专利名称：无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无 机磷浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
技术背景人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态 平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反 之亦然。血浆中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升 血浆f5磷浓度的乘积为35——40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐 形式沉积在骨组织，>70时，可发生转移性钙化。当乘积<35时，则将 妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软 骨病。血浆[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降钙素 的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析 磷酸盐阴离子(H2P04"， HP(V')。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原 法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动 注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验 室测定无机磷的常规方法是比色法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加 入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-lOO)最理想。 磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚 化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有 光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下 的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连 续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定无机磷浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的无 机磷诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、 全自动生化分析仪上进行无机磷浓度测定，而且测定速度快、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。本发明无机磷浓度测定方法原理如下磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸 L-谷氨酸+水+辅酶谷氨酸脱氢酶氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶 这种方法应用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase ; EC 6.3.1.2)酶 (偶)联谷氨酸脱氢酶(Glutamatedehydrogenase ; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3)酶促反应速率比色法/终点法。谷氨酰胺合成酶酶解无机磷(磷酸根)反 应产生谷氨酸，再通过(偶)联合谷氨酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从 而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量 340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算无机磷的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷诊断/测定试 剂盒较为理想-缓冲液10Ommol/L稳定剂500 mmol/L辅酶3 mmol/L谷氨酰胺10 mmol/L腺苷二磷酸20 mmol/L谷氨酸20 mmol/L谷氨酰胺合成酶10000U/L谷氨酸脱氢酶12000U/L本发明的无机磷诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸、谷氨酰 胺合成酶、谷氨酸脱氢酶。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸。试剂2缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶。 辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱 氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶。辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱 氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定无机磷浓度的方法，其辅酶 可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的无机磷诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L谷氨酰胺 10 mmol/L腺苷二磷酸 20 mmol/L谷氨酸 20 mmol/L谷氨酰胺合成酶 10000 U/L谷氨酸脱氢酶 12000 U/L .试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出无机磷的浓度大小。实施例二本实施例的无机磷诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L辅酶 3 mmol/L谷氨酰胺 10mmol/L腺苷二磷酸 20 mmol/L谷氨酸 20 mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L谷氨酰胺合成酶 10000 U/L谷氨酸脱氢酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出无机磷的浓度大小。实施例三本实施例的无机磷诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 辅酶谷氨酰胺 腺苷二磷酸50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂谷氨酸脱氢酶 试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L100 mmol/L500 mmol/L谷氨酰胺合成酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定无机磷浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37-C，反应时 间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测无机磷样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟 左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出无机磷 的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类 同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法的无机磷的浓度测定方法，其方法原理如下磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨离子 +谷氨酸+腺苷三磷酸L-谷氨酸+水+辅酶谷氨酸脱氢酶氨离子+ 2-酮戊二酸酯+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出无机磷的浓度大小测定结果。
2. —种无机磷诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20~——500 mmol/L稳定剂1——4000 mmol/L辅酶卜6 mmol/L谷氨酰胺l一50 mmol/L腺苷二磷酸l一50 mmol/L谷氨酸l一50 mmol/L谷氨酰胺合成酶1000———80000 U/L谷氨酸脱氢酶1000———80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸、谷氨酰 胺合成酶、谷氨酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸组成；试剂2，由缓冲液、稳 定剂、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶组成。辅酶、谷氨酰胺、腺苷 二磷酸、谷氨酸、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2 中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸、谷氨酰 胺合成酶、谷氨酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸组成；试剂2，由缓冲液、稳 定剂、谷氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合 成酶组成。辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸、谷氨酰胺合成酶、 谷氨酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂l"4000mmol/L或0.1。/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酸、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出无机磷的浓度大小。
文档编号C12Q1/26GK101324610SQ20071002336
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司