专利名称：细胞学定量测定抑制骨吸收药物生物活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定抑制骨吸收药物活性的方法，该方法具体涉及对破骨细胞抑制性药物的活性进行定量的测定。
背景技术：
骨质疏松是常见病与多发病，由于该病的发病率高、并发症较为严重、缺乏理想的预防和治疗措施，日益成为人们关注的焦点，随着老龄人群的增加，发病率亦呈上升趋势。
骨骼正常形态和功能的维持依赖于骨质合成和骨质吸收之间的动态平衡，各种类型骨质疏松的发病原因是不同的，但是基本病理改变却是相同的，即由于骨质吸收超过骨质合成从而造成全身性的骨质丢失。治疗骨质疏松的主要手段，一是促进骨矿化的药物，如维生素D及各种种类的钙制剂等；二是抗骨吸收的药物，如目前常用雌激素类药物替代疗法、双膦酸盐、降钙素等。随着骨质疏松发病率上升和人们对其危害性的关注，开发更安全有效的骨质疏松防治药物，成为目前十分活跃的研究领域之一，尤其是能够有效抑制破骨细胞作用减少骨质破坏的药物已成为当前主要的研究目标。如近期上市的降钙素和正在临床试验中的骨保护蛋白(Osteoprotegerin，OPG)、抗RANKL单抗denosumab等，均是通过抑制破骨细胞作用治疗骨质疏松的新药。
正常人体骨组织处在不停的骨重建中，骨重建是指去除骨骼局部旧骨代之以形成新骨的过程，是成熟骨组织的一种重要替换机制，是破骨细胞与成骨细胞一个成对的、相偶联的细胞活动过程，骨质疏松症的主要发病机制是机体的骨重建失衡，破骨细胞的作用在其中起到至关重要的角色。破骨细胞来源于血液单核细胞，进入骨组织后在骨髓基质细胞分泌的诱导分化因子作用下分化成熟为破骨细胞。破骨细胞的功能为骨吸收，它可以像挖掘机一样在骨表面向四周溶解骨组织。破骨细胞骨吸收主要靠二种作用，一是其与骨基质呈刷状接触的皱折缘释放酸性物质，将骨表面的钙磷等无机盐溶解；二是与骨基质相连的清亮区将待吸收的骨包围起来，在褶皱缘释放溶酶体酶的配合下，将骨有机基质降解。破骨细胞溶酶体包含的酶重要有组织蛋白酶、基质金属酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和酸性磷酸酶。这些酶是破骨细胞功能所必须的酶，同时也是破骨细胞的特征，可以用来测定破骨细胞活性。
抗骨吸收药物可以在破骨细胞及其前体细胞膜表面阻断活化诱导因子与受体的结合，或通过抑制破骨细胞的正常生理代谢，抑制破骨细胞的形成或抑制破骨细胞活性来发挥作用的。这类药物既可能抑制破骨细胞前体细胞或破骨细胞生长，也可能是抑制破骨细胞发挥生物功能所需要酶的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种用细胞学定量测定抑制骨吸收药物生物活性的方法。
本发明的目的可以通过以下措施来达到1.建立体外诱导培养破骨细胞的方法或者并由此方法诱导培养出成熟的破骨细胞；2.在诱导培养体系或培养体系中加入不同浓度的药物；3.细胞生长状态或细胞活性功能状态测定；4.待测药物生物活性单位的计算。
细胞生长状态及活性功能状态的测定方法，可以为MTS[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，inner salt]法、MTT(diMethylThiazol-diphenyl Tetrazolium bromide)法、CCK8(Cell Counting Kit-8)法、XTT(2，3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)法、台芬兰染色法及组织蛋白酶、基质金属酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶，抗酒石酸酸性磷酸酶底物反应显色法。并以IC50(50％ inhibitary concentration)值计算活性单位。药物是以抑制破骨细胞产生及成熟破骨细胞活性功能为主的药品，如雌激素类药物、双膦酸盐类药物、降钙素药物及骨保护素等等。
这类药物既可能抑制破骨细胞前体细胞或破骨细胞生长，也可能是抑制破骨细胞发挥生物功能所需要酶的活性。我们分别做了“药物对破骨前体细胞分化为破骨细胞抑制作用的测定”和“药物对成熟破骨细胞活性抑制作用的测定”试验。具体的实验方法如下；
一药物对破骨前体细胞分化为破骨细胞抑制作用的测定1建立体外诱导培养破骨细胞的方法在体外诱导培养破骨细胞的前体细胞RAW264.7，在诱导培养体系中加入诱导剂1，25(OH)2VitD3(1，25-dihydroxyvitamin D3)，1，25(OH)2VitD3的终浓度为10E6-10E9M，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色与骨膜片骨陷窝形成来鉴定破骨细胞诱导培养成功。
