专利名称：超螺旋质粒分离纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及高纯度超螺旋质粒的提取和纯化工艺。
背景技术：
基因治疗和基因疫苗作为新兴的分别用来治疗重大疾病和预防疾病的手段，越来越受到研究者的重视。而基因治疗和基因疫苗的关键是将目的基因导入靶细胞，这就需要合适的载体来把目的基因导入靶细胞。最常用的载体主要有病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体如反转录病毒、腺病毒及其其他病毒体转染率一般较高，但存在一些安全忧虑。而非病毒载体方法例如将基因插入质粒导入靶细胞被认为是比较安全和方便的一种方法。但质粒DNA在靶细胞中的基因表达效率低、持续时间短，因此需要大量的符合药学规格的质粒DNA。一般一个疗程需要毫克数量级的质粒DNA。这使质粒DNA作为生物制剂产品的生产面临着新的严峻的挑战。
质粒DNA一般是细胞质中独立于染色体以外的共价闭环的小分子双链DNA，它具有独立复制的能力。在质粒DNA提取过程中，由于剪切力，质粒DNA主要以超螺旋形、开环形、线形三种构象存在。而超螺旋形于其他两种构象相比，进入靶细胞以后的稳定性和表达能力较强。因此，用在基因治疗和基因疫苗中的质粒DNA超螺旋形的比例越高，起到的效果越明显。因此，在生产质粒DNA制品时，产品中超螺旋质粒DNA的比例越高越好，超螺旋质粒DNA的分离纯化成为一个重要的迫待解决研究课题。
用于人体的质粒DNA有很严格的要求，质粒DNA的纯化过程中不能使用动物源性的酶，例如RNase A和蛋白酶K；不能使用对人畜有毒的苯酚、氯仿等有机溶剂。所以，目前制备质粒DNA的实验室方法虽然很多，但存在着许多问题，例如使用有毒有机试剂酚或氯仿来降低细胞蛋白浓度等，得到的产品不符合世界卫生组织的要求，不能用于人体，也大多都不适用于工业生产。
同时，目前大规模纯化质粒DNA的方法有氯化铯密度梯度离心法、亲和层系法、分子截留法和多聚阳离子沉淀法等。其中氯化铯密度梯度离心纯化质粒DNA是最经典的方法，虽然此方法所纯化的质粒DNA能够达到相关标准，纯度也相当高，但是它必须在使用溴化乙锭和氯化铯的情况下长时间高速离心制得，不仅耗时、耗力，而且污染环境，费用昂贵，不适合工业化生产。
也有报道利用反向层析RPC、疏水层析HIC、羟基磷灰石层析HAC、离子交换层析IEX、亲和层析AFC和凝胶过滤层析SEC等来纯化超螺旋质粒DNA，取得了较好的效果。但大多数过程都用到了溶菌酶来破坏细胞壁，用胰RNase来除去RNA，这样就引入了动物源性的酶；并且大多数纯化过程都需要3根或更多的层析柱来进行，这样就增加了生产成本，增加了生产一批产品的时间。
所以，要建立一套纯化率高、操作简单、易于放大、毒性低、低成本的适合工业化生产的超螺旋质粒DNA纯化工艺，来解决质粒DNA作为生物制剂产品的生产与应用过程中面临的严峻挑战。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种超螺旋质粒分离纯化工艺，不使用动物源性的酶，不使用对人畜有毒的苯酚、氯仿等有机溶剂，优化了工艺原料的用量和步骤，降低了生产成本，减少了对环境的污染，提高了提取效率。
本发明的技术方案是提供一种超螺旋质粒分离纯化工艺，包括以下步骤(1)取发酵菌液，4℃、5000g离心2min，去上清，得菌体沉淀；(2)STE洗脱液洗涤，于4℃、5000g条件下离心2min，去上清，沉淀干燥得湿菌；(3)湿菌中加入溶液I；(4)加入溶液溶液II，轻轻混匀，室温放置3min；(5)加入冰预冷溶液III，轻轻混匀，冰上放置5min，于4℃、12000g条件下离心15min，取上清液；(6)上清液中加入硫酸铵调电导率至280-285ms/cm，4℃放置20min，于4℃、12000g条件下离心15min，取上清液；(7)上清液经疏水层析柱层析，洗脱收集第2个峰；(8)第2个峰经分子筛柱层析，洗脱收集第1个峰。
步骤(2)所述STE洗涤是用与发酵菌液等体积的STE将细胞沉淀洗涤，于4℃、5000g条件下离心2min，去上清，干燥沉淀，得湿菌并称重。
所述STE含0.1mol/L NaCl，pH8.0的10mmol/L Tri s-C1，pH8.0的1mmol/L EDTA。
步骤(3)所述溶液I是按照溶液I湿菌重等于15ml∶1g的比例加入，所述溶液I含pH8.0的25mmol/L Tri s-Cl，pH8.0的10mmol/LEDTA，50mmol/L Glucose。
