专利名称：一种产酸克雷伯氏菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种产酸克雷伯氏菌，利用该产酸克雷伯氏菌生物合成2，3-丁二醇并降低该过程中副产物有机酸产量的方法，以及该产酸克雷伯氏菌在2，3-丁二醇生物合成过程中的应用。
背景技术：
2，3-丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域(Syu M J.ApplMicrobiol Biotechnol，2001，55(1)10-18)。其脱水产物甲乙酮是一种低沸点的溶剂，可应用于涂料、粘结剂、润滑剂、染料、油墨等行业，同时又能用作有机合成香料、抗氧剂等的中间体；酯化后的脱水产物1，3-丁二烯是一种重要的石油化工基础有机原料和合成橡胶单体；同甲乙酮浓缩脱氢后形成的辛烷异构体，可用来生产高级航空用油；其高价值的衍生物3-羟基丁酮(乙偶姻)和丁二酮广泛应用于食品、香料以及化妆品等行业；同时因其热值较高(27,200kJ/kg)，同乙醇(29,100kJ/kg)相当，可作为燃料添加剂使用。手性2，3-丁二醇除了以上用途外，还可用作为药物的手性载体和液晶材料的手性添加剂(Garg S，Jain A.Bioresour Technol，1995，51(2)103-109)。
目前化学法生产2，3-丁二醇，主要是以石油裂解时产生的四碳类的碳氢化合物(主要成分是77％的丁烯和23％的丁烷和异丁烷的混合物)为原料，混合物中的丁烯经过HClO的氧化及NaOH的作用后，在高温高压下水解得到几种不同种类的丁二醇(2，3-丁二醇和1，2-丁二醇等)，然后再通过减压分馏的方法分离获得。而自然界中的某些细菌具有产2，3-丁二醇的能力，主要包括克雷伯氏菌属(Klebisella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)等(Afschar A S，Vaz Rossell C E，Jonas R，et al.J Biotechnol，1993，27(3)317-329)。在这些细菌中，克雷伯氏菌属的产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca和芽孢杆菌属的多粘芽孢杆菌Bacillus polymyxa显示出较高的生产2，3-丁二醇的潜力，尤其是前者，因为具有宽广的底物范围以及对培养条件具有很好的适应能力等优点，所以经常用于生物合成2，3-丁二醇的研究(Jansen N B，Flickinger M C，Tsao G T.BiotechnolBioeng，1984，26(4)362-369)。而后者虽然产2，3-丁二醇的能力不及前者，但其能够分泌淀粉酶，因而可以直接利用淀粉类物质发酵产2，3-丁二醇；而且该菌株产生的2，3-丁二醇中，主要是D型的2，3-丁二醇(Mas C D，Jansen N B，Tsao G T.Biotechnol Bioeng，1988，31(3)366-377)，常用于制备手性2，3-丁二醇，因而也是微生物发酵法生产2，3-丁二醇的热门菌株之一。2，3-丁二醇发酵的主要特点有2，3-丁二醇对菌株的毒性小，从而可以在发酵罐中进行高浓度的发酵生产；以Klebsiella oxytoca为代表的2，3-丁二醇的生产菌株的不仅可以利用各种主要的糖类(己糖、戊糖和一些二糖等)，还可以利用纤维素和半纤维素水解所产生的糖醛酸，底物谱十分宽广。2，3-丁二醇的化学合成方法的成本同生物法相比要高得多，而且同生物法相比，化学法过程繁琐，不易操作，所以一直很难实现大规模工业化生产，其用途也没有得到充分的开发。用生物法来制备2，3-丁二醇既符合绿色化工的要求，又可以克服化学法生产的困难，同时可以实现人类社会生产由传统的以不可再生化石资源为原料的石油炼制向以可再生生物质资源为原料的生物炼制转型(Ragauskas A J，Williams C K，Davison B H，et al.Science，2006，311(5760)484-498)，逐渐减少对日益枯竭的石油资源的依赖。近年来，随着石油价格的日益攀升，用微生物发酵法生产2，3-丁二醇，并对其系列衍生物进行开发应用逐渐引起了人们的关注(Syu M J.Appl Microbiol Biotechnol，2001，55(1)10-18)。
