专利名称：一种人乳腺癌细胞系SK-3rd及其建立方法
技术领域：
本发明属于微生物动物细胞系领域，具体涉及一种富集乳腺癌干 细胞的人乳腺癌细胞系的建立及其建系方法。
背景技术：
近年越来越多的研究证明，实体恶性肿瘤内存在分化程度和成瘤 能力不一致的癌细胞，仅有一小部分细胞成瘤能力特别强，分化程度 极低，由于这群细胞具有成体干细胞自我更新和多向分化潜能的特 性，因此被称为"癌干细胞(cancer stem cells)",或"成瘤性癌 细胞(tumorigenic cancer cells)"。类j以于干细胞的增殖特征， 具有强大增殖潜能的癌干细胞却增殖速度缓慢，大多数细胞处于细胞 周期的G。/G,期，而且表达大量的耐药基因，所以对多种化疗、放疗 和内分泌治疗不敏感，因此常规的肿瘤治疗方法只能消灭大部分的非 癌千细胞，而遗留下癌干细胞，导致最终复发和转移。可见，消灭癌 干细胞是治疗肿瘤，预防复发和转移的关键。这就需要我们深入研究 在肿瘤发生发展过程中，调控癌干细胞的自我更新和分化演变的生物学机制。2003年，Al-Hajj等首次从乳腺癌患者的原发肿瘤和转移胸水中分离出具有干细胞特性的一群癌细胞，其后，几个不同的课题组也分别从乳腺癌原发肿瘤中分离出癌干细胞。证实了乳腺癌中存在癌干细 胞。但是自2003年乳腺癌干细胞的发现至今，国际上关于乳腺癌干 细胞的文献极少，主要原因在于癌干细胞在肿瘤细胞中所占的比例极 少，至今没有一个提供癌干细胞研究的平台，国内外均无富集乳腺癌 干细胞的人乳腺癌细胞系的建立。发明内容本发明的目的是建立富集乳腺癌干细胞的乳腺癌细胞系，为乳腺 癌干细胞的研究建立良好的实验平台，以利于对乳腺癌的发生机制、 转移复发、以及针对乳腺癌干细胞的治疗进行深入的研究。本发明采用SK-BR-3细胞株作为建系的源细胞，连续3次 NOD/SCID鼠体内原位移植，创新之处在于待肿瘤可触及后，尾静 脉每周一次注射进口表阿霉素，杀死部分对于化疗药物敏感的非癌干 细胞，而癌干细胞由于处于细胞周期的G。/G,期，而且表达大量的耐 药基因，所以对多种化疗药治疗不敏感，因此癌干细胞存活了下来， 使移植瘤中癌干细胞的比例逐渐增加，建立了一种富含有癌干细胞的 乳腺癌细胞系，命名为SK-3rd本发明通过下述方法建立富集乳腺癌干细胞的人乳腺癌细胞系 1、按照常规方法建立人乳腺癌NOD/SCID鼠原位移植瘤模型。 取呈对数生长期的乳腺癌细胞株SK-BR-3，胰蛋白酶消化，计数后PBS重悬，将2X1()6个细胞，共100ul，接种于NOD/SCID鼠胸 部右侧第二对乳房垫。NOD/SCID鼠为雌性、4 6周龄，由中山大学 实验动物中心提供，饲养于SPF环境中。2、 待肿瘤可触及后，尾静脉注射进口表阿霉素(法玛新)，8mg/kg， 每周一次，直至肿瘤生长至直径20mm。肿瘤的体积按照下列公式计 算Volume (mm3) = L x W2 x 0.4。3、 采用颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠置于75°%酒精中消毒15 分钟，取出肿瘤组织，含1%双抗的Hank's液或PBS冲洗数次，去 除血液、结缔组织和坏死组织，将肿瘤组织剪碎，切成小块，以上步 骤在冰上操作。经胰蛋白酶消化大约20 40分钟，300目筛网过滤 后将单细胞悬液PBS重悬，取2乂106个细胞，共100Hl接种于 NOD/SCID鼠胸部右侧第二对乳房垫。4、 按照上述步骤重复，共接种3次，每次均同样方法尾静脉注 射进口表阿霉素。5、 建立细胞系采用无菌技术将肿瘤组织取出后用胰酶消化法 制备成单细胞悬液，进行体外原代培养，培养液为高糖DMEM加20 % (v/v)胎牛血清，37°C， 5%<:02/95%空气，饱和湿度培养。隔天 换培养液，每2 3天传代一次，传代后培养液中添加的胎牛血清改 用10%。6、 系列实验检测，本发明的细胞系具有以下特点1)体外生长的具有典型的上皮样形态，接触性生长抑制消失， 染色体呈三倍体或亚三倍体核型，染色体数目50 69条，占总数的80%左右，染色体结构畸变，多条染色体发生易位或缺失突变。