专利名称：一种基于人重组凝血活酶的液体型pt试剂的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及到液体型PT试剂的制备方法，该方法还包括PT 试剂的主要组成部分，人重组凝血活酶在酵母细胞中的表达和纯化。
背景技术：
凝血酶原时间(PT)是检查外源性凝血因子的一种过筛试验，自1935年此测定方法 创建以来，迄今它仍然是检查外源凝血系统诸因子及相关抑制物的重要筛选试验，是目前 口服抗凝剂治疗的主要监测手段，也是外科手术前病人凝血功能的一项重要检査指标。PT测定受多种条件的影响，其临床检测的标准化问题日益突出，由于采用不同来源 的组织凝血活酶试剂，可使同一标本测定出的凝血酶原时间及其与正常对照的比值相差很 大，致使结果失去科学性。为了使同一份标本用各种不同的凝血活酶试剂检测出的PT结 果具有可比性，国际血液学标准化委员会(ICSH)和国际血栓与止血委员会(ICTH)推荐 将国际标准化比率(international normalizedratio， INR)作为PT的报告方式，商品 化PT试剂需要提供其国际敏感指数(International Sensi,tivity Index, ISI)值，1996 年美国的NCCLS也发表了编号为H47-A的有关PT测定规范化的文件。PT试剂的质量是影响PT测定标准化的关键因素，长期以来，试剂中的主要组成成 分，凝血活酶多是从兔脑组织中提取而来，如Instrumentation laboratory、 Diagnostia Stago、 上海太阳、陕西方舟等公司的PT试剂，也有的来源于人胎盘，如Dade Behring公司的 PT试剂，而且，为了确保试剂的稳定性，都制成冻干品，需要复溶，不能避免各实验室 水质量问题或体积误差给测定结果带来的偏差。由于组织提取物中所含的凝血活酶浓度不 同，对抗凝药物所致凝血因子缺乏的反应敏感度也就不同，所以生产的PT试剂普遍存在 产品质量不稳定、敏感性差的问题，致使检测结果不稳定，不同的临床检验实验室之间测 得的结果难以比较，尽管采用WHO标准参照品，但仍难以把误差降低到可接受的水平。减小实验室间测定差异的一种有效方法是统一凝血活酶的生物结构和蛋白组成，人源 重组型的凝血活酶分子结构稳定、蛋白均一，更重要的是，以其为原料制成的PT试剂对 凝血因子具有极高的敏感性，研究表明，重组凝血活酶对维生素K依赖的因子的微小缺乏 具有极高的敏感性，尤其对因子II、 VH的缺乏非常敏感，它能放大因子的微小缺乏造成的 PT结果差异，而且准确性好，从而可提高PT试剂的质量，因此是临床检验上的新一代标准 化试剂。目前，涉及到利用人重组凝血活酶制备PT试剂的专利中，凝血活酶都来自于大肠杆 菌的表达，且非全长蛋白，已有研究证实，其活性不及完整凝血活酶分子。与大肠杆菌相 比，酵母非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、正 确修饰与折叠的不足。如复旦大学的发明专利"重组可洛性组织因子及其制备方法和应用"提供了凝血活酶可溶性胞外部分在大肠杆菌JF1125中的表达方法，过程繁琐，产物均一 性和活性都不够理想，这就是因为在大肠杆菌中表达的蛋白质不能进行正确的折叠从而以 包涵体的形式存在；太原博奥特生物技术有限公司的发明专利"人重组组织因子的构建表 达、纯化方法及其应用"提供了缺失胞内区的截断型凝血活酶在大肠杆菌MM294中的表 达方法，也是因为大肠杆菌中难以表达具有完全活性的完整复杂蛋白质分子，发酵物需经 高压匀浆、离子交换和抗体免疫亲和层析等步骤获得产物。美国生命扫描有限公司在中国 申请的专利"一种基于组织因子的凝血酶原时间试剂的制备方法"中提供了凝血活酶/磷 脂泡囊混合物的制备方法，该方法还需要另外筛选用于去除混合物中去污剂成分的树脂， 然后再过滤除去树脂，过程不够简便，最终制成的PT试剂是包被于试纸条上对血液样本 实现检测的。发明内容(一) 发明目的本发明的目的是提供一种在真核细胞甲醇酵母中表达完整凝血活酶分子的方法，进而 制备高稳定性的液体型PT试剂，最终目的是将应用该方法制成的检测试剂在临床检验上 广泛应用，使PT检验实现标准化。