Klebsiella oxytoca作为2，3-丁二醇的最佳生产菌株之一，在生物合成2，3-丁二醇过程中经由一种混合酸代谢途径，发酵的终产物除了2，3-丁二醇外，还有一定量的副产物有机酸(乙酸、乳酸、甲酸等)产生(Jansen N B，Tsao G T.Adv Biochem Eng Biotechnol，1983，2785-99)。这些有机酸的产生，不仅降低了底物的转化率，而且会造成发酵过程中发酵液pH值下降，不利于微生物的生长，影响菌体细胞的代谢，从而不利于2，3-丁二醇的生物合成。因此，降低Klebsiella oxytoca生物合成2，3-丁二醇过程中副产物有机酸的含量有助于提高底物的利用率和2，3-丁二醇的产率。
发明内容
本发明的目的是提供一种合成2，3-丁二醇的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
本发明的另一个目的是提供利用上述产酸克雷伯氏菌合成2，3-丁二醇并降低副产物有机酸产量的方法。
本发明还有一个目的是提供上述产酸克雷伯氏菌在减少副产物有机酸产量的2，3-丁二醇生物合成中的应用。
本发明使用菌株Klebsiella oxytoca ME-303(CCTCC NOM 207023)生物合成2，3-丁二醇，该菌株在生物合成2，3-丁二醇过程中产生的副产物种类较现有技术公开的其他产酸克雷伯氏菌的副产物种类少，主要产生两种酸性副产物乳酸和乙酸，且产酸量也较其他产酸克雷伯氏菌的产酸量少。由于酸性副产物造成发酵过程中发酵液的pH值不断下降，影响菌株细胞内与目标产物2，3-丁二醇生物合成相关酶系的活性，从而不利于2，3-丁二醇的生物合成，而且这些有机酸副产物的产生还降低了底物转化到目标产物2，3-丁二醇的转化率。针对以上存在的问题，本发明利用紫外线和硫酸二乙酯(DES)对菌株CCTCC NOM 207023进行复合处理后应用设计的含溴化钠和溴酸钠的选择性固体培养基快速定向地降低该菌株生物合成2，3-丁二醇过程中两种有机酸副产物。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的一种产酸克雷伯氏菌，其分类命名为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ME-303，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是CCTCC NOM 207023。
利用所述产酸克雷伯氏菌CCTCC NOM 207023生物合成2，3-丁二醇，并降低该过程中副产物有机酸产量的方法，其特征在于采用紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合处理菌株CCTCC NOM 207023，然后将处理后的菌株接种到含溴化钠和溴酸钠的选择性固体培养基上培养，经遗传稳定性考察后，挑取单菌落进行发酵，制备2，3-丁二醇。
所述的方法中采用紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合处理菌株是采用强度为15～30w的紫外线照射2～5min后再采用按质量百分比计终浓度为0.5％～2％的DES处理20～50min。
所述的方法中含溴化钠和溴酸钠的选择性固体培养基是在普通LB固体培养基中添加一定量的葡萄糖、溴化钠和溴酸钠混合物，其中溴化钠和溴酸钠的摩尔比为1∶1～5∶1。
所述的方法中选择性固体培养基中葡萄糖的浓度为10～100g/L，溴化钠的浓度为200～900mmol/L，溴酸钠的浓度为50～225mmol/L。
所述产酸克雷伯氏菌在减少副产物有机酸产量的2，3-丁二醇生物合成中的应用。
以下是本发明技术方案的详细描述本发明采用在生物合成2，3-丁二醇过程中副产物种类少的产酸克雷伯氏菌CCTCCNOM 207023，并将菌株CCTCC NOM 207023菌悬液经紫外线和硫酸二乙酯复合处理后，在选择性固体培养基中涂布培养，能存活下来的菌落即产有机酸较少或不产有机酸。
一、选择性固体培养基的设计在本发明中，设计了一种选择性固体培养基，在LB固体培养基中添加一定量的葡萄糖和溴化钠-溴酸钠混合物(溴化钠与溴酸钠的摩尔比为1∶1～5∶1)，优选葡萄糖的浓度为10～100g/L，溴化钠的浓度为200～900mmol/L，溴酸钠的浓度为50～225mmol/L。菌株CCTCC NOM 207023在选择性固体培养基中生长时，利用其中的葡萄糖作为碳源生成有机酸，有机酸解离出的质子(H+)与选择性固体培养基中的溴酸根离子(BrO3-)和溴离子(Br-)发生如式(1)和式(2)所示的化学反应，生成对微生物菌株具有致命毒害作用的单质溴；利用这种方法(产酸较多的菌株自身产生的质子参与式(1)和式(2)所示的化学反应生成单质溴“杀”死自身)。
