该蛋白质具有harpins的功能注射烟草可以诱导植物产生过敏反应；在体外喷雾处理植物可以诱导植物产生抗性和促进作物生长等[闻伟刚，邵敏，陈功友，王金生，水稻白叶枯病蛋白质激发子诱导植物的防卫反应.农业生物技术学报，2003，11(2)192～197]。表达该蛋白质的基因工程菌株已经正在进行产业化研究与开发，相关的研究已经申请国家专利保护[专利号ZJ00135403.5]；将hrfAXoo基因转化水稻，具有提高水稻对稻瘟病、白叶枯病的抗性[邵敏，王金生，转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性，南京农业大学学报2004，27(4)36-40]，相关研究已受国家专利保护[专利号ZL 02157213.5.]。因此，植物病原细菌中的hrp基因及其应用研究得较多，但植物中类似于harpin编码基因及其应用研究至今尚未有报道。
发明内容
技术问题 本发明的目的是提供水稻中的hpfr基因、表达产物及其用途。来自于水稻的hpfr基因的表达产物，防治植物病害、促进作物生长。
技术方案本发明所提供的基因具有以下特征
1.水稻hpfr基因来源设计引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法从水稻中扩增出该片段。该基因片段命名为hpfr基因(图1)。以hpfr基因为探针，与水稻基因组总DNA杂交，杂交结果显示，在水稻基因组中有杂交阳性信号(图2)。
2.水稻hpfr基因的核苷酸序列水稻hpfr基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1(图3)确定该基因大小为405bp，起始密码子处存在EcoRI酶切位点GAATTC，编码区域富含GGT或GGC示编码甘氨酸(glycine，G)的密码子(阴影区)，有4个GGCGGC重复区域(方框区)。ATG示起始密码子，TAA示终止子。
3.水稻hpfr基因编码的推导氨基酸序列水稻hpfr基因编码的推导氨基酸序列为SEQ IDNO.2(图4)，根据hpfr基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列为134个氨基酸。富含甘氨酸(阴影区)，不含半光氨酸。
4.水稻hpfr基因体外表达将水稻hpfr基因构建于蛋白质体外高效表达载体pET30a(+)形成重组质粒pETR(图5)，产生水稻hpfr基因的体外表达产物，命名为hpfr蛋白质，其特征类似于harpinxoo的功能能够诱导非寄主植物烟草在24小时内产生过敏反应(图6)、亲水性、对热稳定性、对蛋白酶敏感性，经过SDS-PAGE电泳，确定该蛋白质的分子量约为14.5kD(图7)。
5.水稻hpfr蛋白质的理化特性hpfr蛋白质经100℃水浴10min后，仍然能够在24h内激发烟草产生过敏性反应，活性也没有明显的下降；用蛋白酶水解30min后则完全丧失了激发过敏反应的能力，这表明hpfr蛋白质热稳定，但对蛋白酶敏感。
6.水稻hpfr基因的表达产物的应用水稻hpfr基因的表达产物hpfr蛋白质配制成适当浓度，在作物的不同生长季节用于作物叶面喷施，也可以用于作物移栽时浸根处理，防治植物病害、促进作物生长。
7.来源于植物的与上述水稻hpfr基因的同源序列hpfx基因，其特征在于，用水稻hpfr基因引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，以植物的基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出hpfx基因，PCR扩增条件94℃/5min的1个循环，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35个循环，72℃/7min的1个循环；hpfx基因编码产物具有诱导烟草产生过敏反应反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。hpfx基因所编码的产物为hpfx蛋白质。
8、来源于小麦的与水稻hpfr基因的同源序列hpfw基因，其序列为SEQ ID NO.3，其推导的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，hpfw基因编码产物hpfw蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。
有益效果本发明人将hrfAXoo基因转化水稻[邵敏，王金生，转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性，南京农业大学学报，2004，27(4)36-40]，在转基因水稻分子检测时发现水稻中存在与hrfAXoo基因同源序列，并将其克隆和在体外表达，其表达产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长等功能，在植物中发现类似于harpin编码基因尚属首次。
本发明为水稻中与水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)的hrp基因同源序列、表达产物及其用途，来源于水稻的hrp基因同源序列表达产物与水稻黄单胞菌hrp基因的编码产物harpinXoo有相似的功能，所以将该基因命名为hpfr(hrp-like function loci in rice)基因。该基因大小为405bp。
本发明研究发现hpfr基因在体外的表达产物与水稻黄单胞菌的hrp基因表达产物有相似的功能，即促进植物生长、诱导抗病虫性等，本发明已从水稻中克隆了hpfr基因，并构建至表达载体中，获得表达产物。
研究结果表明，hpfr蛋白质处理烟草有明显诱导烟草抗TMV的能力(图8)。将hpfr蛋白质处理的番茄、辣椒长势明显优于未处理(图9)，采摘期提前1周左右hpfr蛋白质处理番茄产量比未处理提高40.3％，辣椒提高31.6％。番茄上病毒病害发生明显减轻(图10)。