2在诱导培养体系中加入不同浓度的药物对细胞进行分组。对照组不加药物，药物组在诱导混合培养的同时加入不同浓度的药物，用于评价药物对破骨前体细胞分化的抑制作用。具体分组如下1)诱导剂对照组单纯诱导剂作用的Raw264.7诱导培养2)药物组诱导剂作用的Raw264.7诱导培养+按一定比例稀释的药物(药物与诱导剂同时加入)3细胞状态测定利用细胞生长状态和存活状态测定方法如MTT法、MTS法，台芬兰染色、CCK-8，XTT等方法，检测药物对破骨前体细胞分化与生长的影响。也可以用破骨细胞特定酶活性的方法如选用酸性磷酸酶底物对-硝基酚磷酸酯(NPP)，测定各组细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。
4活性单位的计算药物的抑制率(％)＝(诱导剂对照组的测定值-药物组的测定值)*100/诱导剂对照组的测定值。将所获得的抑制率为纵坐标，以相应的浓度的对数为横坐标作图，将实验数据线形回归处理，计算药物的IC50，以IC50计算活性单位。
二药物对成熟破骨细胞活性抑制作用的测定1诱导培养出成熟的破骨细胞用1，25(OH)2VitD3在体外诱导培养破骨前体细胞RAW264.7，诱导出成熟破骨细胞，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色与骨膜片骨陷窝形成来鉴定破骨细胞诱导培养成功。
2在培养体系中加入不同浓度的药物对细胞进行分组。对照组不加药物，药物组在诱导培养出成熟破骨细胞后加入不同浓度的药物，用于评价药物对破骨细胞活性的抑制作用。具体分组如下1)诱导剂对照组单纯诱导剂作用的Raw264.7诱导培养2)药物组诱导剂作用的Raw264.7诱导培养出成熟破骨细胞+按一定比例稀释的药物3细胞状态测定和活性单位的计算方法同上。
本发明方法可以对破骨细胞抑制性药物的活性进行定量测定，具有精确、可靠、方便、经济和简单可行等特点。可用于筛选新的化合物，确定其是否具有抑制破骨细胞活性并进而推断是否可以治疗骨质疏松候选药物。
图1为实施例1OPG抑制破骨细胞前体细胞RAW264-7生物活性的定量测定(MTS法)的实验结果图2为实施例2 rhOPG-Fc抑制破骨细胞前体细胞生物学活性的定量测定(抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定法)的实验结果图3为实施例3rhOPG-Fc抑制成熟破骨细胞生物学活性的定量测定(抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定法)的实验结果具体实施方式
实施例1OPG抑制破骨细胞前体细胞RAW264-7生物活性的定量测定(MTS法)骨组织血液单核细胞在骨髓基质细胞分泌的诱导分化因子作用下分化为成熟破骨细胞。局部诱导破骨前体细胞的因子中，以RANKL-RANK系统最为关键。骨髓基质细胞分泌细胞核因子-κB受体活化因子配基(receptor activator ofNFKB ligand，RANKL)，RANKL与破骨细胞系细胞表面的细胞核因子-κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)结合。RANKL一旦与RANK结合就会刺激前体破骨细胞分化，及活化成熟的破骨细胞，引起骨吸收。OPG是一种RANK诱饵受体，其作用是结合或中和可溶性RANKL，从而阻断RANKL与功能性受体RANK的结合。因此OPG相当于整个RANKL系统的制动器，抑制了RANKL-RANK系统的作用，从而抑制破骨细胞分化及活化。RANKL-RANK-OPG形成完整的骨代谢调控系统，调节骨组织的代谢平衡。
OPG是在1997年分别被美国和日本的两个研究组同期发现的，成熟蛋白质是含有380个氨基酸的一种分泌型糖蛋白，其生物活性功能片段为N端的第1-4结构域，即第22-201位氨基酸的部分。基于对OPG/RANKL/RANK系统的认识和OPG作用的明确，作为一种治疗以过度骨吸收为特征疾病，如多发性骨髓瘤、肿瘤骨转移、绝经后骨质疏松症、激素引起的骨质疏松等，OPG的药用价值日益引起人们的关注。我们利用毕赤酵母表达系统，表达制备了OPG的22-201位氨基酸功能片断与人IgGlFc片段的OPG-Fc融合蛋白，并在细胞和动物模型实验中观察到明显地抑制破骨细胞活性和抗骨质疏松作用，为了方便、快速、定量的测定OPG-Fc融合蛋白的生物活性，我们采用以上描述的破骨细胞抑制实验和酶促底物分解显色的比色测定，建立了OPG-Fc融合蛋白生物活性定量方法。
