专利名称：棉花子叶离体培养不定芽诱导植株再生的方法
技术领域：
本发明棉花子叶离体培养不定芽诱导植株再生的方法，属于植物组织培养范畴，适用于棉花体细胞培养和农杆菌介导基因转化的受体材料的培养技术。
二、技术背景虽然棉花体细胞培养、花药培养、胚珠和胚培养、原生质体培养等植株再生的技术体系早已建立，但至今在应用方面仍受到相当程度的限制。现有的棉花组织培养植株再生技术，都是通过愈伤组织的诱导和增殖、胚状体的发生和萌发、壮苗培养、试管苗生根途径获得再生植株，每一个阶段都需要特定的培养条件，培养过程复杂，培养周期长，且愈伤组织在长期继代培养过程中易产生染色体变异，产生大量的异常胚状体，在获得的试管苗中畸形苗所占的比例偏高。
迄今为止，国内外有关从棉花子叶离体培养诱导不定芽再生植株的报道仅有2篇(吴敬音，佘建明等.泗棉3号叶片丛生芽形成及植株再生[J]，江苏农业科学，1994，2；张海，易永华等.棉花子叶离体培养与植株再生[J]，西北农业学报，2002，11(1)84～86)。吴敬音等以5～7d苗龄的子叶为外植体材料，从陆地棉泗棉3号品种偶尔诱导产生不定芽，不但诱导率低，且试验重复性差；张海等则是首先通过子叶诱导产生愈伤组织，然后再经过愈伤组织分化的途径而得到再生植株。
发明内容
技术问题本发明的目的是要克服目前在棉花组织培养植株再生技术中存在的培养过程复杂、周期长、畸形胚和畸形苗比例高、植株再生率低等问题。以棉花种子无菌苗的子叶为外植体材料，直接从完整子叶的基部切口处诱导不定芽发生，从而建立起棉花子叶离体培养不定芽诱导高频率植株再生技术。
技术方案棉花子叶离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于，1)材料选用棉花种子无菌苗的子叶为外植体材料；2)培养基基本培养基由MS大量元素、MS微量元素与B5维生素组成，葡萄糖30g/L，固化剂-phytagel 2g/L；不定芽诱导培养基附加激素6-苄基氨基嘌呤3.0mg/L，吲哚乙酸1.0mg/L，2-异戊烯腺嘌呤1.0mg/L；添加硝酸银5.0mg/L；幼苗生长培养基在上述基本培养基中添加6-苄基氨基嘌呤0.1mg/L；培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；3)培养方法经硫酸脱绒的棉花种子在70％乙醇中消毒2～3min，然后用10％双氧水处理30～60min，表面消毒处理后的种子在25℃下无菌水中浸泡24h，剥去种皮后置于1/2 MS培养基上，15h后切取完整的子叶接种在不定芽诱导培养基上；10d后从子叶的基部切口处诱导产生不定芽，不定芽长到1.5cm高度时转到幼苗生长培养基上，获得再生植株。培养室温度为25±1℃，在16h光照条件下培养。
有益效果 本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果本发明以珂字棉312品种和陆地棉泗棉3号品种的种子无菌苗15h苗龄的子叶为外植体材料，在附加6-苄基氨基嘌呤3.0mg/L、吲哚乙酸1.0mg/L和2-异戊烯腺嘌呤1.0mg/L不定芽诱导培养基上，不定芽的诱导频率分别达40％和30％以上。陆地棉泗棉3号品种的子叶诱导不定芽总的频率为30％以上，其中发育正常的不定芽的频率在16％以上。在上述不定芽诱导培养基上添加硝酸银5.0mg/L，珂字棉312品种不定芽的诱导频率达70％左右，陆地棉泗棉3号品种不定芽的诱导频率达60％左右。由此，本发明成功地建立起棉花通过子叶离体培养诱导不定芽途径高频率植株再生技术体系。