(见 图2)microRNA芯片检测发现，52种microRNAs表达降低，其中let7 家族成员降低最明显、最稳定。2) lml培养体系中1000个细胞悬浮培养(1000 cells in suspension cultures) 15天后，SK-3rd细胞的球囊形成率为15.2% 18.1%，是 SK-BR-3细胞的20倍(16.3% vs. 0.8%, PO.001);将球囊细胞传代再 进行悬浮培养，球囊形成率都为16%左右(见图3A); SK-3rd细胞 形成的球囊可以长期培养，至少可以传代50代，而SK-BR-3细胞形 成的球囊传3-4代后就很难再形成球囊了，细胞贴壁生长，最终分化。 单个细胞悬浮培养(single cell culture)时，SK-3rd细胞5天后就可 以观察到球囊形成，培养至15天时，球囊中的细胞数目逐渐增长； SK-3rd细胞形成的球囊可以传至少40代。但是，SK-BR-3细胞在培 养15天后才见到球囊形成，细胞数目也相对较少(见图3B)，并且 不能长期传代。观察1000个单细胞培养体系，SK-3rd细胞的球囊率 个数为11.4% 18.3%，大约是SK-BR-3的18倍。3) SK-3rd细胞形成的球囊细胞不表达肌上皮标志物CK14及导 管上皮标志物CK18，证明其处于未分化状态。诱导分化第10天后， 贴壁的SK-3rd细胞中不表达细胞角蛋白的未分化细胞所占的比例降 到15%。而其源细胞SK-BR-3细胞中不表达细胞角蛋白的未分化细 胞所占的比例不到2%。4) SK-3rd细胞形成的球囊细胞具有癌干细胞的表型，这些表型 在其分化的过程中逐渐消失。5) NOD/SCID鼠原位移植成瘤率高、远处转移率高、成瘤周期 短、成瘤所需的细胞数目少。 本发明的有益效果1、 荷瘤NOD/SCID鼠动物模型加传统肿瘤治疗方法可以用来 筛选癌干细胞。2、 自2003年乳腺癌干细胞的发现至今，国际上关于乳腺癌干 细胞的文献极少，主要原因在于癌干细胞在肿瘤细胞中所占的 比例极少，至今没有一个提供癌干细胞研究的平台，国内外均 无富集乳腺癌干细胞的人乳腺癌细胞系的建立。此发明中富集 乳腺癌干细胞的乳腺癌细胞系SK-3rd的建立，提供了一个研 究癌干细胞的平台。对乳腺癌发生发展机制的阐明、治疗新靶 点的发现、估计乳腺癌的预后等将产生深远影响。3、 可以从基因水平、从蛋白质水平研究癌干细胞与非癌干细 胞的差异。对乳腺癌发生发展机制的阐明、治疗新靶点的发现 有重要意义。4、 获得的富集癌干细胞的细胞株可以用于筛选针对癌干细胞 的药物或疫苗。附國说明
图1:贴壁培养的SK-3rd细胞。 图2: SK-3rd细胞染色体。图3:悬浮培养时SK-3rd与源细胞SK-BR-3的球囊形成。图4:球囊细胞贴壁培养诱导分化使细胞表面分化标记物(CK14CK18)的表达。 图5 : SK-3rd球囊细胞、及其不同分化阶段的SK-3rd，与SK-BR-3细胞，干细胞表型的表达。 图6: 2 X 105个SK-3rd球囊细胞NOD/SCID鼠接种形成的移植 瘤(A)、肺转移灶(B)及肝微转移灶(D)的HE染色切片，及发生 转移的小鼠肺的大体标本(C)图片。图7:(A)miRNAMicroarray结果，图为SK-3rd球囊细胞(line 3) 及分化的SK-3rd细胞(line 2)及SKBR3 (line l)具有明显表达差 异的microRNAs。 (B) Northern blot检测SK-3rd球囊细胞、 SK-3rd细胞及SKBR3细胞/"-7家族的表达。将lentW"7导入 SK-3rd球囊细胞后/^-7的表达水平的变化。(C)实时定量 RT-PCR检测SK-3rd球囊细胞分化的SK-3rd细胞及SKBR3细 胞/"-7的水平。将lenti-/ef7导入SK-3rd球囊细胞后/&-7的变化。 (*指与SKBR3相比PO.001)具体实施方式
