专利名称：一种t-载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及到用于克隆DNA PCR片段的载体，具体说涉及一种T-载体片段末端核 苷酸序列。
技术背景DNA克隆是现代生命科研究中的重要技术。特定基因的克隆是功能研究的重要一 步。PCR技术和DNA克隆相结合大大简化了克隆特定基因的步骤，缩短了克隆特定基 因的时间，不仅对于生命科学的发展有着巨大的推动作用，而且在疾病的快速诊断 等领域也有巨大的应用价值。PCR是一种在生物学和医学研究中常用的扩增DNA模板的实验方法。PCR常用的 Taq DNA Polymerase不仅具有在高温下沿5 '至U 3 '方向复制模板，延长DNA引物的 活性，而且可以在DNA 3 '末段不依赖于模板序列填加一到数个腺苷A。直接利用平 端连接法克隆这样的PCR产物效率很低.解决的方法有首先消去3'末端突出碱基 将PCR产物变成平端DNA提高克隆效率，则需要很多时间。如果在两引物的5 '末端 设计限制性内切酶酶切位点，这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端也可 用于粘性末端法与载体连接。现在一般使用所谓的T-载体(T-Vector)用来提高克隆PCR片段的效率。所谓 的T-载体(T-Vector)，就是利用各种技术，使平端载体DNA转变成3 '末端突出一 个胸苷的T尾载体。用这种T一载体(T-Vector)可以较有效地直接克隆PCR产物。T-载体(T-Vector)的制备方法有(1) 利用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3 '末端加上一个胸 苷。具体是用dTTP作为底物，脱氧核苷酸末端转移酶催化，使平端载体DNA分子的 两个3'末端各加上一个T。(2) 先将载体切成平端，然后在只加入ddTTP时，用TaqDNA聚合酶使平端载体 DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T-载体。(3) 构建包含2个Xcm I酶切位点的载体，用Xcm I彻底消化质粒后，回收即 得获得T-载体。(4) 利用Topoisomerase I的特点构建的T-载体(T-Vector)。 发明内容本发明的目的是提供了一种T-载体。本发明的目的是这样实现的 一种T-载体，其特征在于T-载体经过先经 Eaml1051或Ahdl限制性内切酶酶切，然后在其两5'末端修饰上胸腺啼啶T，所述 的T-载体末端的核苷酸序列如下5'- gac丽t WgTC3,- CTG丽f丽CAG从5'末端开始计数，第六个核苷酸N，碱基必须是胸腺嘧啶，其它N可以是构成DNA 的脱氧核糖核苷A、 T、 C、 G中的任意一种。本发明T-载体，利用限制性内切酶酶切位点，在两引物的5'设计成带有突出t 的末端，这样的T-载体(T-Vector)用能提高克隆PCR片段的效率。
图1为本发明所设计T-载体及应用示意图具体实施方式
本发明利用限制性内切酶Eaml1051或Ahdl识别位点序列，设计成经Eaml1051 或Ahdl酶切后可以和在3 '末端带有A的DNA PCR片段互补的形式(以下说明只显 示载体一端的情况)Eaml 105I或Ahdl识别位点序列将Eaml 1051或Ahdl识别位点序列修饰修饰后Eaml 1051或Ahdl识别位点序列酶切后可以和在3'末端携带有A的DNA PCR片断互补5'- gacnnnnngtc皿3, 3'國ctgnn nnnctg -5'5,- gacnntnngtc -3'3'- ctgnnannctg -5'5,- gacnntnngtc -3'3,- ctgnnannctg -5'5, 3'gacnntn關關na -3， ctgnnannnnnn -5,PCR片断实施例1.按照T-载体引物设计思路设计如下PCR引物， forward primer: Ftv 5'-ACTGGTACCTGACAGTGAGTCTAGCTGTTTCCTGTGTGAAAT-3'， 其中，GGTACC和GACAGTGAGTC分别是限制性内切酶 Kpnl和Eaml1051 (Ahdl)的识别作用位点。reverse primer: Rtv: 5'-ACTGAGCTCTGACAGTGAGTCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG-3'，其中，GAGCTC禾Q GACAGTGAGTC分别是限制性内切酶 Sacl和Eamll05I (Ahdl)的识别作用位点。2. 利用pBluescript II SK (-)作为模板，用以上两引物扩增DNA片段(序列见 3)。将所扩增的DNA片段分离，纯化后用Kpnl和Sacl酶切，然后与预先经 过同样酶切的pBluescript II SK (-)连接。3. 本实施例中所用引物扩增的DNA片段序列(pBS: 1199—816&)tagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac asca_t3cga_g ccggasgcst sssgtgtsss gcctggggtg cctsa_tga_gt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcgggga^ga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aa_aa_a_ggcc4. 将以上成功连接后获得的新的质粒导入到感受态大肠杆菌中；然后将细菌涂布到固体培养基上。第二天挑取生长状况以及和其它菌落隔离良好的菌落到液体培养基中，隔夜生长。在第二天提取质粒DNA。从中筛选出带有在实施例1步骤2 中所获DNA片段的新的质粒，命名为pBSTl。5. 将所获新的T-载体pBSTl利用限制性内切酶Eaml1051或Ahdl切除，然后将反应 产物中用于克隆载体的部分和其它片段通过电泳分离，最后结果为T-载体成品。6. 通过以上步骤所获得成品测试和DNA-PCR片段连接，结果如下 阴性对照 4个菌落阳性培养皿中大约250个菌落，任意挑取其中IO个菌落检査，都可以发现所 克隆的DNA-PCR片段。
权利要求
1.一种T-载体，其特征在于T-载体含有两个经过如下修饰的Eam1105I或AhdI限制性内切酶切点5′-GACNNT↓NNGTC3′-CTGNN↑ANNCAG从5′末端开始计数，第六个核苷酸N，碱基必须是胸腺嘧啶T，其它N可以是构成DNA的脱氧核糖核苷A、T、C、G中的任意一种。
全文摘要
本发明属于分子生物学和生物技术领域，提供了一种T-载体。本发明将限制性内切酶Eam1105I或AhdI酶切位点设计成经过酶切可以和带有3′A粘性末端互补的形式，然后将其插入到克窿载体中。根据本发明所制备的载体克隆具有效率高的特点。
文档编号C12N15/63GK101157933SQ20071003037
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月21日 优先权日2007年9月21日
发明者刘文宽, 李伟杰, 王子元, 福 谷 申请人:汕头大学