本发明从棉花种子的无菌苗15h苗龄的子叶直接诱导产生不定芽，由不定芽发育成试管植株，极大地简化了现有的棉花组织培养植株再生的培养方法，培养条件操作简便，培养周期缩短4～6个月，并提高了植株再生的频率，为规模化开展体细胞培养和农杆菌介导基因转化提供崭新的、更为有效的实用技术。
四
图1接种15h苗龄的子叶图2子叶诱导产生不定芽图3试管苗图4完整再生植株五具体实施方式
1.材料和方法1.1实验材料珂字棉3 12、陆地棉泗棉3号品种为试验材料。
取种子无菌苗的子叶为外植体材料。
1.2培养基基本培养基由MS大量元素、MS微量元素(Murashige T，Skoog F.A revisedmedium from rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J].Physiol plant，1962，15473～497)和B5维生素(Gamborg O L，Miller R A，Ojima K.Nutrientrepuirements of suspension cultures of soybeanroot cell[J].Exp. Cell Res，1968.50151～158)组成，为植物组织培养中一种常用的培养基。添加葡萄糖30g/L，固化剂-phytagel(SIGMA公司)2g/L；不定芽诱导培养基附加激素6-苄基氨基嘌呤(简称BAP，上海雪满生物科技有限公司)3.0mg/L，吲哚乙酸(简称IAA，南京生工)1.0mg/L，2-异戊烯腺嘌呤(简称2ip，SIGMA)1.0mg/L；培养基中添加硝酸银(简称AgNO3，上海试剂一厂)5.0mg/L；幼苗生长培养基在上述基本培养基中添加6-苄基氨基嘌呤(简称BAP，上海雪满生物科技有限公司)0.1mg/L；培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；1.3培养方法经硫酸脱绒的棉花种子在70％乙醇中消毒2～3min，然后用10％双氧水处理30～60min，表面消毒处理后的种子在25℃下无菌水中浸泡24h，然后剥去种皮置于1/2MS培养基上，15h后切取完整的子叶接种在不定芽诱导培养基上；6d前剔除个别带有腋芽的子叶以排除试验误差，10d左右从子叶基部的切口处诱导不定芽发出，20d后统计不定芽的诱导频率；不定芽长到1.5cm高度时转到幼苗生长培养基上。培养室温度为25±1℃，在16h光照条件下培养。
2.结果2.1不同苗龄的子叶对不定芽诱导频率的影响分别取培养15h、48h、72h、96h的无菌苗的完整子叶为外植体材料，接种在附加BAP 3.0mg/L、IAA 1.0mg/L、2ip 1.0mg/L的不定芽诱导培养基上。试验结果显示苗龄为15h时，珂字棉312和陆地棉泗棉3号品种子叶的不定芽诱导率高达40％和30％以上；苗龄为72h时，泗棉3号的子叶未诱导产生不定芽。随着种子无菌苗苗龄的延长，子叶诱导不定芽的频率明显下降(表1)。
表1 不同苗龄的子叶对不定芽诱导频率的影响
2.2不同激素种类及配比对不定芽的诱导频率的影响苗龄均为15h，激素组合为BAP 3.0mg/L、2ip 1.0mg/L和IAA 1.0mg/L，珂字棉312和陆地棉泗棉3号品种子叶的不定芽诱导率高达40％和30％以上。试验结果表明在BAP 3.0mg/L前提下，2ip对诱导不定芽发生的作用优于ZT，IAA的作用优于IBA(表2，表3)。
表2 激素对珂字棉312品种的子叶诱导不定芽频率的影响
表3 激素对泗棉3号品种的子叶诱导不定芽频率的影响
试验中发现，不同的激素组合对陆地棉泗棉3号品种的子叶诱导产生的不定芽的质量有显著的影响，有相当比例的不定芽发育成畸形试管苗。试验结果显示在激动素同为BAP和2ip时，生长素IAA对诱导产生正常不定芽的作用优于IBA，发育正常的不定芽的诱导频率达16％以上(表4)。