本发明建立的富集乳腺癌干细胞的人乳腺癌细胞系的具体方法 如下1、按照常规方法建立人乳腺癌NOD/SCID鼠原位移植瘤模型。 乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞贴壁培养，培养液为含10% (v/v) 胎牛血清的DMEM，倒置显微镜下观察，细胞处于对数生长期时，去掉培养液，PBS冲洗一次，加入0.25%胰蛋白酶21111，显微镜下观 察，待细胞变圆后加入4ml含有血清的培养液终止消化，用吸管轻轻 吹打，转移至离心管中，lOOOrpm离心后PBS重悬制备成单细胞悬液， 使用计数板计数，调整细胞浓度，使其接种体积100ul，共2X106 个细胞接种于NOD/SCID鼠右侧胸部第二对乳房垫。NOD/SCID鼠 为雌性、4~6周龄，18 20g。由中山大学实验动物中心提供，SPF 环境中饲养。2、 待肿瘤可触及后，尾静脉注射进口表阿霉素(epiadriamycin、 epirubicin，商品名法玛新)，8mg/kg,每周一次，直至肿瘤最大径 至20mm。3、 采用颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠置于75。％酒精中消毒15 分钟，取出肿瘤组织，含1%双抗的Hank's液或PBS冲洗数次，去 除血液、结缔组织和坏死组织，将肿瘤组织剪碎，切成小块，以上步 骤在冰上操作。在恒温水浴中经胰蛋白酶消化大约30分钟，37°C, 100ipm。筛网过滤后将单细胞悬液PBS重悬，取2X1()S个细胞，共 100ii 1接种于NOD/SCID鼠胸部右侧第二对乳房垫。4、 按照上述步骤重复，共接种3次，每次均采用同样的方法尾 静脉注射进口表阿霉素。5、建立细胞系颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠置于75%酒精中消毒15分钟， 将肿瘤组织取出后，含1%双抗的Hank's液冲洗，去除血液、结 缔组织和坏死组织，将肿瘤组织剪碎，切成lmm3大小的小块，用胰酶消化法制备成单细胞悬液，进行体外原代培养，培养液为高糖DMEM加20X (v/v)胎牛血清，37°C， 5%(302/95%空气， 饱和湿度培养。隔天换培养液，细胞生长迅速，每2 3天传代--次，传代后培养液中添加的胎牛血清改用10%。 6、 实验观察及检测性实验1 ) 细胞形态体外贴壁生长的SK-3rd细胞具有典型的上皮样 形态，接触性生长抑制消失。细胞生长迅速(见图l)。2) 染色体分析挑选染色体分散良好的100个中期的分裂想 细胞进行染色体分析。统计显示，细胞染色体呈三倍体或亚三 倍体核型，有染色体数目和结构畸变。染色体数目50 69条， 多条染色体发生易位或缺失突变(见图2)。3 ) 已经有研究证实乳腺癌干细胞的自我更新能力可以通过球 囊形成率来评价。悬浮培养中球囊的数目反映了所有乳腺癌细 胞中具有自我更新能力的乳腺癌干细胞的数量，球囊中所含的 细胞数目，即球囊的大小，反映了单个癌干细胞的自我更新的 能力。本实验所用的悬浮培养液为无血清培养基DMED-F12， 添加的生长因子有B27、 20ng/mLEGF、 5 n g/mL insulin、及 0.4%BSA。培养条件为37。C， 5%0)2/95%空气，饱和湿度培 养。本实验中，将1000个/ml细胞接种于24孔板，每孔lml, 即每孔1000个细胞。悬浮培养15天后，SK-3rd细胞的球囊形 成率为15.2% 18.1 % ，大约是SK-BR-3细胞的20倍(16.3% vs. 0.8%, PO.001);球囊细胞传代后再进行悬浮培养，球囊形成率都为16%左右(见图3A)。 SK-3rd细胞形成的球囊可以长 期培养，至少可以传代50代，而SK-BR-3细胞形成的球囊传 3-4代后就很难再形成球囊了，细胞贴壁生长，最终分化。单 个细胞悬浮培养(single cell culture)时，SK-3rd细胞在培养5 天后就可以观察到球囊形成，培养至15天时，球囊中的细胞 数目逐渐增长。SK-3rd细胞形成的球囊可以传至少40代。但 是，SK-BR-3细胞在培养15天后才见到球囊形成，细胞数目 也相对较少(见图3B)，并且不能长期传代。观察1000个单 细胞培养体系，SK-3rd细胞形成的球囊个数为11.4% 18.1 % ， 大约是SK-BR-3的18倍。4) 使用流式细胞仪检测细胞表面CK14及CK18的表达。 