专利名称：一种低拷贝生化反应的方法
技术领域：
本发明涉及一种低拷贝生化反应的方法。
技术背景所谓低拷贝模板(low copy number，LCN)最初由Gill等定义为低于 100pg的DNA模板量[Gill P,Whitaker J. Forensic Sci. int.， 2001， 112:17-40.]。因此，现通常将由至少一种分子数目少的反应物，如分子数目少于100个的 DNA参与的生化反应即为低拷贝生化反应，但从目前的文献报道看，单分 子以及低拷贝生化反应不易实现。因为，从本质上讲，化学反应或生化反应 总是发生在特定的环境中，反应分子在一定的时间和空间内进行有效碰撞， 当反应分子数目少时，若利用常规的反应方法，发生有效碰撞的几率就很小。 因此，从常规的化学反应器到纳米反应器，人们在如何更快地提高反应效率 问题上一直努力着。其实，自然界己经提供了现成的特定区域的反应器，从 纳米尺寸的相对简单的体系，比如酶体系，到微米尺寸的相对复杂的系统， 比如细胞。对于一个合成化学家来说，特定时间和空间的反应的发生，就是 需要在一个限定性空间，在这里有反应所需要的分子，它们在局限的空间里 有效碰撞，完成转换。因此，如何构建一个人工的高效率反应单元是人类的 终极幻想，目前，胶束、囊泡甚至一些分子的自组装体系也逐渐成为化学反 应或生化反应的载体空间。但是这些纳米空间都是在溶液本体中大量存在， 对于具体每一个纳米或微米单元，并不完全清楚，也不能够获得真正意义上 的独立存在的纳米单元反应格。而在传统的单分子研究中一般依靠的技术手 段是溶液中的倍比稀释，然而，稀释本身就不均匀。也有文献报道采用微乳液滴作为单个分子的纳米反应器来提高反应的效率[Anna Musyanovych, Volker Mailander, Katharina Landfester, Biomacromolecules 2005， 6, 1824-1828],但是，这些方法都具有一定的局限性，它们都是以分散的各个 纳米空间构成了整体的反应效果。发明内容因此，本发明要解决的技术问题是提供一种低拷贝生化反应的方法，着 重于造就一个真正独立的纳米反应器，在这样一个局限的空间内可以完成所 需的生化反应。本发明人惊奇地发现由于扫描探针显微镜的纳米探针针尖在一定的湿 度下，探针针尖表面会自然形成一层水膜，从而在此水膜的支撑下，创造一 个类似于细胞单元的单独的纳米反应空间，反应分子囊括在针尖周遭的限定 区域，有效地增加反应物分子的碰撞几率，进而大大提高反应的效率。因此，本发明通过下列技术方案来解决上述技术问题。 一种低拷贝生化 反应的方法，其包括将低拷贞的反应物引入扫描探针显微镜的纳米探针针尖 上后进行反应。根据本发明，所有的反应都是承载在探针针尖的表面，虽然扫描探针显 微镜探针针尖部分不能用肉眼直接观察到，但作为整体存在的探针基底和悬 臂还是宏观可观察的。因而纳米针尖反应器的温度和湿度都可以宏观调控， 只要在探针针尖表面会自然形成一层水膜即可，所以操作简便。本发明优选常温常压的自然条件，如在室温(18-25°C)下，控制湿度在50%-90%范围 内进行反应。为便于操作，本发明优选在自动进针程序下，将低拷贝的反应物引入扫 描探针显微镜的纳米探针针尖上，具体来说，让扫描探针显微镜的纳米探针 针尖自动接触置于显微镜基底上的第一种反应物溶液，将低拷贝的第一种反 应物引入纳米探针针尖上，待针尖干燥后再以同样方式引入其余反应物。待将所有反应分子都引入到针尖上之后，修饰到针尖表面的各种分子在针尖表 面自然形成的水膜的作用下，都会汇聚到针尖的尖端部分，形成一个纳米区 域，完成反应。在自动进针程序下，探针会逐步下针，当纳米针尖接触下面 的溶液后会自动停止，犹如蘸笔动作，而探针针尖尺寸为纳米级，经计算， 如此方式修饰上去的分子数目较少(少于IOO个分子)，属于抵拷贝的生化 反应。由于DNA的连接反应便于观察和检测，本发明以DNA分子作为反应 物，以DNA连接反应为例来说明本发明的抵拷贝的生化反应。其中，DNA 连接反应体系的组成同常规反应体系类似。根据本发明，只要所采用探针针尖尺寸处于纳米级别， 一定湿度下，在 针尖表面自动形成的水膜支撑下，都可以造就一个纳米反应空间。由于任何 扫描探针显微镜探针都具备这一特点，所以任何扫描探针显微镜的各种类型 探针均可适用本发明。本发明选用原子力显微镜(AFM)为例来说明。扫描探针显微镜都是以微小的探针来"摸索"世界，不仅可以在原子水 平上探测物质形貌，而且以此为基础的单分子纳米操纵技术也发展起来了。 本发明巧妙地将扫描探针显微镜的探针针尖作为低拷贝生化反应的反应场 所，结合扫描探针显微术的优势，实现了低拷贝的生化反应。例如，可以有 效地实现低拷贝的DNA连接，而常规的依靠稀释方法进行的生化反应由于 少数分子具有较大空间的活动范围而不容易有效碰撞，进而反应效率较低， 通常反应容易失败。而采用本发明的方法，可以将DNA分子局限在纳米区 域，有效地增加了分子间的碰撞几率，解决了低拷贝DNA连接中连接效率 低的问题，而且重复性好，操作简单。本方法也可以有效地用于其他生化反 应的发生，结合纳米操纵技术，还可以进行单分子生化反应以及单分子检测 等面的研究。无疑本发明方法具有广阔的应用前景。