用hpfw蛋白质喷雾处理番茄，具有促进植物生长功能(图14)，同时，明显减少番茄早疫病的发生；用该蛋白质喷雾处理黄瓜，对黄瓜霜霉病有较好的防治效果(表2)。
四
图1水稻hpfr基因PCR扩增电泳2水稻hpfr基因为探针与水稻基因组总DNA杂交结果M-Marker，hplr-hplr基因阳性对照，1、2、3-水稻基因组总DNA图3水稻hpfr基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1图4水稻hpfr基因推导氨基酸序列SEQ ID NO.2图5水稻hpfr基因构建于pET30a(+)上酶切电泳6水稻hpfr蛋白质诱导烟草产生过敏反应A-BL21(DE3)/pETR的粗蛋白质抽提物，B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白质抽提物C-H2O图7水稻hpfr蛋白质SDS-PAGE电泳图M-Marker，1.BL21(DE3)/pETR提取的CFEP，2.纯化的水稻hpfr蛋白质图8 BL21(DE3)/pETR表达水稻hpfr蛋白质诱导烟草抗TMV图9水稻hpfr蛋白质叶面喷施番茄、辣椒促进生长图10水稻hpfr蛋白质叶面喷施番茄减轻病毒病害发生图11小麦hpfw基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3图12小麦hpfw基因推导氨基酸序列SEQ ID NO.4图13小麦hpfw蛋白质SDS-PAGE电泳14小麦hpfw蛋白质诱导烟草产生过敏反应A-BL21(DE3)/pETW的粗蛋白质抽提物，B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白质抽提物C-H2O
图15小麦hpfw蛋白质叶面喷施番茄促进生长五具体实施方式
实施例11.水稻hpfr基因的发现与克隆根据水稻黄单胞菌白叶枯病致病变种hrfAXoo基因开放阅读框设计水稻hpfr基因引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法从水稻中扩增出来源于水稻中hpfr基因。PCR扩增条件94℃/5min的1个循环，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35个循环，72℃/7min的1个循环。将该基因片段命名为hpfr基因(图1)。以水稻hpfr基因为探针，与水稻基因组总DNA杂交，杂交结果显示，在水稻基因组中有杂交阳性信号(图2)。
2.水稻hpfr基因的体外表达PCR产物纯化后经NdeI和BamHI酶切，连接于表达载体pET30a(+)上，获得重组质粒为pETR[pET30a(+)∷hpfr](图5)。将pETR转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组微生物BLTR[BL21(DE3)/pET30a(+)∷hpfr]，在将重组微生物BLTR的单菌落接种20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振荡培养12h，转接于20ml的LB+Km 20μg/ml中37℃下振荡培养3h，将1M的IPTG(TaKaRa公司)加入其中，使其终浓度为1mM，继续培养2h。离心(5000rpm，10min)收集菌体。菌体于100℃水浴煮沸10min，冷却后离心(12000rpm，10min)，取上清(Cell-free ElicitorProtein，CFEP)，注射烟草叶片叶肉组织细胞中，24h内产生过敏反应(图6)。取上清液3μl进行12％SDS-PAGE电泳，根据标准蛋白质的分子量推算，水稻hpfr蛋白质的分子量约为14.5kD(图7)。
3.实验室小计量生产水稻hpfr蛋白质将重组微生物BLTR9的单菌落接种20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振荡培养12h，转接于5L的玉米粉发酵培养基(味精1％，酵母膏1％，玉米粉3.5％)+Km 20μg/ml中37℃下发酵培养3h，加乳糖(终浓度为10mM)诱导培养2h。离心(5000rpm，10min)收集菌体。菌体于100℃水浴煮沸10min，冷却后离心(12000rpm，10min)，取上清，即为水稻hpfr蛋白质。1L玉米粉发酵培养基大约可以产生1.5g hpfr蛋白质。
实施例2水稻hpfr基因表达产物hpfr蛋白质的直接使用水稻hpfr基因的表达产物hpfr蛋白质按15、30、60μg/ml的浓度对植物进行叶面喷洒。
1.诱导Xanthi烟草对TMV的抗性表型将水稻hpfr和harpinXoo蛋白质的CFEP母液分别稀释至浓度为15、30、60μg/ml，用微型喷雾器喷施成株期珊西烟，每处理5个重复；16h后，用摩擦接种活化的TMV于烟草叶片上；4天后观测结果，并统计病斑数。研究结果表明，水稻hpfr和harpinXoo处理烟草，都有明显诱导烟草抗TMV的能力(枯斑数目上的减少)(图8)。经LSD法多重比较分析(F189.464)表明，BL21(DE3)/pETR和BL21(DE3)/pET30a(+)∷hrfAXoo的蛋白质抽提物处理与pET30(a)/BL21(DE3)蛋白质抽提物对照相比差异极显著(表1)。在浓度为60uL/mL时诱导抗病性效果最显著，水稻hpfr蛋白质的防效为96.35％，与harpinXoo防效(95.9％)相近。
2.促进植物生长，提高产量将水稻hpfr蛋白质CFEP母液稀释至浓度为60μg/ml；在番茄、辣椒大棚，分别在苗期、花期和座果期喷施，研究结果表明，处理的番茄、辣椒长势明显优于未处理(图9)，采摘期提前1周左右水稻hpfr蛋白质处理番茄产量比未处理提高40.3％，辣椒提高31.6％。番茄上病毒病害发生明显减轻(图10)。
表1 BL21(DE3)/DETR9表达水稻hpfr蛋白质诱导烟草抗TMV的效果