SK-3rd细胞形成的球囊细胞不表达肌上皮标志物CK14及导管 上皮标志物CK18。诱导分化第10天后，贴壁的SK-3rd细胞 中不表达细胞角蛋白的未分化细胞所占的比例降到15%。而其 源细胞SK-BR-3细胞中不表达细胞角蛋白的未分化细胞所占 的比例不到2% (见图4)。5) 使用流式细胞仪检测细胞表面CD44CD24的表达,使用 western blot检测Oct-4的表达。大约93% SK-3rd球囊细胞 CD44+CD24-，但是分化培养条件将其贴壁培养3天后 CD44+CD24 。w的细胞减少到32%左右，第7天11%，第10 天2% 。相比之下SK-BR-3细胞中CD44+CD24-的细胞不到 1% ; SK-3rd球囊细胞高表达Oct-4，球囊细胞分化后Oct-4的表达逐渐下降，Oct-4在SK-BR-3细胞中几乎检测不到(见图 5)。6) 使用本发明的SK-3rd细胞建立NOD/SCID鼠原位移植瘤 模型NOD/SCID鼠原位移植成瘤率高、远处转移率高、成瘤 周期短、成瘤所需的细胞数目少。将不同细胞个数的SK-3rd 球囊细胞种植到NOD/SCID鼠的脂肪垫，当接种SK-3rd球囊 细胞数目为2 X 103时10只中8只小鼠在接种36到45天时形 成移植瘤，当接种SK-3rd球囊细胞数目为2 X 104及2 X 105 时，所有NOD/SCID鼠都形成移植瘤，观察到肿瘤的时间分别 为接种后30天和21天。当接种2 X 103或2 X 104个SK-BR-3 细胞时，到第60天仍旧没有一只小鼠成瘤，当接种数目为2X 105个时，到第45天，10只中3只可见明确肿瘤形成。接种2 X 105个SK-3rd球囊细胞5周后，10只小鼠中8只可见明显转 移灶；但是接种相同数目的SK-BR-3细胞，在移植瘤形成9 个周后仍旧没有小鼠镜下观察到肺转移。这与称量动物的肺湿 重结果也是一致的，SK-3rd球囊细胞移植鼠的肺湿重明显高于 SK-BR-3细胞移植鼠的肺湿重(PO.01) ， SK-3rd球囊细胞移植 鼠肝组织的HE染色切片发现，10只中有6只发现肝中微转移 灶，SK-BR-3细胞移植鼠肝组织中未见癌细胞转移。这也在测 量肝组织中人HPRTmRNA表达的结果中得到证实。(HE切片 及大体标本见图6)7) 成瘤性乳腺癌干细胞中部分microRNA的表达降低。使用高通量、高准确性的microRNA芯片来筛选SK-3rd球囊细胞、 分化的SK-3rd细胞及SK-BR-3细胞之间microRNA的表达差 异。与贴壁生长的已经诱导分化的SK-3rd细胞及SK-BR-3细 胞相比，SK-3rd球囊细胞中52个miRNAs的表达降低(见图 7A)。将芯片的有效数据聚类分析的结果显示，SK-3rd球囊细 胞组的样本明显聚类在一起，其miRNA的表达与分化的 SK-3rd细胞及SK-BR-3细胞两组相比有明显差异。对归一化 的数据ANOVA分析后，找出了在SK-3rd球囊细胞中表达明 显差异的miRNA。家族成员降低最明显，而且最稳 定。使用Northern blot的方法同时检测/^-7家族的所有亚型， 其结果与microRNA芯片的结果一致，/^-7在SK-3rd球囊细 胞基本检测不到，但是在SK-BR-3细胞可以明显见到/^-7的 表达(见图7B)。使用携带/&-7" pre-miRNA的慢病毒载体可 以使SK-3rd细胞/a-7fl的表达增强。使用U6作为平衡对照(见 图7B)。使用实时定量RT-PCR的方法来检测成熟/^-7的表达， 所用引物为/"-7a引物。其结果与其他方法一致，SK-3rd球囊 细胞/"-7的表达比分化的SK-3rd细胞低10倍，而分化的 SK-3rd细胞与SK-BR-3细胞/"-7的水平基本相当(P>0.05)(见 图7C)。使用lenti-/W-7a转导SK-3rd球囊细胞后其/"-7的表 达水平与SK-BR-3细胞相当(P>0.05)(见图7C)。本发明由国家杰出青年科学基金(30525022)、国家重点基础研究发展计划(973) 项目计划(2005CB724605)、国家高技术研究发展计划(863计划)资助。
权利要求
