专利名称：一种纳豆激酶的纯化方法
技术领域：
本发明涉及纳豆激酶，特别是涉及一种纳豆激酶的纯化方法。
背景技术：
人体内的血栓常引发脉管栓塞、脑血栓中风、心肌梗塞、肺梗塞、极性肺原性心脏病等严重疾病。血栓栓塞病具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高等特点，极大地危害着人类的生命和健康，人们期望能研发和生产出更多高效优质的溶栓药物在临床应用。纳豆激酶(Nattokinase，NK)自1987年发现至今，已经逐步得到广泛深入的研究，其酰胺水解活性、纤溶活性以及溶血栓作用已经被证实。且纳豆激酶与现用的链激酶、尿激酶、重组组织型纤溶酶原激活剂等溶栓药物相比，具有安全性高、作用直接迅速、易被人体吸收、特异性高、在体内持续时间长、口服和注射均可等优点，可用于开发新一代的溶栓剂或保健食品，具有极为诱人的广阔前景。
现有纳豆激酶的纯化方法大多存在工艺繁琐，不易操作，纯度低等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有纳豆激酶纯化方法上存在的不足，提供一种工艺简单，操作方便，可以规模化生产，产品纯度高的纳豆激酶纯化方法。
一种纳豆激酶的纯化方法，包括如下步骤
(1)发酵液预处理将纳豆菌发酵液离心，收集上清液，上清液用0.2～0.45μm滤膜过滤，收集过滤清液；(2)离子交换层析柱纯化离子交换层析所用凝胶为CM SepharoseFast Flow，凝胶先用pH6.8、含6～70mM的磷酸盐缓冲液平衡好；调节过滤清液的离子浓度，使其电导率为1.6～2.2mS/cm，以6～15mL/min的流速将其加入柱中；先用pH6.8、6mM的磷酸盐缓冲液洗涤柱床，再用pH6.8含6mM的磷酸二氢钠和0～1M氯化钠的洗脱液线型梯度洗脱，流速为5～10mL/min；(或把经调节离子浓度的过滤清液在加入柱之前先装入塑料桶中，加入2L已平衡好的凝胶，调pH为6.0，用搅拌机慢速搅拌吸附30分钟，吸附完成，滤掉清液，洗涤凝胶，凝胶上柱；再用pH6.8、6mM的磷酸盐缓冲液平衡柱子，后用pH6.8，含6mM磷酸二氢钠和100mM氯化钠的溶液洗脱，流速为30～100mL/min)用紫外分光光度计在波长为280nm处检测，收集OD280为0.01以上的洗脱液；(3)冷冻干燥将纳豆激酶洗脱液经滤膜过滤除菌，加入添加剂及赋型剂，分装，冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉剂。
在上述纯化方法中，步骤(1)所述将纳豆菌发酵液离心是采用高速冷冻离心机在4～10℃，8000～16000rpm的速度下离心5～10min；或者是采用发酵罐夹层冷却法冷却至4～15℃，用高速管式离心机以10000～16000rpm的速度离心。
在上述纯化方法中，步骤(2)所述离子交换层析所用的柱规格为内径3.5～5.5厘米，高20～30厘米；或为内径16～20厘米，高38～60厘米。
在上述纯化方法中，步骤(3)所述滤膜为0.2μm滤膜。
在上述纯化方法中，步骤(3)所述的添加剂为吐温-80，用量为0.05％，所述赋型剂为甘露醇，用量为2％。
在上述纯化方法中，步骤(3)所述加入添加剂及赋型剂调节浓度为1000IU/mL后再分装。
在上述纯化方法中，步骤(3)所述冷冻干燥是指在冷冻温度为-40℃，真空干燥温度为5～10℃条件下冷冻干燥30～36小时。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明的纯化方法是将纳豆菌发酵液离心，取上清液，过滤，滤液经离子交换层析柱，收集含纳豆激酶的洗脱液，经冷冻干燥即获得纳豆激酶冻干粉剂。该纯化方法工艺简单，操作方便，可以规模化生产，产品纯度高，应用前景广阔。
具体实施例方式
实施例11.发酵液预处理将纳豆菌发酵液用高速冷冻离心机在4℃下，以8000rpm的速度离心10min，收集上清液。上清液用0.45μm滤膜过滤，收集过滤清液，作上柱液备用。
2.离子交换层析纯化离子交换层析所用凝胶为CM Sepharose Fast Flow，柱规格为内径3.5厘米，高20厘米；凝胶先后用pH6.8、含70mM和6mM的磷酸盐缓冲液平衡好；调节过滤清液的离子浓度(电导率调为1.8mS/cm)；调好离子浓度的过滤清液以10mL/min的速度加进柱中；先用pH6.8、6mM的磷酸盐缓冲液洗涤柱床，再用pH6.8、含6mM的磷酸二氢钠和1M氯化钠的洗脱液线性梯度洗脱，流速为6mL/min；用紫外分光光度计在波长为280nm处检测，收集OD280为0.01以上的洗脱液。
3.冷冻干燥将纳豆激酶洗脱液用0.2μm滤膜过滤除菌，加入0.05％吐温-80和2％甘露醇，调节浓度为1000IU/mL，用10mL硼硅注射剂瓶分装，装量为1mL/瓶，在冷冻温度为-40℃，真空干燥温度为10℃条件下冷冻干燥30小时，获得纳豆激酶冻干粉。
实施例21.发酵液预处理将纳豆激酶用高速冷冻离心机在10℃下，以12000rpm的速度离心5min，收集上清液。上清液用0.2μm滤膜过滤，收集过滤清液，作为上柱样液备用。