*P＜0.01水平上的差异显著性来源于植物的与上述水稻hpfr基因的同源序列统一命名为hpfx基因，其特征在于，用实施例1水稻hpfr基因引物，以植物的基因组DNA为模板，用PCR方法(方法同实施例1)扩增出hpfx基因，其编码产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。hpfx基因所编码的产物统一命名为hpfx蛋白质。
下面实施例以小麦为例，从小麦中获得与水稻hpfr基因同源的基因为hpfw，表达产物为hpfw蛋白质。
实施例3小麦中与水稻hpfr基因同源hpfw基因克隆与表达1.小麦hpfw基因克隆与核苷酸序列用设计引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法(方法同实施例1)从小麦中扩增与水稻hpfr基因同源基因，命名为hpfw基因。hpfw基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3(图11)，大小为414bp，与水稻hpfr基因的同源性为93％。hpfw基因推导氨基酸序列为SEQ ID NO.4(图12)。
2.小麦hpfw基因的体外表达和小计量生产hpfw蛋白质(方法同实施例1)将小麦hpfw基因连接于表达载体pET30a(+)上，获得重组表达载体pETW9[pET30a(+)∷hpfw]，通过大肠杆菌BL21(DE3)表达的产物，命名为hpfw蛋白质。该经12％SDS-PAGE电泳，根据标准蛋白质的分子量推算，小麦hpfw蛋白质的分子量约为14.8kD(图12)。
3.小麦hpfw蛋白质的生物活性小麦hpfw蛋白质注射烟草叶片叶肉组织细胞中，24h内激发烟草产生过敏反应(图13)；用该蛋白质喷雾处理番茄，结果表明，该蛋白质具有促进植物生长功能(图14)，同时，明显减少番茄早疫病的发生；用该蛋白质喷雾处理黄瓜，对黄瓜霜霉病有较好的防治效果(表2)。
表2.小麦hpfw蛋白质对作物病害的防治效果(相对防效，％)
序列表<110>南京农业大学<120>水稻hpfr基因、表达产物及其应用<130>说明书<140>00<141>2007-02-05<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>405<212>DNA<213>Oryza sativa(水稻)<220>
<221>gene<222>(1)..(405)<223>
<400>1atgaattctt tgaacacaca attcggcggc agcacgtcca accttcaggt tggcccaagc60caggacacaa cgttcggttc gaaccagggc ggcaaccagg gcatctcgga aaagcaactg120gaccagttgc tgtgccagct catctcggcc ctgcttcagt cgagcaaaaa tgctgaggag180ggtaagggtc agggtggcga taatggcggt ggccagggcg gcaatcagca ggccgggaag240gagaatggcg cctcgccact cacccagatg ctgatgaata tcgtcggaga gattctccag300gcgcagaatg gtggtggtgc cggtggtgcc ggcggcagca gcggcggcga ctttggtggc360agtttcgcca gcagcttctc gaacgacagc gcatcaatgc agtaa405<210>2<211>134<212>PRT<213>Oryza sativa(水稻)<220>
<221>水稻hpfr基因表达的氨基酸序列<222>(1)..(134)<223>富含苷氨酸<400>2Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Phe Gly Gly Ser Thr Ser Asn Leu Gln1 5 10 15Val Gly Pro Ser Gln Asp Thr Thr Phe Gly Ser Asn Gln Gly Gly Asn20 25 30Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Cys Gln Leu Ile35 40 45Ser Ala Leu Leu Gln Ser Ser Lys Asn Ala Glu Glu Gly Lys Gly Gln50 55 60Gly Gly Asp Asn Gly Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gln Gln Ala Gly Lys65 70 75 80Glu Asn Gly Ala Ser Pro Leu Thr Gln Met Leu Met Asn Ile Val Gly85 90 95Glu Ile Leu Gln Ala Gln Asn Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly100 105 110Ser Ser Gly Gly Asp Phe Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ser Phe Ser Asn115 120 125
Asp Ser Ala Ser Met Gln130 134<210>3<211>414<212>DNA<213>小麦(Triticum aestivum)<220>
<221>小麦hpfw基因<222>(1)..(414)<223>