(二) 发明的优势本发明中表达的人凝血活酶来自于真核细胞，无包涵体形成，不需对蛋白进行变性和 复性，蛋白分子结构完整，只需一步纯化即可获得高纯度、.高活性的凝血活酶；基于该凝 血活酶的液体型PT试剂的制备在临床应用中的优势具体表现在使用方便，不需复溶， 避免各实验室使用蒸馏水不同，复溶体积不准确而造成的测定偏差，且稳定性强，开瓶后 37'C能稳定30天以上，既避免了因剩余试剂忘记放回冰箱而造成的测值变化，又有利于 夏季的高温运输。(三) 发明内容详述本发明包括重组质粒的构建，酶分子的诱导表达与纯化，和液体型PT的制备。 从人胎盘组织中获取总RNA，根据GeneBank中人凝血活酶分子的核苷酸序列设计 带有6个组氨酸标签、酶切位点以及终止密码子的PCR引物，通过RT-PCR方法获得人 凝血活酶基因。将此基因与酵母表达质粒pPIC9连接，得到重组表达质粒。重组质粒经Sal I线性化后采用电穿孔方法转化入酵母细胞GS115，首先在MD平板 上筛选含有外源基因的表达菌株，将其转入液体培养，以甲醇诱导表达外源蛋白。高表达 菌株的筛选首先采用immunodotblot方法， 一抗为本公司生产的鼠抗人p32， 二抗为本公 司生产的anti-p32HRP，经TBST禾B TBS洗涤后，DAB显色(显色底物为本公司生产)， 根据PVDF膜上的印迹选择出外源蛋白表达量高的部分克隆。而后结合凝血活酶活性测定 方法筛选出高表达菌株。菌生长用BMGY培养基，由1%酵母提取物、2%蛋白胨、1%甘 油、3g/L K2HP04、 11.8 g/L KH2P04、 1.34%YNB和4xlO、Biotin组成，24小时后换成 BMMY培养基，由P/。酵母提取物、2o/。蛋白胨、3g/LK2HP04、11.8 g/L KH2P04、 1.34°/。YNB、 4xlO、Biotin和0.5%甲醇组成，在48小时后补入3%甲醇，72小时后收获菌体，破碎细 胞释放出其中的凝血活酶。蛋白的纯化是利用表达蛋白连接的组氨酸标签，直接将上述粗提液进行镍柱层析，采用pH7.4含0.5mol/LNaCl的0.02 mol/L磷酸钠缓冲液、含0.3 mol/L 咪唑的上述缓冲液分步洗脱，最后用含0.5mol/L咪唑的上述缓冲液洗柱，收集蛋白，使 用紫外分光光度计测定吸光值测蛋白浓度，用SDS-PAGE方法鉴定蛋白纯度，结果，经 上述层析后可获得纯度达95%以上的人凝血活酶。将获得的凝血活酶溶液进行透析，以除去其中所含的咪唑并进行稀释，而后与含有磷 脂(Sigma公司产品)的pH7.4 10mmol/L的Tris-Cl按比例混合，再加入PTF-G溶液(本 公司设计)，混合均匀，制成液体型PT试剂。经测定，本发明方法生产的试剂PT时间10.7-14.3s， ISI值为l.O土O. 1，重复实验的 变异系数不超过5%，批间差的变异系数不超过8%，试剂在2-8'C稳定期长于24个月， 开瓶后37'C仍稳定30天以上。
具体实施方式
实施例1重组质粒的构建与表达从人胎盘组织中获取总RNA，根据GeneBank中coagulation factor III的核苷酸序列(图 l)设计PCR上游引物MF3和下游引物MR2:MF3: 5、- CCGCTCGAGAAAAGATCAGGCACTACAAATACTGCGGC -3、 MR2:5、- GGCCTAGGTCAATGATGATGATGATGATGTGAAACATTCAGTGGGGA-3' MF3引物含有人凝血活酶C端数个氨基酸、Xhol酶切保护基和Xhol酶切位点，MR2 含有人凝血活酶N端数个氨基酸、AvrII酶切位点、终止子密码和6个His密码子。以总RNA为模板，通过RT-PCR方法获得人凝血活酶基因。将此基因用上述两个内 切酶进行处理，然后连接到质粒pPIC9上，得到重组表达质粒(图2)。重组质粒经线性化后转化酵母GS115，使用MIX平板初筛，PCR方法复筛，根据琼 脂糖凝胶电泳中的目的条带挑选外源基因拷贝数多的单克隆，转入液体培养基，甲醇诱导 表达外源蛋白。