专利名称：一种酶法制备n-3PUFA海洋甘油酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用脂肪酶催化合成n-3PUFA海洋甘油酯的方法，属于生物 技术及功能保健领域。
背景技术：
在本发明中，"n-3PUFA"是指n-3多不饱和脂肪酸；"DHA"是指二十二 碳六烯酸，"EPA"是指二十碳五烯酸。天然鱼油中的DHA和EPA主要以甘油三 酯的形式存在，其相对含量比较低，保健和医疗效果比较差，难以满足消费者 的需要。为了提高DHA和EPA的保健和医疗效果，众多研究者将甘油酯中的DHA 和EPA转酯化或者水解转化为相应的乙酯或者游离形式，然后再通过各种物理 或者化学方法提高DHA和EPA的含量，以此来增强DHA和EPA的保健和医疗效 果。1990年美国FDA的研究人员通过大量实验后，发现DHA和EPA的甘油酯型、 乙酯型和游离脂肪酸型在人体内消化吸收有差异。Ikuo等研究的结果也表明， DHA和EPA乙酯型在人体中不仅消化和吸收比较困难，而且可能存在安全隐患； 游离型的DHA和EPA虽然易于被人体消化和吸收，但是容易氧化生成对人体有 害的物质，而且有酸味、口感不好，直接作为食用难以被人们接受；DHA和EPA 的甘油酯型不仅性质稳定、不易氧化、口感好、易被人体消化吸收，而且是DHA 和EPA的天然存在形式，因此EPA和DHA的甘油酯型是保健品和药品的最佳产 品型式。再者，随着人们生活水平的提高，消费者对天然鱼油甘油酯型保健品 中EPA和DHA含量低不再满足，期望提供安全性好和EPA和DHA含量高的甘油 酯型保健品。因此EPA和DHA甘油酯产品将会是未来鱼油保健品及药品的主要 发展方向。
n-3 PUFA海洋甘油酯可以从海洋生物(如金枪鱼、沙丁鱼、鳕鱼等)中提 取获得，但是n-3PUFA的含量比较低；n-3PUFA海洋甘油酯也可以利用合成的 方法获得。英国药典2000年版和欧洲药典对n-3 PUFA海洋甘油酯的定义如下
n-3PUFA海洋甘油酯是n-3 PUFA与甘油生成的单酯、二酯和三酯的混合物，其 中主要为三酯。其由高浓度的n-3PUFA与甘油酯化而得。n-3PUFA主要有下列 几种十八碳三烯酸，十八碳四烯酸，二十碳四烯酸(M)， 二十碳五烯酸(EPA), 二十一碳五烯酸，二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。它们主要 来源于海洋鱼油。药典规定n-3 PUFA的总浓度以甘油三酯计，不得少于60%， 其中DHA、 EPA的总浓度之和以甘油酯计，不得少于45%。 n-3 PUFA海洋甘油酯 产品为淡黄色液体，几乎不溶于水，易溶于丙酮和庚烷，微溶于乙醇。由于n-3 PUFA富含不饱和脂肪酸，极易氧化，因此应贮藏于密封的容器中，避光存放于 惰性气体下，维生素E和茶多酚等可作为抗氧化剂加入。n-3 PUFA海洋甘油酯 易被人体消化吸收，使体内不饱和脂肪酸增多，表现出一系列药理作用n-3 PUFA 海洋甘油酯在人体内，能够显著降低血浆中甘油三酯和极低密度脂蛋白水平， 调节血脂；能够降低心收縮压，减少心血管疾病的发病危险；改善血管内皮功 能，增强血管内皮依赖性扩张，增加动脉血流量；抗炎、抗血小板凝集作用； 健脑益智等。