(1)BrO3-+2Br-+H+→Br2+BrO2-+H2O(2)BrO2-+2Br-+H+→Br2+BrO-+H2O二、紫外线和硫酸二乙酯复合处理具体操作步骤是取培养10～20h生长丰满的菌株CCTCC NOM 207023斜面4支，用10mL无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入一支无菌大试管。将试管在振荡混合器上振荡20～50s打散菌块，8000r/min离心10～20min，弃上清，制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，调整细胞浓度为1～5×108个/mL，作为待处理菌液，取2～8mL加到直径为6cm的无菌培养皿内，并放入无菌磁力搅拌器，在距离为10～40cm功率为15～30w紫外灯下搅拌照射2～5min，取该菌悬液3～10mL接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶内，37℃避光培养10～20h后，取10mL培养液8000r/min离心10～20min，弃上清，以20mL 0.1mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤两次，最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液，吸取5mL菌悬液至50mL三角瓶内，并加入15mL 0.1mol/LpH 7.0的磷酸缓冲液制成约为108个/mL的菌悬液，再加0.2～0.8mL DES乙醇溶液(0.5g/mL)，使DES在菌悬液中的终浓度为0.5％～2％(质量百分比)，震荡处理20～50min后立即加入0.2～0.8mL 25％的硫代硫酸钠溶液终止反应，然后以10倍稀释法作一系列稀释至10-5，取0.5mL涂于选择性固体培养基上，培养10～20h后，收集单菌落，继续在同样的选择性固体培养基上划线培养，连续培养5～10代以考察存活菌落的遗传稳定性，挑选遗传稳定的存活菌落备用。
三、发酵验证挑取经紫外线和硫酸二乙酯复合处理后能够在选择性平板上存活且经验证遗传较稳定的菌落进行分批发酵验证，并采用未经处理的CCTCC NOM 207023作对照，在一定的发酵条件下发酵36～54h，用HPLC法测定发酵终止时发酵液中目标产物2，3-丁二醇和两种酸性副产物乳酸和乙酸的产量，进行比较分析。
本发明的有益效果
本发明操作简单且工作量少，不涉及基因操作，成本较低，效率高且周期短，能够快速定向地降低菌株CCTCC NOM 207023生物合成2，3-丁二醇过程中的副产物乳酸和乙酸的产量，提高底物的利用率及2，3-丁二醇的得率，进一步降低生物法制备2，3-丁二醇的成本。
生物材料保藏信息产酸克雷伯氏菌，其分类命名为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ME-303，已在中国典型培养物保藏中心保藏(简称CCTCC，地址中国.武汉.武汉大学)，保藏日期2007年3月16日，保藏编号为CCTCC NOM 207023。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
一般性说明LB液体培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0～7.2。
LB固体培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，琼脂15，pH 7.0～7.2。
选择性固体培养基(g/L)葡萄糖10-100，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，琼脂15，溴化钠+溴酸钠(摩尔比为1∶1～5∶1，溴化钠的浓度为200～900mmol/L，溴酸钠的浓度为50～225mmol/L)。