图1为本发明DNA连接体系I示意图。图2为本发明DNA连接体系I连接反应后的电泳图；其中，1:空白阴 性对照，2-7:本发明连接反应后的DNA (其中3为实施例1) ， 8:连接体 系的阳性对照，M:DL2000。图3本发明DNA连接体系II示意图。图4为本发明DNA连接体系II连接反应后的电泳图；其中，1:空白阴 性对照，2-5:本发明连接反应后的DNA (其中3为实施例5) ， 6:连接体 系的阳性对照，M:DL2000。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。 下列实施例中本发明扫描探针显微镜选用原子力显微镜，探针针尖型号 为NSC35。其中，实施例1-4为本发明DNA连接体系I ，其连接反应示意 图如图1所示，实施例5-10为本发明DNA连接体系n，其连接反应示意图 如图3所示。 实施例1将1|JL I5ng/|JL、 209bp的DNA (核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.l 所示)溶液放置在3-氨基丙基三乙氧基硅垸(AP)修饰的云母表面，在原 子力显微镜自动进针程序下逐步下针，当针尖接触溶液表面后，自动停止进 针，进行针尖表面的修饰，晾干后，再次修饰与之相匹配的lpL的lOng/pL 的50bp的DNA(核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示)、1|JL的T4 DNA 连接酶、11JL连接缓冲液以及7iJL水所组成的IOhL的混合体系，修饰方式 同上，然后，保持在室温和湿度为50%的条件下两个小时，最后取下针尖， 以连接后的DNA分子为模板进行PCR扩增，引物分别设计在两段DNA上 面(引物核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)， 电泳结果如图2所示，出现了目标条带U75bp)，连接成功。通过计算可知，如此修饰上去的209bp的DNA的分子数目少于60个，属于低拷贝的DNA 连接。实施例2将1IJL 5ng/iJL、209bp的DNA溶液放置在3-氨基丙基三乙氧基硅垸(AP) 修饰的云母表面，在原子力显微镜自动进针程序下逐步下针，接触溶液表面 后，自动停止进针，进行针尖表面的修饰，晾干后，再次修饰与之相匹配的 1|JL的Ing/|JL 50bpDNA、 l(jL的T4 DNA连接酶、lpL连接缓冲液以及7pL 水所组成的IO)JL的混合体系，修饰方式同上。然后，保持在室温和湿度为 50%的条件下两个小时，最后取下针尖，验证方法及结果同实施例1，连接 成功。通过估算，如此修饰上去的209bpDNA的分子数目少于20，属于低 拷贝的DNA连接。实施例3保持反应在室温和湿度为60%的条件下两个小时，余同实施例l，最后 取下针尖，验证方法及结果同实施例1，连接成功。保持反应在室温和湿度为60%的条件下两个小时，余同实施例2，最后 取下针尖，验证方法及结果同实施例1，连接成功。 实施例5将lpL 20ng/|jL、 341bp的DNA溶液放置在3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (AP)修饰的云母表面，在原子力显微镜自动进针程序下逐步下针，接触溶 液表面后，自动停止进针，进行针尖表面的修饰，晾干后，再次修饰与之相 匹配的1|JL的I0ng/(JL 50bpDNA、 I[JL的T4 DNA连接酶、lpL连接缓冲液 以及7iJL水所组成的混合体系，修饰方式同上。然后，保持在室温和湿度为 70%的条件下两个小时，最后取下针尖，以连接后的DNA分子(核苷酸序 列如序列表中SEQ ID No.5所示)为模板进行PCR扩增，引物分别设计在 两段DNA上面(引物核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.6禾QSEQ IDNo.7所示)，电泳结果如图4所示，出现目标条带(391bp)，表明连接成功。 通过估算，如此修饰上去的341bpDNA的分子数目少于60个，属于低拷贝 的DNA连接。 实施例6保持反应在室温和湿度为80%的条件下两个小时，余同实施例5，最后 取下针尖，验证方法及结果同实施例5，表明连接成功。 实施例7将1IJL 5ng/nL、341bp的DNA溶液放置在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(AP) 修饰的云母表面，在原子力显微镜的自动进针程序下逐步下针，接触溶液表 面后，自动停止进针，进行针尖表面的修饰，晾干后，再次修饰与之相匹配 的1|JL的2.5ng/|jL 50bp DNA、 lpL的T4 DNA连接酶、1|JL连接缓冲液以 及7ML水所组成的混合体系，修饰方式同上。然后，保持在室温和湿度为 90%的条件下两个小时，最后取下针尖，验证方法及结果同实施例5，表明 连接成功。通过估算，如此修饰上去的341bpDNA的分子数目少于15个， 属于低拷贝的DNA连接。实施例8将1|JL 5ng/lJL、341bp的DNA溶液放置在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(AP) 修饰的云母表面，在原子力显微镜下的自动进针程序下逐步下针，接触溶液 表面后，自动停止进针，进行针尖表面的修饰，晾干后，再次修饰与之相匹 配的I[JL的lng L 50bp的DNA、 I[JL的T4 DNA连接酶、1|JL连接缓冲液 以及7iJL水所组成的混合体系，修饰方式同上。