步骤(4)所述溶液II是按照溶液II溶液I等于l∶1的比例加入，所述溶液II是2％SDS溶液和0.4mol/L Na0H溶液等体积的新鲜混合液。
步骤(5)所述溶液III是按照溶液III溶液I等于1∶1的比例加入，所述溶液III是醋酸钾缓冲液，浓度为3mol/L。
本发明步骤(7)所述疏水层析平衡疏水层析的缓冲液为2-3.5mol/L；所述平衡层析缓冲液中EDTA浓度为10mmol/L，Tris-Cl浓度为100mmol/L，所述平衡缓冲液的pH为7.5-8.0。
本发明的有益效果是1、本发明所描述的超螺旋质粒DNA的纯化工艺不使用动物源性的RNase A和蛋白酶K以及对人体和动物有毒副作用的苯酚、氯仿，也没有使用易燃的试剂乙醇和异丙醇，降低了生产成本和和产品毒性。
2、本发明优化了原料尤其是溶液I的用量，降低了生产成本，减少了对环境的污染，提高了提取效率。
3、本发明只利用两种层析填料达到了对超螺旋质粒DNA纯化的目的，减少了生产成本，减少了时间，从而提高了生产效率。
4、本发明为超螺旋质粒DNA在制备基因治疗和基因疫苗药物方面的应用打下了坚实的基础。
图1本发明溶液I最佳用量筛选2本发明疏水层析图谱图3本发明疏水层析电泳图谱，0.8％琼脂糖，100V电压，跑后EB染色图4本发明分子筛层析图谱具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1溶液I最佳用量实验(1)取菌液20ul，接种到20ml LB培养基中，培养基中含50ug/ml的Ka，37℃，220rpm离心操作后，培养过夜。取8支离心管分别称重，记录重量并分别标号1-8，把过夜菌液混匀，1-8号离心管分别加入混匀的菌液4ml、3.5ml、3ml、2.5ml、2ml、1.5ml、lml、500ul，4000g、4℃条件下离心操作2min。去掉培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
(2)将细胞沉淀分别重悬于4ml、3.5ml、3ml、2.5ml、2ml、1.5ml、1ml、500ul STE，4℃、5000g条件离心2min，去掉洗涤液，使细胞沉淀尽可能干燥。称各管重量，得菌重分别为0.03g、0.026g、0.023g、0.019g、0.015g、0.013g、0.009g、0.004g。
(3)向1-8号EP管中分别加入100ul预冷的溶液I，充分混匀。
(4)向1-8号EP管中加入200ul新鲜配制的溶液溶液II，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液II接触。不要振荡，将离心管静置5min。
(5)向各EP管中加150ul冰预冷的溶液III，将管倒置后温和地振荡10秒钟使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置冰上5min。4℃、12000g离心15min，取上清300ul。
(6)加0.6倍体积的异丙醇，4℃放置15min。常温12000g离心30min。70％乙醇洗两遍，在空气中使核酸沉淀干燥10min。1-8号管分别用400ul、350ul、300ul、250ul、200ul、150ul、100ul、50ul TE溶解核酸。取5ul样品采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测质粒中超螺旋的含量和比例，得出结果如图1，图1中，纵坐标为质粒DNA相对量，每克菌体加溶液I毫升数。本发明优选溶液I最佳用量控制为溶液I湿菌重等于15ml∶1g。
实施例2(1)取发酵菌液，4℃，5000g离心2min，去上清，得菌体沉淀。
(2)沉淀用与发酵菌液等体积的STE洗涤，4℃、5000g离心2min，去上清，使沉淀尽可能干燥，得湿菌，并称重。
(3)按照溶液I湿菌重等于15ml∶1g的比例向菌体中加入溶液I，使细胞沉淀充分悬浮。
(4)按照溶液II溶液I等于1∶1的比例加入新鲜配制的溶液II，轻轻混匀，室温放置3min。
(5)按照溶液III溶液I等于1∶1的比例加入冰预冷溶液III，轻轻混匀，使溶液成分接触，冰上放置5min。4℃、12000g条件离心15min，取上清液。
(6)向上清液中加入硫酸铵调电导率至280-285ms/cm，4℃放置20min后，4℃、12000g条件离心15min，取上清。