欧美和日本等国家对n-3 PUFA海洋甘油酯的研究报道较多，而我国的研究 尚处于起步阶段，研究报道较少，高含量n-3PUFA的海洋甘油酯还未见产品问 世。我国对制备n-3PUFA海洋甘油酯的研究主要是采用脂肪酶的选择性水解或 者是酯交换，而利用脂肪酶催化合成方法制备n-3PUFA海洋甘油酯的研究还处 于空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法制备n-3PUFA海洋甘油酯的方法，将精制鱼 油经皂化、酸化、尿素包合法制备n-3PUFA浓縮物、脂肪酶催化n-3PUFA与甘 油合成反应、萃取分离n-3PUFA海洋甘油酯，将n-3PUFA有效的富集在甘油酯 中，制成具有预防和治疗心血管疾病、健脑益智等功能性产品。
本发明的目的可以通过如下工艺措施来实现
1、 n-3PUFA浓縮物的制备
精制鱼油利用氢氧化钠乙醇溶液进行皂化处理，然后利用硫酸酸化，再用 尿素包合法制备出含50% 80% n-3PUFA的浓縮物。
2、 脂肪酶催化n-3PUFA与甘油合成反应
正己烷与甘油比例4 1 /1 (v/w)， n-3 PUFA与甘油比例10% 25% (w/w)， 0. 3% 0. 8% (w/w)的水，脂肪酶Novozym435为n-3 PUFA的4% 12% (w/w)， 在氮气保护下30 5(TC以150rpm震荡进行反应，lh后加0. 5 lg分子筛；反 应12-24h，得反应产物。
3、萃取分离n-3PUFA的海洋甘油酯
反应产物经无水硫酸钠床过滤，除去脂肪酶和分子筛；用标准氢氧化钠溶 液中和游离脂肪酸；用正己烷萃取n-3PUFA海洋甘油酯；用旋转蒸发仪减压去 除溶剂，获得n-3PUFA海洋甘油酯。
本发明具有以下优点
1、 本发明的原料n-3PUFA是来自天然鱼油，安全有效，生产过程中采用充 氮气保护而不添加合成抗氧化剂，有效防止了 n-3PUFA的氧化；
2、 本发明技术工艺科学合理，利用生物酶法进行合成，反应的酯化度高， 提高了原料的利用率，反应过程易于控制；
3、 本发明制备的n-3PUFA海洋甘油酯中主要成分有甘油一酯、甘油二酯和 甘油三酯；甘油二酯化合物以1-DHA-3-DHA-甘油二酯为主；甘油三酯化合物以 1-DHA-2-DHA-3-DHA-甘油三酯和1-EPA-2-DHA-3-DHA-甘油三酯为主；
4、 本发明制备的n-3 PUFA海洋甘油酯的理化指标达到了食用油脂的标准， DHA和EPA的总含量可达到50%~80%;可开发成具有预防和治疗心血管疾病、健 脑益智等功能性产品，具有广阔的市场前景。
具体实施例方式
本发明结合实施工艺实例做进一步说明，但这些实例不对本发明作任何限定。
实例l:
在反应容器中加入正己垸7mL，甘油5g， n-3PUFA浓縮物lg (来自金枪鱼 鱼油，DHA和EPA含量分别为72%和17%)， 0.6% (w/w)的水，40mg脂肪酶 Novozym435，在氮气保护下密封，在40'C的恒温水浴摇床中以150次/min进行 酯化反应，待反应进行lh后，加入lg分子筛除去反应生成的水分。待反应结 束后，将脂肪酶催化合成的反应混合物通过无水硫酸钠床进行过滤，除去酶分
子和分子筛，滤液用0. 025mol/L氢氧化钠溶液滴定(酚酞作指示剂)至溶液呈 微红色，将反应液转移至分液漏斗中，加入25mL正己烷，混合均匀，弃去下层 水溶液，收集上层正己烷层(含有酰基甘油)，再用无水硫酸钠脱水。然后在45'C 条件下用旋转蒸发仪除去正己垸即得n-3PUFA海洋甘油酯。经硅胶柱色谱检测， n-3PUFA海洋甘油酯中甘油二酯含量为56%;甘油三酯31%，和甘油一酯13%; 经气相色谱分析，n-3PUFA海洋甘油酯中DHA含量为70%。 EPA含量为15%。
实例2:
