专利名称：乙醇诊断/测定试剂盒及乙醇浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种乙醇诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙 醇浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
技术背景乙醇具成瘾性，酒滥用和酒依赖是当今世界范围内最严重的社会经 济和公共卫生问题之一。在西方国家，酒精相关性肝病已成为死亡的第六位原因。在我国，近20年来，随着社会经济发展，人均酒消耗量 大幅度上升，酒依赖的患病率日趋增高。生物样品中乙醇的定量测定方法主要有化学比色法，酶终点比色 法，均相酶免疫测定法(EIA)，气相色谱法(GC)和呼出气乙醇分析。 此外血清渗透量法可作乙醇半定量分析。有多种化学比色法曾用于乙醇定量测定，微量扩散法是其中较简单 实用的一种，微量溢出的乙醇可使铬酸还原成蓝色的氧化铬。根据所用的试剂酶不同，乙醇的酶法测定分为二种乙醇氧化酶法 和乙醇脱氢酶法，与乙醇氧化酶法相比，乙醇脱氢酶法的专一性高， 不会与甲醇和丙酮起催化反应。一般认为气相色谱法可作为参考方法，尤其在准确性和精密度要求 高的法医学乙醇测定中应用最广。GC法的独特优点在于特异、灵敏， 且能同时分析多种挥发性醇类物质，如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和异丙醇。其他乙醇的测定方法还有均相酶免疫分析(Homogeneous enzyme immunoassay^渗透量法、呼出气乙醇分析法；用呼出气乙醇分析仪 检测乙醇操作简单、快速，在交通执法部门应用较多。这类仪器中一 种是根据红外光吸收原理设计的，该法测定的乙醇浓度与酶法测得的 血乙醇浓度相关性很好。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶 联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400—700nm波长处吸光度的上升，得以测定乙醇浓度 的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乙醇诊断/测定试剂 盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上 进行乙醇浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可 以得到切实的推广应用。本发明乙醇浓度测定方法原理如下乙醇+氧酒精脱氢酶乙醛+过氧化氢 过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶喷嗒胺色原或醌亚胺色原+水这个方法应用酒精脱氢酶(Alcohol dehydrogenase ; EC 1.1.3.13) (偶)联过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)酶促反应终点/速率比色 法。酒精脱氢酶酶解乙醇反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合过氧化物酶的作用，最后生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将无色 的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400—700nrn (根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测 定染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye) 一含量高低的光吸收大小；通过测量400—700nm (根据还原型色原体 组合的不同而定)处吸光度上升的程度/速度，得出乙醇浓度大小测定 结果。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，如下成分关系的本发明乙醇诊断/测定试剂盒较为理想 缓冲液 10Ommol/L稳定剂还原型色原体组合过氧化物酶酒精脱氢酶500 mmol/L0.1-20 mmol/L30000 U/L 10000U/L所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基""N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2,4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-双G-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本发明的乙醇诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。试 剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。 试剂2缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、酒精脱氢过氧化物酶、还原型色原体组合、酒精脱氢酶在试剂1或试剂2中 的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂l缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。 试剂3缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、酒精脱氢酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、酒精脱氢酶在试剂l、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的乙醇诊断/测定试剂为单试剂，包括-三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L过氧化物酶 30000 U/L酒精脱氢酶 10000 U/L4-氨基抗砒 2 mmol/L石碳酸 10mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂; 使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37-C，反应时间IO分钟，测 试主波长505nm，测试副波长600nm，被测乙醇样品与试剂的体积比 例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法， 延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出乙 醇的浓度大小。 实施例二本实施例的乙醇诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50Ommol/L 过氧化物酶 30000 U/L10000U/L4-氨基抗砒 0.6 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测乙醇样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出乙醇的浓度大小。实施例三本实施例的乙醇诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 双甲基苯胺100 mmol/L 2 mmol/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂过氧化物酶酒精脱氢酶100 mmol/L 500 mmol/L30000 U/L10000 U/L13试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，测试 主波长578nm，测试副波长660nm，被测乙醇样品与试剂的体积比例 为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法， 延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出乙 醇的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源 物质量污染。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法技术的乙醇浓度测定方法，其方法原理如下乙醇+氧 酒精脱氢酶 乙醛+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出乙醇浓度大小测定结果。
2. —种乙醇诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 稳定剂还原型色原体组合 过氧化物酶 500——80000 U/L酒精脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。3. 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合 组成单剂试剂。4. 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合20-500 mmol/L1-4000 mmol/L0.1-20mmol/L组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组 成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶、过氧化物酶、还原 型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、酒精脱氢酶、 在试剂1或试剂2中的位置可以不限。5. 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合 组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组 成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂3， 由缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶、过氧化物酶组成。过氧化物酶、 还原型色原体组合酒精脱氢酶、在试剂l、试剂2或试剂3中的位 置可以不限。6. 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂1~4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫 酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。7. 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙1^-乙基>~1^ (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒!^-乙基^~^- G-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-双G-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乙醇诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙醇浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、酒精脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出乙醇浓度的大小。
文档编号C12Q1/00GK101324629SQ200710023208
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司