发酵培养基(g/L)葡萄糖100，MgSO4·7H2O 0.25，FeSO4·7H2O 0.05，ZnSO4·7H2O0.001，MnSO4·H2O 0.001，CaCl20.01，K2HPO4·3H2O 13.7，KH2PO42.0，(NH4)2HPO43.3，(NH4)2SO46.6以上各种培养基均在115～121℃下灭菌15～20min(其中在配制选择性固体培养基时，溴酸钠溶液单独配制，灭菌后再加入，混匀倒平板)。
发酵条件发酵过程在5L全自动发酵罐(NBS，New Brunswick，USA)中进行，装液量3L，接种量5％(即每3L发酵液接种150mL种子液，接种时的种子液总是取对数生长期(培养时间约为12h)的种子液，其浓度是一定的)，发酵温度37℃，转速为200r/min，供氧速率0.7vvm。
底物、产物及副产物含量的HPLC测定方法发酵液中残留底物葡萄糖、产物2，3-丁二醇和各种酸性副产物如乳酸和乙酸等采用DIONEX summit P680高效液相色谱仪测定。色谱柱为Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)，柱温为60℃，检测器为SHODEX RI-101折光示差检测器，流动相为0.005mol/L H2SO4，流速为0.2mL/min，进样量为20μL。
菌落的遗传稳定性测定方法将菌落在选择性固体培养基上连续培养5～10代，观察其生长情况，仍然能够生长者即为遗传稳定。
实施例1步骤一紫外线与硫酸二乙酯(DES)复合处理菌株CCTCC NOM 207023。
取培养12h生长丰满的Klebsiella oxytoca CCTCC NOM 207023斜面(斜面培养基即为LB固体培养基)4支，用10mL无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入一支无菌大试管。将试管在振荡混合器上振荡30s打散菌块，8000r/min离心15min，弃上清，制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，调整细胞浓度为108个/mL，作为待处理菌液，取5mL待处理菌液加到直径为6cm的无菌培养皿内，并放入无菌磁力搅拌器，在距离为30cm功率为15w紫外灯下搅拌照射2min，取该菌悬液5mL接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶内，37℃避光培养12h后，取10mL培养液8000r/min离心15min，弃上清，以20mL 0.1mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤两次，最后用原体积(20mL)的磷酸缓冲液制成菌悬液，吸取5mL菌悬液至50mL三角瓶内，并加入15mL 0.1mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液制成约为108个/mL的菌悬液，再加0.4mLDES乙醇溶液(0.5g/mL)，使DES在菌悬液中的浓度为1％，震荡处理30min后立即加入0.5mL 25％的硫代硫酸钠溶液终止反应，然后以10倍稀释法作一系列稀释至10-5，取0.5mL涂布于选择性固体培养基(向LB固体培养基添加的葡萄糖浓度为50g/L；溴化钠和溴酸钠的摩尔比为4∶1，浓度分别为500mmol/L和125mmol/L)进行培养。
步骤二发酵验证挑取在选择性固体培养基中存活的一个单菌落，继续在同样的选择性固体培养基上划线培养，经连续培养5代经考察遗传稳定性后，挑取单菌落接种于发酵培养基进行发酵(发酵条件见一般性说明)，发酵54小时，取5mL发酵液8000r/min离心15min后，用HPLC分析上清中2，3-丁二醇以及副产物乙酸和乳酸的浓度，与处理前结果比较，结果如表1所示。结果表明在相同的发酵条件下菌株CCTCC NOM 207023经处理后2，3-丁二醇产量高达41.7g/L，比处理前增加了7.89％，而相应的副产物有机酸乳酸和乙酸的产量分别下降了89.09％和92.24％。
表1
实施例2步骤一同实施例1步骤二发酵验证挑取在选择性固体培养基中存活的一个单菌落，继续在同样的选择性固体培养基上划线培养，经连续培养5代经考察遗传稳定性后，挑取单菌落接种于发酵培养基进行发酵(发酵条件见一般性说明)，发酵54小时，取5mL发酵液8000r/min离心15min后，用HPLC分析上清中2，3-丁二醇以及副产物乙酸和乳酸的浓度，与处理前结果比较，结果如表2所示。结果表明在相同的发酵条件下菌株CCTCC M 207023经处理后2，3-丁二醇产量高达40.53g/L，比处理前增加了4.86％，而相应的副产物有机酸乳酸和乙酸的产量分别下降了67.88％和72.41％。