在反应容器中加入正己烷5mL，甘油3g， n-3PUFA浓縮物0. 5g (来自鲣鱼 鱼油，DHA和EPA含量分别为68%和15%)， 0.5% (w/w)的水，20mg脂肪酶 Novozym435，在氮气保护下密封，在4CTC的恒温水浴摇床中以150次/min进行 酯化反应，待反应进行lh后，加入lg分子筛除去反应生成的水分。待反应结 束后，将脂肪酶催化合成的反应混合物通过无水硫酸钠床进行过滤，除去酶分 子和分子筛，滤液用0. 025mol/L氯氧化钠溶液滴定(酚酞作指示剂)至溶液呈 微红色，将反应液转移至分液漏斗中，加入25mL正己垸，混合均匀，弃去下层 水溶液，收集上层正己烷层(含有酰基甘油)，再用无水硫酸钠脱水。然后在45'C 条件下用旋转蒸发仪除去正己垸即得n-3PUFA海洋甘油酯。经硅胶柱色谱检测， n-3PUFA海洋甘油酯中甘油二酯含量为53%;甘油三酯35%,和甘油一酯12%; 经气相色谱分析，n-3PUFA海洋甘油酯中DHA含量为65t EPA含量为17M。
实例3:
在反应容器中加入正己烷10mL，甘油7g， n-3 PUFA浓縮物lg (来自蛇鲻 鱼油，DHA和EPA含量分别为48%和20%)， 0.8% (w/w)的水，80mg脂肪酶 Novozym435，在氮气保护下密封，在4CTC的恒温水浴摇床中以150次/min进行 酯化反应，待反应进行lh后，加入lg分子筛除去反应生成的水分。待反应结 束后，将脂肪酶催化合成的反应混合物通过无水硫酸钠床进行过滤，除去酶分 子和分子筛，滤液用0. 025mol/L氢氧化钠溶液滴定(酚酞作指示剂)至溶液呈 微红色，将反应液转移至分液漏斗中，加入25mL正己烷，混合均匀，弃去下层 水溶液，收集上层正己烷层(含有酰基甘油)，再用无水硫酸钠脱水。然后在45t: 条件下用旋转蒸发仪除去正己烷即得n-3PUFA海洋甘油酯。经硅胶柱色谱检测， n-3PUFA海洋甘油酯中甘油二酯含量为49%;甘油三酯32%，和甘油一酯19%; 经气相色谱分析，n-3PUFA海洋甘油酯中DHA含量为46%。 EPA含量为18%。
权利要求
1、种酶法制备n-3PUFA海洋甘油酯的方法，其特征是包含如下工艺步骤(1)n-3PUFA浓缩物的制备精制鱼油利用氢氧化钠乙醇溶液进行皂化处理，然后利用硫酸酸化，再用尿素包合法制备出50％～80％n-3PUFA浓缩物；(2)脂肪酶催化n-3PUFA与甘油合成反应正己烷与甘油比例4～1/1v/w，n-3PUFA与甘油比例10％～25％w/w，0.3％～0.8％w/w的水，脂肪酶Novozym435为n-3PUFA的4％～12％w/w，在氮气保护下30～50℃以150rpm震荡进行反应，1h后加0.5～1g分子筛；反应12-24h，得反应产物；(3)萃取分离n-3PUFA的海洋甘油酯反应产物经无水硫酸钠床过滤，除去脂肪酶和分子筛；用标准氢氧化钠溶液中和游离脂肪酸；用正己烷萃取n-3PUFA海洋甘油酯；用旋转蒸发仪减压去除溶剂，获得n-3PUFA海洋甘油酯。
2、 据权利要求l所述的一种酶法制备n-3PUFA海洋甘油酯的方法，其特征 是在反应容器中加入正己烷7mL，甘油5g，金枪鱼鱼油n-3 PUFA浓縮物lg， 其中DHA和EPA含量分别为72%和17%， 0. 6%w/w的水，40mg脂肪酶Novozym435， 在氮气保护下密封，在40'C的恒温水浴摇沐中以150次/min进行酯化反应，待 反应进行lh后，加入lg分子筛除去反应生成的水分；待反应结束后，将脂肪 酶催化合成的反应混合物通过无水硫酸钠床进行过滤，除去酶分子和分子筛， 滤液用0.025mol/L氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，至溶液呈微红色，将反 应液转移至分液漏斗中，加入25mL正己烷，混合均匀，弃去下层水溶液，收集 上层正己烷层，含有酰基甘油，再用无水硫酸钠脱水；然后在45'C条件下用旋 转蒸发仪除去正己烷即得n-3PUFA海洋甘油酯；经硅胶柱色谱检测，n-3PUFA海 洋甘油酯中甘油二酯含量为56%;甘油三酯31%，和甘油一酯13%;经气相色谱 分析，n-3PUFA海洋甘油酯中DHA含量为70%; EPA含量为15%。
