专利名称：一种大片段dna克隆载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及生物克隆技术，尤其涉及一种简单快捷构建大片段 DNA克隆载体的方法。
背景技术：
在分子生物学中，克隆DNA片段是一项常规工作。自从Cohen 等(1973)引入质粒pSC101作克隆载体以来，目前已有大量性能优 良的载体质粒被成功构建并实现商业化生产。现在使用的载体除 了 pBR322, pUC系列，pGEM系列，噬菌体，粘粒外，还有酵母人工 染色体，细菌人工染色体等，这些载体虽已被广泛应用，但由于其 中的外源基因克隆窗口区域的限制性内切酶识别位点不容易替 换，给克隆一些特异DNA片段，尤其是较大的片段，带来很多困 难。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的简单快捷构建大片段DNA克隆 载体的方法，即LJY法。
本发明的技术方案是提供一种大片段DNA克隆载体的构建方 法，包括以下步骤
(1) 在基准引物VF和VR的5'端添加所需限制性内切酶识 别位点并合成扩增引物V1F和V1R;
(2) 以pBR322为模板，用所合成的扩增引物V1F、 V1R扩增
载体骨架；(3)回收载体骨架片段，溶于3.5ul灭菌的超纯水中， 加入反应液1. 1至终浓度为lmM，孵育；
(4) 力Q入5uLDNA Ligation Kit (Mighty Mix),进行连接；
(5) 取(4)连接产物转化入DH5a感受态细胞中，涂布Amp+ 的LB平板培养基后，于37'C培养14 16h，挑取单菌落于含有 Ampicilline的LB液体培养基中37。C振荡培养5 6h;
(6) 以扩增引物V1F和V1R为检测引物，对可疑菌落进行菌 落PCR检测，取可疑质粒，人为引入特异性限制性内切酶进行酶 切鉴定或测序鉴定，最终得到的阳性重组质粒即为目的载体质粒。
步骤(1)所述的基准引物VF和VR序列分别为 VF: 5， -cggaacatgtgagcaaaa-3，； VR: 5， -cttcaataatattgaa-3，。
步骤(2)所述载体骨架是以pBR322的AmpK基因和ori复制 起始点为骨架。
步骤(2)所述扩增条件为94。C 2min; 98°C 15s， 50°C 15s， 72°C 2min， 30个f盾环；72°C 10min。
步骤(3)所述反应液为10XT4 Polynucleotide Kinase buffer 0.5"、 T4 Polynucleotide Kinase 5U和ATP 0. 5til。
步骤(3)所述孵育是于37'C孵育30min。
步骤(4)所述连接是5'端于25。C反应连接30min或平滑末端 于16。C反应连接30min。
本发明具有以下有益效果
(1) 本发明通过独特的引物设计方法和平端连接，可简单快 速地在新构建的克隆载体质粒中引入所需的限制性内切酶识别位 点，并有效地提高载体的外源基因容量和稳定性，避免大片段基 因克隆时常出现的目的基因意外突变等问题。用本发明构建的克 隆载体分子量小，拷贝数较高，以大肠杆菌为寄主，转化率高；
(2) 多克隆位点的限制性内切酶识别位点可根据需要随意添 加，比一般的克隆载体质粒灵活性大；
(3) 能插入较大的外源DNA (>8. 2Kb);
(4) 具有容易操作的检测表型(AmpR);
(5) 以pBR322的AmpR基因和ori复制起始点为骨架，使用 该方法所构建的DNA克隆载体能够使所插入的外源基因片段较稳 定的复制，包括一些对菌体有毒性的基因；
(6) 本发明自环-平端连接也可以针对重组DNA质粒上的特 定位置设计引物，进行定点突变、短序列的插入或基因的敲除。
图l本发明自环-平端连接示意图
具体实施例方式
实施例1
一、材料
1.质粒和菌株pBR322克隆载体(accession No. : J01749)， 用于骨架扩增的模板，购自Takara公司。DH5ct感受态细胞由华 南农业大学禽病教研室保存。
2. 酶和其他试剂T4 Polynucleotide Kinase、 PrimeSTAR HS腿Polymerase禾卩DNA Ligation Kit< Mighty Mix >购自Takara 公司。Gel Extraction Kit和Plasmid mini Kit (200)购自OMEGA 公司。
3. 引物依照pBR322克隆载体序列，设计基准引物(VF， VR) 用于扩增含有Amp和ori的2471-4180区域，由Takara公司合成， 序列为
VF: 5， —cggaacatgtgagcaaaa—3， VR: 5， -cttcaataatattgaa-3，