(7)上清液上预先平衡好的疏水层析介质OCTYL SEPHAROSE 4FAST FLOW柱子，后洗脱收集第2个峰。疏水层析图谱见图2，图2中，1号峰为OC plasmid DNA，2号峰为Supercoiled plasmid DNA，3号峰为RNA，4号峰为小分子杂质。
电泳图谱见图3，图3中，由左至右依次为碱裂解上清，加(NH4)2SO4后离心沉淀，加(NH4)2SO4后上清，1号峰峰尖，2号峰峰尖，2号峰大样，2号峰大样，3号峰峰尖，4号峰峰尖。
(8)收集的第二个峰上预先处理好的分子筛层析介质SEPHACRYLS-500HR，洗脱收集第一个峰。图谱见图4，图4中，1号峰Supercoiled plasmid DNA；2号峰小分子杂质。
采用常规的0.8％琼脂糖凝胶电泳方法检测质粒中超螺旋质粒含量达95％以上，蛋白、基因组和内毒素含量都符合药典要求。
实验结论按照本发明工艺，采用了溶液I的最佳用量，减少了成本，同时降低了对环境的污染；上柱前没有利用异丙醇或乙醇对样品进行沉淀，直接用硫酸铵来调节溶液的电导率和达到除去RNA和蛋白等杂志的效果，减少了损失和生产成本，也为用层析柱进一步纯化打下了基础。
权利要求
1.一种超螺旋质粒分离纯化工艺，其特征是包括以下步骤(1)取发酵菌液，4℃、5000g离心2min，去上清，得菌体沉淀；(2)STE洗脱液洗涤，于4℃、5000g条件下离心2min，去上清，沉淀干燥得湿菌；(3)湿菌中加入溶液I；(4)加入溶液溶液II，轻轻混匀，室温放置3min；(5)加入冰预冷溶液III，轻轻混匀，冰上放置5min，于4℃、12000g条件下离心15min，取上清液；(6)上清液中加入硫酸铵调电导率至280-285ms/cm，4℃放置20min，于4℃、12000g条件下离心15min，取上清液；(7)上清液经疏水层析柱层析，洗脱收集第2个峰；(8)第2个峰经分子筛柱层析，洗脱收集第1个峰。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征是步骤(2)所述STE洗涤是用与发酵菌液等体积的STE将细胞沉淀洗涤，于4℃、5000g条件下离心2min，去上清，干燥沉淀，得湿菌并称重。
3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征是所述STE含0.1mol/L NaCl，pH8.0的10mmol/L Tris-Cl，pH8.0的1mmol/L EDTA。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征是步骤(3)所述溶液I是按照溶液I∶湿菌重等于15ml∶1g的比例加入。
5.根据权利要求1或4所述的工艺，其特征是所述溶液I含pH8.0的25mmol/L Tri s-Cl，pH8.0的10mmol/L EDTA，50mmol/L Glucose。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征是步骤(4)所述溶液II是按照溶液II∶溶液I等于1∶1的比例加入。
7.根据权利要求1或6所述的工艺，其特征是所述溶液II是2％SDS溶液和0.4mol/L NaOH溶液等体积的新鲜混合液。
8.根据权利要求1所述的工艺，其特征是步骤(5)所述溶液III是按照溶液III∶溶液I等于1∶1的比例加入。
9.根据权利要求1或8所述的工艺，其特征是所述溶液III是醋酸钾缓冲液，浓度为3mol/L。
10.根据权利要求1所述的工艺，其特征是步骤(7)所述疏水层析平衡疏水层析的缓冲液为2-3.5mol/L；所述平衡层析缓冲液中EDTA浓度为10mmol/L，Tris-Cl浓度为100mmol/L，所述平衡缓冲液的pH为7.5-8.0。
全文摘要
本发明公开了一种超螺旋质粒分离纯化工艺，不使用动物源性的酶，不使用对人畜有毒的苯酚、氯仿等有机溶剂，优化了工艺原料的用量和步骤，降低了生产成本，减少了对环境的污染，提高了提取效率，为超螺旋质粒DNA在制备基因治疗和基因疫苗药物方面的应用打下了坚实的基础。
文档编号C12N15/63GK101070543SQ200710028389
公开日2007年11月14日 申请日期2007年6月1日 优先权日2007年6月1日
发明者黄树林, 李黄金, 薄华本, 邵红伟, 沈娟, 余雪松 申请人:广东药学院