利用MTS法检测OPG对RAW264-7分化的影响作用，比较不同剂量和时间点的差异，具体方法如下1.RAW264-7细胞的诱导培养取96孔板，每孔混合接种破骨细胞前体细胞RAW264-7细胞1000个及骨髓瘤细胞Sp2/0细胞5000个，每孔加入破骨细胞诱导分化液，即DMEM完全培养基中加入地塞米松和1，25-(OH)2VitD3，终浓度分别为1×10-7mol/L和2×10-8mol/L。共种三块板，每块板上的A1孔只加入DMEM完全培养基，作为MTS测定时的空白对照孔。
同时平行接种另外一块96孔板，用作鉴定破骨细胞诱导培养是否成功。鉴定的方法采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色与骨膜片骨陷窝形成实验。
2、实验分组将96孔板破骨细胞混合培养体系分成9组，每组三个复孔。分别加入不同浓度的rhOPG-Fc，浓度为200ug/L，20ug/l，2ug/l，200ng/l，20ng/l，2ng/l，0.2ng/l，0.02ng/l，Ong/l(对照组)，细胞于37℃，5％CO2继续培养。
3、MTS法测定实验组加入rhOPG-Fc蛋白后，取一块培养板，加入20μl的MTS工作液，37℃，5％CO2培养4h后，置酶联检测仪上测定光密度(OD)值，检测波长490nm。分别在96小时和120小时再进行两次MTS测定。
4.结果破骨细胞诱导培养鉴定结果加入诱导剂的混合培养体系中，与单纯混合培养不加诱导剂对照组相比，96小时后TRAP染色阳性，骨膜片骨陷窝形成。证实诱导培养成功。
MTS实验结果见图1。
结果显示，rhOPG-Fc的浓度低于0.02ug/L对破骨细胞前体细胞基本没有什么抑制作用，高于0.02ug/L对破骨细胞前体细胞出现抑制作用，用作图法可以计算出rhOPG-Fc抑制RAW264-7分化的IC50为20ug/L。
以rhOPG-Fc IC50为50ug/L计算，rhOPG-Fc生物活性为5×10E4 U/g(一般标示为50U/mg)。
实施例2rhOPG-Fc抑制破骨细胞前体细胞生物学活性的定量测定(抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定法)1.破骨细胞的诱导培养取24孔板，每孔混合接种破骨细胞前体细胞RAW264-7细胞4000个及骨髓瘤细胞Sp2/0细胞20000个，每孔加入破骨细胞诱导分化液即DMEM完全培养基中加入地塞米松和1，25-(OH)2VitD3，最终浓度分别为1×10-7mol/L和2×10-8mol/L。共种一块板。
同时平行接种另外一块24孔板，用作鉴定破骨细胞诱导培养是否成功。鉴定的方法采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色与骨膜片骨陷窝形成实验培养96小时后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，破骨细胞胞浆呈现玫瑰红色，胞质内存在红色阳性颗粒，核数众多。同时电镜下观察骨膜片骨陷窝形成，证实破骨细胞诱导培养成功。
2.实验分组将24孔板上的破骨细胞分六组，每组三个复孔，混合培养的同时分别加入不同浓度的rhOPG-Fc，浓度分别为0.0001mg/L，0.001mg/L，0.01mg/L，0.1mg/L，1mg/L，10mg/L。
3.抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测120小时后，检测破骨细胞内抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。将培养上清弃去，用PBS冲洗两次，加入细胞裂解液，每孔150ul，冰上孵育25分钟，用细胞铲将细胞刮下，转移到微量离心管内，10000g，10min离心。收集上清。取100ul，加入抗酒石酸酸性磷酸酶的底物对-硝基酚磷酸酯(NPP)，室温孵育15-30分钟，置于酶标仪上检测光密度值(OD值)，测量波长405nm。
4.结果见图2。
结果显示，rhOPG-Fc对破骨细胞的分化有明显的抑制作用，通过作图法可以计算出其IC50为0.02mg/L，其活性单位为5×10E4 U/g(一般标示为50U/mg)实施例3rhOPG-Fc抑制成熟破骨细胞生物学活性的定量测定。
1.破骨细胞的诱导培养取24孔板，每孔混合接种破骨细胞前体细胞RAW264-7细胞4000个及骨髓瘤细胞Sp2/0细胞20000个，每孔加入破骨细胞诱导分化液即DMEM完全培养基中加入地塞米松和1，25-(OH)2VitD3，最终浓度分别为1×10-7mol/L和2×10-8mol/L。共种一块板。