具体操作步骤
见附图l连接示意图，其中A:载体骨架，包括pBR322的AmpR 基因和ori复制起始点；B，C:待引入的限制性内切酶识别位点； VF， VR:基准引物。
(1) 在基准引物(VF, VR)的5'端添加所需限制性内切酶识 别位点并合成扩增引物(VIF， V1R);
(2) 以pBR322为模板，用所合成的扩增引物(V1F， V1R)按 照如下程序扩增出载体骨架94°C 2min; 98°C 15s， 50°C 15s， 72°C 2min， 30个循环；72。C lOmin;
(3) 回收载体骨架片段，溶于3.5P1灭菌的超纯水中，向 其中力口入下列反应液10XT4 Polynucleotide Kinase buffer 0. 5 y L， T4 Polynucleotide Kinase 5U ， ATP0. 5 y 1至终浓度为 lmM， 37。C孵育30min;
(4) 加入等量的(5uL) DNA Ligation Kit (Mighty Mix), 25°C 30min(若为平滑末端则推荐使用16°C 30min的连接条件)；
(5) 取连接产物转化入DH5a感受态细胞中，涂布Amp+的LB 平板培养基后，于37t:培养14—16h，挑取单菌落于含有 Ampicilline的LB液体培养基中37。C振荡培养5-6h;
(6) 以扩增引物(V1F， V1R)为检测引物，对可疑菌落进行菌 落PCR检测，取可疑质粒，用特异性(人为引入)限制性内切酶 进行酶切鉴定或测序鉴定。最终得到的阳性重组质粒即为目的载 体质粒。
权利要求
1、一种大片段DNA克隆载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)在基准引物VF和VR的5’端添加所需限制性内切酶识别位点并合成扩增引物V1F和V1R；(2)以pBR322为模板，用所合成的扩增引物V1F、V1R扩增载体骨架；(3)回收载体骨架片段，溶于3.5μl灭菌的超纯水中，加入反应液1.5μl至终浓度为1mM，孵育；(4)加入5μ LDNA Ligation Kit(Mighty Mix)，进行连接；(5)取(4)连接产物转化入DH5α感受态细胞中，涂布Amp+的LB平板培养基后，于37℃培养14～16h，挑取单菌落于含有Ampicilline的LB液体培养基中37℃振荡培养5～6h；(6)以扩增引物V1F和V1R为检测引物，对可疑菌落进行菌落PCR检测，取可疑质粒，人为引入特异性限制性内切酶进行酶切鉴定或测序鉴定，最终得到的阳性重组质粒即为目的载体质粒。
2、根据权利要求1所述的大片段DNA克隆载体的构建方法，其 特征在于步骤(1)所述的基准引物VF和VR序列分别为 VF: 5， —cggaacatgtgagcaaaa-3，； VR: 5， -cttcaataatattgaa-3，。
3、根据权利要求1所述的大片段DNA克隆载体的构建方法，其 特征在于步骤(2)所述载体骨架是以pBR322的AmpK基因和ori 复制起始点为骨架。
4、 根据权利要求1所述的大片段DNA克隆载体的构建方法，其 特征在于步骤(2)所述扩增条件为94°C 2min;98°C 15s，50。C 15s， 72°C 2min， 30个循环；72°C 10min。
5、 根据权利要求1所述的大片段DNA克隆载体的构建方法，其 特征在于步骤(3)所述反应液为10XT4 Polynucleotide Kinase buffer 0. 5uL、 T4 Polynucleotide Kinase 5U禾口 ATP 0. 5ul。
6、 根据权利要求1所述的大片段DNA克隆载体的构建方法，其 特征在于步骤(3)所述孵育是于37。C孵育30min。
7、 根据权利要求1所述的大片段DNA克隆载体的构建方法，其 特征在于步骤(4)所述连接是5'端于25'C反应连接30min或平 滑末端于16。C反应连接30min。
全文摘要
本发明公开了一种简单快捷构建克隆载体的方法，简称LJY法和用此方法已构建好的4个克隆载体。本发明以pBR322的AmpR基因和ori复制起始点为骨架，通过独特的引物设计方法和平端连接，可简单快速地在新构建的克隆载体质粒中引入所需的限制性内切酶识别位点，并有效地提高载体的外源基因容量和稳定性，避免大片段基因克隆时常出现的目的基因意外突变等问题。
文档编号C12N15/66GK101195830SQ20071003296
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者周燕芬, 明 廖, 江经纬, 郁宏伟 申请人:华南农业大学