2.离子交换层析纯化离子交换层析所用凝胶为CM Sepharose Fast Flow，柱规格为内径5.5厘米，高30厘米；凝胶先、后用pH6.8、含70mM和6mM的磷酸盐缓冲液平衡好；调节过滤清液的离子浓度(电导率调为2.0mS/cm)；将调好离子浓度的过滤清液以15mL/min的速度加进柱中；先用pH6.8、6mM的磷酸盐缓冲液洗涤柱床，再用pH6.8、含6mM磷酸二氢钠和0.5M氯化钠的洗脱液线性梯度洗脱，流速为10mL/min；用紫外分光光度计在波长280nm处检测，收集OD280为0.01以上的洗脱液。
3.冷冻干燥将收集到的纳豆激酶洗脱液经0.2μm滤膜过滤除菌，加入0.05％吐温-80和2％甘露醇，调节浓度为1000IU/mL，用10mL硼硅注射剂瓶分装，装量为1mL/瓶，在冷冻温度为-40℃，真空干燥温度为5℃条件下冷冻干燥36小时，即获得纳豆激酶冻干粉。
实施例31.发酵液预处理将纳豆菌发酵液通过发酵罐夹层冷却法冷却至15℃，用高速管式离心机以16000rpm的速度离心，收集上清液。上清液用0.2μm滤膜过滤，收集过滤清液，作为上柱样液备用。
2.离子交换层析纯化离子交换层析所用凝胶为CM Sepharose Fast Flow，柱规格为内径16厘米，高38厘米；凝胶先、后用pH6.0、含70mM和6mM的磷酸盐缓冲液平衡好；调节已准备的过滤清液的离子浓度(电导率调为2.2mS/cm)，装入塑料桶中，加进2L已平衡好的CM Sepharose FastFlow凝胶，调pH为6.0，用搅拌机慢速搅拌吸附30分钟，吸附完成，滤掉清液，洗涤凝胶，凝胶上柱；再用pH6.8、含6mM的磷酸盐缓冲液平衡柱子，最后用pH6.8、含6mM磷酸二氢钠和100mM氯化钠的洗脱液洗脱，流速为50mL/min；用紫外分光光度计在波长280nm处检测，收集OD280为0.01以上的洗脱液。
3.冷冻干燥将收集到的纳豆激酶洗脱液经0.2μm滤膜过滤除菌，加入添加剂0.05％吐温-80、赋型剂2％甘露醇，调节浓度为1000IU/mL，用10mL硼硅注射剂瓶分装，装量为1mL/瓶，在冷冻温度为-40℃，真空干燥温度为8℃条件下冷冻干燥32小时，即获得纳豆激酶冻干粉剂。
权利要求
1.一种纳豆激酶的纯化方法，包括如下步骤(1)发酵液预处理将纳豆菌发酵液离心，收集上清液，上清液用0.2～0.45μm滤膜过滤，收集过滤清液；(2)离子交换层析柱纯化离子交换层析所用凝胶为CM SepharoseFast Flow，凝胶先用pH6.8、含6～70mM的磷酸盐缓冲液平衡好；调节过滤清液的离子浓度，使其电导率为1.6～2.2mS/cm，以6～15mL/min的流速将其加入柱中，先用pH6.8、6mM的磷酸盐缓冲液洗涤柱床，再用pH6.8含6mM的磷酸二氢钠和0～1M氯化钠的洗脱液线型梯度洗脱，流速为5～10mL/min；或把经调节离子浓度的过滤清液在加入柱之前先装入塑料桶中，加入2L已平衡好的凝胶，调pH为6.0，用搅拌机慢速搅拌吸附30分钟，吸附完成，滤掉清液，洗涤凝胶，凝胶上柱，再用pH6.8、6mM的磷酸盐缓冲液平衡柱子，后用pH6.8，含6mM磷酸二氢钠和100mM氯化钠的溶液洗脱，流速为30～100mL/min；用紫外分光光度计在波长为280nm处检测，收集OD280为0.01以上的洗脱液；(3)冷冻干燥将纳豆激酶洗脱液经滤膜过滤除菌，加入添加剂及赋型剂，分装，冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉剂。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(1)所述将纳豆菌发酵液离心是采用高速冷冻离心机在4～10℃，8000～16000rpm的速度下离心5～10min；或者是采用发酵罐夹层冷却法冷却至4～15℃，用高速管式离心机以10000～16000rpm的速度离心。
3.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(2)所述离子交换层析所用的柱规格为内径3.5～5.5厘米，高20～30厘米；或为内径16～20厘米，高38～60厘米。
4.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(3)所述滤膜为0.2μm滤膜。
5.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(3)所述的添加剂为吐温-80，用量为0.05％；所述赋型剂为甘露醇，用量为2％。
6.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(3)所述加入添加剂及赋型剂调节浓度为1000IU/mL后再分装。
7.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(3)所述冷冻干燥是指在冷冻温度为-40℃，真空干燥温度为5～10℃条件下冷冻干燥30～36小时。
全文摘要
本发明公开了一种纳豆激酶的纯化方法。本发明的纯化方法是将纳豆菌发酵液离心，取上清液，过滤，滤液经离子交换层析柱，收集含纳豆激酶的洗脱液，经冷冻干燥即获得纳豆激酶冻干粉剂。该纯化方法工艺简单，操作方便，可以规模化生产，产品纯度高，应用前景广阔。
文档编号C12N9/12GK101058804SQ20071002748
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月10日 优先权日2007年4月10日
发明者彭中健, 夏枫耿, 李运南, 梁淑娃, 董加喜, 谭颖嫦, 蓝碧锋, 杜少平, 明飞平 申请人:广州市微生物研究所