3、 据权利要求l所述的一种酶法制备n-3PUFA海洋甘油酯的方法，其特征 是在反应容器中加入正己烷5mL，甘油3g，鲣鱼鱼油n-3 PUFA浓縮物0. 5g， 其中DHA和EPA含量分别为68%和15%， 0. 5%w/w的水，20mg脂肪酶Novozym435， 在氮气保护下密封，在4(TC的恒温水浴摇床中以150次/min进行酯化反应，待 反应进行lh后，加入lg分子筛除去反应生成的水分；待反应结束后，将脂肪 酶催化合成的反应混合物通过无水硫酸钠床进行过滤，除去酶分子和分子筛， 滤液用0.025mol/L氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，至溶液呈微红色，将反 应液转移至分液漏斗中，加入25mL正己烷，混合均匀，弃去下层水溶液，收集 上层正己烷层，含有酰基甘油，，再用无水硫酸钠脱水；然后在45'C条件下用旋 转蒸发仪除去正己烷即得n-3PUFA海洋甘油酯；经硅胶柱色谱检测，n-3PUFA海 洋甘油酯中甘油二酯含量为53%;甘油三酯35%，和甘油一酯12%;经气相色谱 分析，n-3PUFA海洋甘油酯中DHA含量为65%; EPA含量为17%。
4、 据权利要求l所述的一种酶法制备n-3PUFA海洋甘油酯的方法，其特征 是在反应容器中加入正己烷10mL，甘油7g，蛇鲻鱼n-3 PUFA浓縮物lg，其中 DHA和EPA含量分别为48%和20%， ， 0. 8%w/w的水，80mg脂肪酶Novozym435， 在氮气保护下密封，在40'C的恒温水浴摇床中以150次/min进行酯化反应，待 反应进行lh后，加入lg分子筛除去反应生成的水分；待反应结束后，将脂肪 酶催化合成的反应混合物通过无水硫酸钠床进行过滤，除去酶分子和分子筛， 滤液用0.025mol/L敦氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，至溶液呈微红色，将反 应液转移至分液漏斗中，加入25mL正己烷，混合均匀，弃去下层水溶液，收集 上层正己烷层，含有酰基甘油，再用无水硫酸钠脱水；然后在45'C条件下用旋 转蒸发仪除去正己烷即得n-3PUFA海洋甘油酯；经硅胶柱色谱检测，n-3P(FA海 洋甘油酯中甘油二酯含量为49%;甘油三酯32%,和甘油一酯19%;经气相色谱 分析，n-3PUFA海洋甘油酯中DHA含量为46%; EPA含量为18%。
全文摘要
一种酶法制备n-3PUFA海洋甘油酯的方法，将精制鱼油经皂化、酸化、尿素包合法制备n-3PUFA浓缩物、脂肪酶催化n-3PUFA与甘油合成反应、萃取分离n-3PUFA海洋甘油酯，将n-3PUFA有效的富集在甘油酯中，制成具有预防和治疗心血管疾病、健脑益智等功能性产品。本发明的原料n-3PUFA是来自天然鱼油，安全有效，生产过程中采用充氮气保护而不添加合成抗氧化剂，有效防止了n-3PUFA的氧化；本发明技术工艺科学合理，利用生物酶法进行合成，反应的酯化度高，提高了原料的利用率，反应过程易于控制；具有广阔的市场前景。
文档编号C12P7/64GK101161819SQ20071003086
公开日2008年4月16日 申请日期2007年10月12日 优先权日2007年10月12日
发明者刘书成, 吉宏武, 静 张, 曹文红, 萍 杨, 洪鹏志, 章超桦, 郝记明 申请人:广东海洋大学