专利名称：柠檬酸浓度的测定方法及柠檬酸诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、食品、环境等领域内对柠檬酸浓度的检测，尤其涉及酶比色法及偶联法测定柠檬酸浓度的方法，以及由此制得的柠檬酸诊断试剂盒，属于柠檬酸浓度分析检测技术领域。
背景技术：
柠檬酸主要用于食品、饮料行业作为酸味剂、调味剂及防腐剂、保鲜剂，也用于制备医药清凉剂，还在化工行业、化妆品行业及洗涤行业中用作抗氧化剂、增塑剂、洗涤剂。
强制性国家标准GB17203-1998《食品添加剂柠檬酸钙》规定，柠檬酸钙含量为98.0～100.5％。国家质检总局组织对食品添加剂剂柠檬酸其盐类(柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钙)产品质量进行了国家监督抽查。抽查中发现的主要质量问题是柠檬酸钙含量不合格，抽查中有个别产品食品添加剂柠檬酸钙含量超过国家标准规定的要求，主要是原料碳酸钙转化不完全，成品中存在杂质。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定柠檬酸浓度的方法，以及应用该方法配制而成的柠檬酸诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)测定柠檬酸浓度的方法，利用柠檬酸合成酶为作用酶、苹果酸脱氢酶为显色酶，对待测样品中的柠檬酸进行检测，采用以下步骤进行将测定的样品与含有辅酶A、柠檬酸合成酶、还原型辅酶、苹果酸脱氢酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出柠檬酸浓度的大小。
上述酶比色法及偶联法测定柠檬酸浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
实现本发明柠檬酸诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液 20～500mmol/L，稳定剂 1～4000mmol/L，还原型辅酶 0.1～0.35mmol/L，辅酶A 1～50mmol/L，柠檬酸合成酶1000～80000U/L，苹果酸脱氢酶1000～80000U/L。
试剂盒可以是干粉状态，也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分还原型辅酶、辅酶A可以放在试剂II；试剂II中的柠檬酸合成酶、苹果酸脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，浓度在1～4000mmol/L、或0.1％～100％体积比范围之内。
还可以将试剂配成如下三试剂
与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的还原型辅酶、辅酶A可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的苹果酸脱氢酶可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的柠檬酸合成酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂H/试剂III当中通常加入稳定剂，活性浓度在1～4000mmol/L、或0.1％～100％体积比范围之内。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断/检测试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液 100mmol/L，稳定剂 500mmol/L，还原型辅酶 0.25mmol/L，辅酶A 5mmol/L，柠檬酸合成酶10000U/L，苹果酸脱氢酶12000U/L。
利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法(CoupleReaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的柠檬酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明利用酶比色法及偶联法测定柠檬酸浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中柠檬酸浓度的大小；(6)本发明提供的液态柠檬酸诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种柠檬酸浓度的测定方法及柠檬酸诊断试剂盒，运用柠檬酸合成酶(citrate synthase；EC 2.3.3.1；EC 2.3.3.3)偶联苹果酸脱氢酶(Malatedehydrogenase；EC 1.1.1.37)酶促反应连续监测法/速率比色法。柠檬酸合成酶酶解柠檬酸反应产生草酰乙酸，再通过(偶)联合苹果酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，测算柠檬酸的浓度大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制柠檬酸诊断试剂盒三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 500mmol/L，
NADH0.25mmol/L，辅酶A 5mmol/L，柠檬酸合成酶10000U/L，苹果酸脱氢酶12000U/L；试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测柠檬酸样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(下降反应)，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出柠檬酸的浓度大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制柠檬酸诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 50mmol/L，还原型辅酶 0.25mmol/L，辅酶A5mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 500mmol/L，NADPH0.25mmol/L，辅酶A5mmol/L，柠檬酸合成酶 10000U/L，
苹果酸脱氢酶12000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测柠檬酸样品与试剂I、试剂II的体积比例为2∶20∶5，反应方向为负反应(下降反应)，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出柠檬酸的浓度大小。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制柠檬酸诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，乙二醇 50mmol/L，thio-NADH0.25mmol/L，辅酶A5mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 500mmol/L，苹果酸脱氢酶 12000U/L；试剂III——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 500mmol/L，柠檬酸合成酶 10000U/L；试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定柠檬酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测柠檬酸样品与试剂I、试剂II、试剂III的体积比例为4∶40∶5∶5，反应方向为负反应(下降反应)，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出柠檬酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.柠檬酸浓度的测定方法，其特征在于包括以下步骤3)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出柠檬酸浓度的大小。
2.柠檬酸诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂1～4000mmol/L，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，辅酶A 1～50mmol/L，柠檬酸合成酶 1000～80000U/L，苹果酸脱氢酶 1000～80000U/L。
3.根据权利要求2所述的柠檬酸诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的柠檬酸诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
5.权利要求2～4中任意一种柠檬酸诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂或者双剂或三剂。
6.权利要求2～4中任意一种柠檬酸诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种酶比色法及偶联法测定柠檬酸浓度的方法及诊断试剂盒，运用柠檬酸合成酶偶联苹果酸脱氢酶酶促反应连续监测法/速率比色法。柠檬酸合成酶酶解柠檬酸反应产生草酰乙酸，再通过(偶)联合苹果酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算柠檬酸的浓度大小。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。
文档编号C12Q1/26GK101082575SQ200710024769
公开日2007年12月5日 申请日期2007年6月28日 优先权日2007年6月28日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司