同时平行接种另外一块24孔板，用作鉴定破骨细胞诱导培养是否成功。鉴定的方法采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色与骨膜片骨陷窝形成实验培养96小时后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，破骨细胞胞浆呈现玫瑰红色，胞质内存在红色阳性颗粒，核数众多。同时电镜下观察骨膜片骨陷窝形成，证实破骨细胞诱导培养成功。
2.实验分组破骨细胞诱导培养成功后，将24孔板上的破骨细胞分八组，每组三个复孔每组分别加入不同浓度的rhOPG-Fc，浓度分别为0.0125mg/L，0.025mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L，0.8mg/L。
3.抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测加入rhOPG-Fc24小时后，检测破骨细胞内抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。将培养上清弃去，用PBS冲洗两次，加入细胞裂解液，冰上孵育25分钟，用细胞铲将细胞刮下，转移到微量离心管内，10000g，10min离心。收集上清。取100ul，加入抗酒石酸酸性磷酸酶的底物对-硝基酚磷酸酯(NPP)，室温孵育15-30分钟，置于酶标仪上检测光密度值(OD值)，测量波长405nm。
4.结果见图3。
结果显示，rhOPG-Fc对成熟破骨细胞的功能有明显的抑制作用，通过作图法可以计算出其IC50为0.18mg/L，其活性单位为5.5×10E3 U/g(一般标示为5.5U/mg)。
OPG作用于破骨细胞生成与成熟以及成熟后发挥破骨作用的多个环节，rhOPG-Fc抑制破骨细胞治疗骨质疏松及骨坏死是其多种作用的综合体现，在用上述多种方法测定其抑制破骨细胞功能的活性定量试验中发现，OPG对不同环节作用的活性单位是有差异的，由此我们推测OPG对破骨作用的多个环节的作用能力有所不同，例如rhOPG-Fc对破骨细胞诱导分化的抑制活性为50U/mg，对成熟破骨细胞功能抑制的活性为5.5U/mg，并由此可以判断OPG的主要作用机理在于破骨细胞诱导分化的抑制，而对成熟破骨细胞功能抑制的作用机制位于其次。
权利要求
1.一种测定药物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于所述的方法包括A.建立体外诱导培养破骨细胞的方法或者用该方法诱导培养出成熟的破骨细胞；B.在诱导培养体系或培养体系中加入不同浓度的药物；C.破骨细胞生长状态或细胞活性功能状态测定；D.待测药物生物活性单位的计算。
2.如权利要求1所述的测定药物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于细胞状态测定方法为MTS法、MTT法，台芬兰染色、CCK-8法、XTT法及抗酒石酸酸性磷酸酶底物反应显色法，并以IC50值计算活性单位。
3.如权利要求1所述的测定药物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于所述药物为抑制破骨细胞诱导分化成熟或/和抑制成熟破骨细胞功能活性的药物。
4.如权利要求1所述的测定药物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于所述的生物活性单位计算是以IC50作为一个活性单位。
5.如权利要求1所述的测定药物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于该方法用于对细胞不同阶段的测定中，在诱导培养体系或培养体系中加入药物，通过药物对不同阶段细胞抑制能力的活性单位比较，可研究药物的作用环节和机制。
全文摘要
本发明涉及一种测定抑制骨吸收药物活性的方法，该方法具体涉及对破骨细胞抑制性药物的活性进行定量的测定。主要步骤为1.建立体外诱导培养破骨细胞的方法或者并由此方法诱导培养出成熟的破骨细胞；2.在诱导培养体系或培养体系中加入不同浓度的药物；3.细胞生长状态或细胞活性功能状态测定；4.待测药物生物活性单位的计算。本发明方法可以对破骨细胞抑制性药物的活性进行定量测定，具有精确、可靠、方便、经济和简单可行等特点。可用于筛选新的化合物，确定其是否具有抑制破骨细胞活性并进而推断是否可以治疗骨质疏松候选药物。
文档编号C12N5/08GK101020920SQ20071003825
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月21日 优先权日2007年3月21日
发明者杨子义, 迟志永, 高景燕, 张晴妮, 徐骥, 朱闪 申请人:上海富纯中南生物技术有限公司