表4 激素对泗棉3号品种的子叶诱导发育正常的不定芽频率的影响
2.3AgNO3对不定芽诱导频率的影响在不定芽诱导培养基中添加硝酸银，能有效抑制酚类化合物的氧化。随着AgNO3的浓度从0mg/L提高到5.0mg/L时，珂字棉312品种的子叶诱导不定芽频率由41.18％提高到69.47％；而进一步从5.0mg/L提高到9.0mg/L时，不定芽的诱导频率则从69.47％降至62.07％。随着AgNO3浓度的提高，泗棉3号品种的子叶诱导不定芽频率由31.65％提高到57.29％(表5)。
表5 AgNO3对不同品种的子叶诱导不定芽频率的影响
3.结论本发明以珂字棉312品种和陆地棉泗棉3号品种的种子无菌苗15h苗龄的子叶为外植体材料，在附加6-苄基氨基嘌呤3.0mg/L、吲哚乙酸1.0mg/L和2-异戊烯腺嘌呤1.0mg/L不定芽诱导培养基上，不定芽的诱导频率分别达40％和30％以上；陆地棉泗棉3号品种的子叶诱导发育正常的不定芽的频率在16％以上。在上述不定芽诱导培养基上添加硝酸银5.0mg/L，珂字棉312品种不定芽的诱导频率达70％左右，陆地棉泗棉3号品种不定芽的诱导频率达60％左右。由此，成功地建立起棉花通过子叶离体培养诱导不定芽途径高频率植株再生技术体系。不定芽长到1.5cm高度时转到幼苗生长培养基上，形成完整的植株试管苗(图3、图4)。
权利要求
1.棉花子叶离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于，1)材料选用棉花种子无菌苗的子叶为外植体材料；2)培养基基本培养基由MS大量元素、MS微量元素与B5维生素组成，附加葡萄糖30g/L，固化剂phytagel 2g/L；不定芽诱导培养基在上述基本培养基中添加激素6-苄基氨基嘌呤3.0mg/L，吲哚乙酸1.0mg/L，2-异戊烯腺嘌呤1.0mg/L，硝酸银5.0mg/L；幼苗生长培养基在上述基本培养基中添加6-苄基氨基嘌呤0.1mg/L；培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；3)培养方法经硫酸脱绒的棉花种子在70％乙醇中消毒2～3 min，然后用10％双氧水处理30～60 min，表面消毒处理后的种子在25℃室温下无菌水中浸泡24h，剥去种皮后置于1/2 MS培养基上，15h后切取完整的子叶接种在不定芽诱导培养基上；10d后从子叶的基部切口处诱导产生不定芽；不定芽长到1.5cm高度时转到幼苗生长培养基上，获得再生植株；以上培养室温度为25±1℃，在16光照条件下培养。
全文摘要
本发明涉及棉花子叶离体培养不定芽诱导植株再生的方法，属于植物组织培养范畴。本发明以棉花种子无菌苗的子叶为外植体材料，接种在附加6－苄基氨基嘌呤3.0mg/L、吲哚乙酸1.0mg/L、2－异戊烯腺嘌呤1.0mg/L、硝酸银5.0mg/L的不定芽诱导培养基上，不定芽长到1.5cm高度时转到幼苗生长培养基上，获得再生植株；珂字棉312品种不定芽的诱导频率高达70％左右，陆地棉泗棉3号品种不定芽的诱导频率高达60％左右。棉花子叶离体培养不定芽诱导植株再生技术操作简便，培养周期短，植株再生频率高，为规模化开展棉花体细胞培养和农杆菌介导基因转化提供新的更有效的实用技术。
文档编号C12N5/04GK101088323SQ200710024879
公开日2007年12月19日 申请日期2007年7月6日 优先权日2007年7月6日
发明者倪万潮, 张保龙, 许亚楠, 佘建明, 沈新莲, 张香桂, 何晓兰, 杨郁文 申请人:江苏省农业科学院