1. 一种人乳腺癌细胞系SK-3rd，其特征在于采用人乳腺癌SK-BR-3细胞株作为源细胞，且其含有肿瘤干细胞的比例高于源细胞SK-BR-3。
2、 根据权利要求1所述的人乳腺癌细胞系SK-3rd，其特征在于1) 体外生长具有典型的上皮样形态，接触性生长抑制消失，染 色体呈三倍体或亚三倍体核型，染色体数目50 69条，占总数的80 %左右，染色体结构畸变，多条染色体发生易位或缺失突变； microRNA芯片检测发现，52种microRNAs表达降低，其中let7家 族成员降低最明显、最稳定；2) 通过球囊形成率及球囊长期培养的情况来评价细胞系中具有 自我更新能力的癌干细胞。lml培养体系中IOOO个细胞悬浮培养15 天后，SK-3rd细胞的球囊形成率为15.2% 18.1% (16.3%± 1.2%)， 大约是SKBR3细胞的20倍；单细胞培养15天时观察1000个培养体 系，SK-3rd细胞形成的球囊形成率为11.4% 18.3% (14.4%±2.8 %)，是SK-BR-3的18倍；SK-3rd细胞形成的球囊可以长期培养， 至少可以传代50代，而SKBR3细胞形成的球囊传3-4代后就很难再 形成球囊了； 3) SK-3rd细胞形成的球囊细胞不表达肌上皮标志物CK14及导 管上皮标志物CK18，处于未分化状态； 4) SK-3rd细胞形成的球囊细胞具有癌干细胞的表型，这些表型在其分化的过程中逐渐消失；5) NOD/SCID鼠原位移植成瘤率高、远处转移率高、成瘤周期 短、成瘤所需的细胞数目少。
3、 一种人乳腺癌细胞系的建立方法，它包括1) 按照常规方法建立人乳腺癌NOD/SCID鼠原位移植瘤模型 取呈对数生长期的乳腺癌细胞株SK-BR-3，胰蛋白酶消化，计数后PBS重悬，将2X10S个细胞，共100ul，接种于4 6周的雌性 NOD/SCID鼠胸部右侧第二对乳房垫；2) 待肿瘤可触及后，尾静脉注射表阿霉素，8mg/kg，每周一次， 直至肿瘤生长至直径20mm;3) 把经处死、消毒处理后取出的小鼠肿瘤组织切成小块，在恒 温水浴中经胰蛋白酶消化大约20 40分钟，37°C， 100rpm，至肉眼 观肿瘤组织块消化完全，无明显组织块为止，300目筛网过滤后将单 细胞悬液PBS重悬，取2乂106个细胞，共100ul接种于NOD/SCID 鼠胸部右侧第二对乳房垫；4) 重复上述步骤，共接种3次，每次均采用同样方法尾静脉注 射表阿霉素；5) 建立细胞系将肿瘤组织用胰酶消化法制备成单细胞悬液， 进行体外原代培养，培养液为高糖DMEM加20X (v/v)胎牛血清， 37°C， 5。/。C02/95X空气，饱和湿度培养，隔天换培养液，每3 4 天传代一次，传代后培养液中添加的胎牛血清改用10%;6) 系列实验检测，验证细胞特征。
4、根据权利要求3所述的人乳腺癌细胞系的建立方法，其特征在于悬浮培养液为无血清培养基DMED-F12，添加的生长因子有 B27、 20ng/mLEGF、 5 u g/mL insulin、及0.4%BSA。
全文摘要
本发明采用人乳腺癌SK-BR-3细胞株作为建系的源细胞，将其在雌性NOD/SCID鼠乳腺脂肪垫连续接种传代，并在低剂量化疗药尾静脉注射的压力下筛选，建立富含成瘤性乳腺癌干细胞的人乳腺癌细胞系SK-3rd。此细胞与未经NOD/SCID鼠体内传代的源细胞SK-BR-3相比，所含的肿瘤干细胞的比例显著增加；细胞悬浮培养时，球囊形成率及球囊所含细胞数目显著增加；SK-3rd球囊细胞诱导分化过程中，未分化的癌细胞细胞比例减少，但明显高于源细胞；SK-3rd细胞形成的球囊细胞具有癌干细胞的表型，这些表型在其分化过程中逐渐消失。NOD/SCID鼠原位移植成瘤率高、远处转移率高、成瘤周期短、成瘤所需的最低细胞数少。是一种理想的研究乳腺癌干细胞的模型，在揭示乳腺癌的发生机制和肿瘤的治疗中有着广阔的应用前景。
文档编号C12N5/08GK101240261SQ20071002676
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月6日 优先权日2007年2月6日
发明者于风燕, 宋尔卫, 胡孝渠 申请人:中山大学