<400>3atgaactctt tgaacacaca attcggcggc agcgcgtcca acttccaggt tgaccaaagc60cagaacgcgc aatccgattc gagccagggc agcaatggca gccagggtat ctcggaaaag120caactggacc agttgctgtg ccagctcatc tcggccctgc ttcagtcgag caaaaatgct180gaggagggta agggtcagca gggtggcgag aatggcggtg gccagggcgg caatcagcag240gccgggaagg agaatggcgc ctcgccactc acccagatgc tgatgaatat cgtcggagag300attctccagg cgcagaatgg tggtggtgcc ggtggtgccg gcggcagcag cggcggcgac360tttggtggca gtttcgccag cagcttctcg aacggaagcg catcaatgca gtaa 414<210>4<211>137<212>PRT<213>小麦(Triticum aestivum)<220>
<221>小麦hpfw氨基酸<222>(1)..(137)<223>
<400>4Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Phe Gly Gly Ser Ala Ser Asn Phe Gln1 5 10 15Val Asp Gln Ser Gln Asn Ala Gln SerAsp Ser Ser Gln Gly Ser Asn20 25 30Gly Ser Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Cys Gln35 40 45Leu Ile Ser Ala Leu Leu Gln Ser Ser Lys Asn Ala Glu Glu Gly Lys50 55 60Gly Gln Gln Gly Gly Glu Asn Gly Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gln Gln65 70 75 80Ala Gly Lys Glu Asn Gly Ala Ser Pro Leu Thr Gln Met Leu Met Asn85 90 95Ile Val Gly Glu Ile Leu Gln Ala Gln Asn Gly Gly Gly Ala Gly Gly100 105 110Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly Asp Phe Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ser115 120 125Phe Ser Asn Gly SerAla Ser Met Gln130135 137<210>5<211>33<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>水稻hpfr基因引物左序列
<222>(1)..(33)<223>
<400>5ggaattccat atgaactctt tgaacacaca att 33<210>6<211>31<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>水稻hpfr基因引物右序列<222>(1)..(31)<223>
<400>6cgggatccta ttactgcatt gatgcgcttc c 3权利要求
1.水稻hpfr基因，其序列为SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述水稻hpfr基因编码的推导氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.权利要求1所述水稻hpfr基因的表达产物，命名为hpfr蛋白质，该蛋白质的分子量为14.5kDa。
4.权利要求3所述水稻hpfr基因的表达产物在防治植物病害、促进作物生长方面的应用。
5.来源于植物的与权利要求1所述水稻hpfr基因同源的序列hpfx基因，其特征在于，用水稻hpfr基因引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，以植物的基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出hpfx基因，PCR扩增条件94℃/5min的1个循环，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35个循环，72℃/7min的1个循环；hpfx基因编码产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。
6.权利要求5所述hpfx基因所编码的产物hpfx蛋白质。
7.根据权利要求5所述的hpfx基因，其特征在于，来源于小麦的与权利要求1所述水稻hpfr基因的同源序列hpfw基因，其序列为SEQ ID NO.3，推导的氨基酸序列为SEQ IDNO.4，小麦hpfw基因编码产物hpfw蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。
全文摘要
本发明涉及水稻hpfr基因、表达产物及其用途，属农业生物技术领域，用于防治植物病虫害、促进植物生长和提高作物产量。本发明为水稻hpfr基因，是首次从植物中发现具有类似植物病原细菌hrp基因功能的基因序列，编码产物具有激发子的功能，在烟草上产生过敏反应、诱导植物产生抗病性、促进植物生长和提高农作物产量等，由于hpfr基因来源于植物，表达产物hpfr蛋白质通过高效表达载体与微生物发酵产生，是经济环保的生物农药，可以用于大田和保护地植物病虫害防治和提高产量。本发明还提供了小麦hpfw基因，其表达产物hpfw蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。
文档编号C12N15/82GK101037697SQ20071002034
公开日2007年9月19日 申请日期2007年2月14日 优先权日2007年2月14日
发明者邵敏, 高学文, 黄万春, 郭玲, 王金生 申请人:南京农业大学