表2
实施例3步骤一同实施例1步骤二发酵验证挑取在选择性固体培养基中存活的一个单菌落，继续在同样的选择性固体培养基上划线培养，经连续培养5代经考察遗传稳定性后，挑取单菌落接种于发酵培养基进行发酵(发酵条件见一般性说明)，发酵54小时，取5mL发酵液8000r/min离心15min后，用HPLC分析上清中2，3-丁二醇以及副产物乙酸和乳酸的浓度，与处理前结果比较，结果如表2所示。结果表明在相同的发酵条件下菌株CCTCC M 207023经处理后2，3-丁二醇产量高达40.8g/L，比处理前增加了5.56％，而相应的副产物有机酸乳酸和乙酸的产量分别下降了61.82％和79.31％。
表3
实施例4步骤一同实施例1步骤二发酵验证挑取在选择性固体培养基中存活的一个单菌落，继续在同样的选择性固体培养基上划线培养，经连续培养5代经考察遗传稳定性后，挑取单菌落接种于发酵培养基进行发酵(发酵条件见一般性说明)，发酵54小时，取5mL发酵液8000r/min离心15min后，用HPLC分析上清中2，3-丁二醇以及副产物乙酸和乳酸的浓度，与处理前结果比较，结果如表2所示。结果表明在相同的发酵条件下菌株CCTCC M 207023经处理后2，3-丁二醇产量高达40g/L，比处理前增加了3.49％，而相应的副产物有机酸乳酸和乙酸的产量分别下降了66.67％和62.07％。
表4
权利要求
1.一种产酸克雷伯氏菌，其分类命名为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ME-303，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号是CCTCC NOM 207023。
2.利用权利要求1所述产酸克雷伯氏菌生物合成2，3-丁二醇并降低该过程中副产物有机酸产量的方法，其特征在于采用紫外线和硫酸二乙酯复合处理菌株CCTCC NOM 207023，然后将处理后的菌株接种到含溴化钠和溴酸钠的选择性固体培养基上培养，经遗传稳定性考察后，挑取单菌落进行发酵，制备2，3-丁二醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于采用紫外线和硫酸二乙酯复合处理菌株是采用强度为15～30w的紫外线照射2～5min后再采用按质量百分比计终浓度为0.5％～2％的硫酸二乙酯处理20～50min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于含溴化钠和溴酸钠的选择性固体培养基是在普通LB固体培养基中添加适量的葡萄糖、溴化钠和溴酸钠混合物，其中溴化钠和溴酸钠的摩尔比为1∶1～5∶1。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于选择性固体培养基中葡萄糖的浓度为10～100g/L，溴化钠的浓度为200～900mmol/L，溴酸钠的浓度为50～225mmol/L。
6.权利要求1所述产酸克雷伯氏菌在减少副产物有机酸产量的2，3-丁二醇生物合成中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种产酸克雷伯氏菌及其应用。该产酸克雷伯氏菌保藏号为CCTCC NOM 207023，利用该产酸克雷伯氏菌生物合成2，3－丁二醇并降低该过程中副产物有机酸产量的方法是采用紫外线和硫酸二乙酯复合处理菌株CCTCC NOM 207023，然后将处理后的菌株接种到含溴化钠和溴酸钠的选择性固体培养基上培养，经遗传稳定性考察后，挑取单菌落进行发酵制备2，3－丁二醇。本发明操作简单且工作量少，不涉及基因操作，成本较低，效率高且周期短，能够快速定向地降低生物合成2，3－丁二醇过程中的副产物乳酸和乙酸的产量，提高底物的利用率及2，3－丁二醇的得率。
文档编号C12R1/22GK101063095SQ20071002164
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月19日 优先权日2007年4月19日
发明者黄和, 纪晓俊, 李霜, 杜军, 练敏, 高振, 胡南 申请人:南京工业大学