然后，保持在室温和湿度为 80%的条件下两个小时，最后取下针尖，验证方法及结果同实施例5，结果 表明连接成功。实施例9保持反应在室温和湿度为60%的条件下两个小时，余同实施例8，最后 取下针尖，验证方法及结果同实施例5，表明连接成功。实施例10保持反应在室温和湿度为70%的条件下两个小时，余同实施例8，最后 取下针尖，验证方法及结果同实施例5，表明连接成功。序列表<110〉中国科学院上海应用物理研究所<120> —种低拷贝生化反应的方法<130> P4-071008N<160> 7<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 209<212〉 DNA <213>人工序列<400〉 1tcgaggtcga cggtatcgat aagcttgata tcgfuutcct gcagcccggg ggatcca.cta 60gttctagagg aaagcatccg tgggaagggc ctcactgaaa tggaagatac acctgacatg 120ctaagagcaa agaatgccac tcaaatcctc aatgagaaag aatataagcg agacctggaa 180ctggaagtca aaggaagagg cctgaatgc 209<210> 2<211> 50<212> DNA <213>人工序列<400> 2catgatcaga gtcgataatc gcctagtatc aggcttcaca atgacgatgc 50<210> 3<211> 19<212> DNA<213> Artificial(人工序列) <220><223〉 引物<400> 3aagggcctca ctgaaatgg 19<210> 4<211> 21<212> DNA<213> Artificial(人工序列) <220><223> 引物<400> 4gcatcgtcat tgtgaagcct g 21<210〉 5<211> 391<212〉 DNA <213〉人工序列<400〉 5gtc聊gtcgataatcgcctagtatcaggccgatgcccgagggccgtatg60cggcgaccgagttgccttgcccggcgtcBa.tacgggntaataccgcgccacatagcagaa120ctttaaaagtgctcatcattggaa犯cgttcttcggggcgaaaac t c t caaggatcttac180cgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgstcttcagcatctt240ttactttcaccagcgtttctgggtgagcaa aaacaggaag gc犯aatgcc300gaataagggcgaceicgga犯tgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaa360gcatttatcagggttattgtctcatgagcgg391<210> 6<211> 22<212> DNA<213> Artificial(人工序列) <220><223> 引物<400〉 6gtcagagtcg ataatcgcct ag 22<210> 7<211> 21<212〉 DNA<213> Artificial(人工序列) <220><223> 引物<400> 7ccgctcatga gacaataacc c 2权利要求
1. 一种低拷贝生化反应的方法，其包括将低拷贝的反应物引入扫描探针显微镜的纳米探针针尖上后进行反应。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的反应在室温及50%-90% 的湿度下进行。
3、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的将低拷贝的反应物引 入扫描探针显微镜的纳米探针针尖上包括下列步骤在自动进针程序下，让 扫描探针显微镜的纳米探针针尖接触置于显微镜基底上的第一种反应物溶 液，将低拷贝的第一种反应物引入纳米探针针尖上，待针尖干燥后再以同样 方式引入其余反应物。
4、 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的反应物为DNA分子， 所述的反应为DNA连接反应。
5、 如权利要求1 4任一项所述的方法，其特征在于所述的扫描探针显 微镜为原子力显微镜。
全文摘要
本发明公开了一种低拷贝生化反应的方法，其包括将低拷贝的反应物引入扫描探针显微镜的纳米探针针尖上后进行反应。本发明以纳米针尖为载体，以周遭的水膜为支撑，造就一个新型的纳米反应空间。在此局限的针尖表面区域，低拷贝反应物分子在如此小的限定空间里，大大增加了彼此之间的碰撞几率，从而提高了反应的效率。结合以扫描探针显微镜为基础的纳米操纵技术的发展，本发明方法可以用于单分子生化反应以及单分子检测等方面的研究，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/09GK101220356SQ20071003629
公开日2008年7月16日 申请日期2007年1月9日 优先权日2007年1月9日
发明者周化岚, 益 张, 钧 胡 申请人:中国科学院上海应用物理研究所