然后采用immunodotblot方法鉴定目的蛋白， 一抗为本公司生产的鼠抗人 p32， 二抗为本公司生产的anti-p32HRP，经TBST禾13 TBS洗涤后，DAB显色(显色底物 为本公司生产)，根据PVDF膜上的印迹选择出外源蛋白表达量高的部分克隆。最后结合 凝血活酶活性测定方法筛选出高表达克隆。实施例2人凝血活酶的纯化常规方法培养筛选出的高表达株，在48小时时补加3%甲醇以诱导外源蛋白。为避免 培养液成分对纯化步骤的影响，简化纯化流程，外源蛋白设计成胞内表达。离心收集菌体， 用含5%甘油和lmmol/L PMSF的pH7. 4 50mmol/L磷酸钠缓冲液洗去残留的培养液。高压 匀浆破碎细胞，然后离心收集含目的蛋白的上清液，直接用Ni-NTA Agarose柱层析方法 纯化目的蛋白。所用平衡液为含0. 5mol/LNaCl的pH7. 4 0. 02mol/L磷酸钠缓冲液(Buffer B)，分步洗脱，上样后依次用Buffer B、含0.3 mol/L咪唑的Buffer B洗去杂蛋白，最 后用含0.5 mol/L咪唑的Buffer B洗脱收集目的蛋白。此过程中上样需要控制流速在 lml/min以下，以利于目的蛋白的充分结合。Ni-NTA Agarose层析柱清洗后可多次反复利用。蛋白浓度通过紫外分光光度计测定样品稀释液的280nm和260nm吸光值来计算，蛋 白纯度通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，Pharmacia Inagemaster VDS扫描来确定。实施例3 PT试剂盒的制备1. PT试剂盒的组成成分磷脂化人凝血活酶(1%)，缓冲剂和稳定剂(PTF-G).2. PTF隱G配方40mmol/LTris-HCl， pH7.0糖胶，终浓度4% 聚乙烯二醇，终浓度0.5% CaCl2，终浓度llmmoI/L, NaCl ，终浓度30mmol/L， 甘露醇，终浓度2% 叠氮钠，终浓度0.1% 明胶，终浓度0.25%3. 检测方法PT试剂37。C预热20分钟，取100W，待测血浆37。C孵育3分钟，取5(^1，混匀后计时，使用Sysmex公司的CA-530血凝仪测定，记录血浆凝固时间。4. 产品技术指标1) 外观无色透明液体。2) PT测量正常值范围10.7 14.3秒。3) ISI值l.O土O. 05。 -4) 精密度检测连续小量生产三批试剂盒，每批随机抽取6瓶测定其PT，每瓶做10个重复，对测验结果所做分析见下表S为标准偏差，X为平均值，误差CV-S/X。批号均值(s) X标准偏差 S误差 cv06081612. 230.181.5%瓶060910」11. 760.141.2%内06101912.70.110.9%12.20.3953.2%批 间5)敏感性检测包括肝素敏感性和乏因子血浆敏感性试验。随机抽取本发明制备的PT试剂一盒，分别对不同浓度肝素血浆进行PT测试，对 照试剂购自DadeBerhing公司，测定结果统计学分析表明，本发明制备的试剂与Dade Berhing PT试剂对肝素化血浆测定有很好的相关性，Y =0.984。采用美国Fisher公司乏因子血浆(V、 VD、 VII、 IX、 X、 XI)，活性均小于1%， 分别用DADE试剂和本发明制备的试剂对每种乏因子血浆进行PT测定，测定本发明试 剂与Dade Berhing PT试剂对乏因子血浆测定有较好相关性，经统计学分析Y = 0. 986，6说明对缺乏因子血浆测定两试剂有很好的相关性。6)稳定性检测包括开封后稳定性、模拟运输条件稳定性、未开封加速破坏试验、 长时稳定性试验(含批间差及重现性分析)。开封后稳定性实验结果显示，60天之内正常质控血浆测值在正常值范围内， 且变化不大，异常质控血浆偏差在5%以内，开封后置于25'C， 37'C条件下稳定 30天以上，好于进口试剂。高温运输条件下，IO天之内正常质控血浆测值在正常值范围内；异常质控血 浆偏差在5%以内，与进口试剂相当。37'C加速破坏条件下，正常质控血浆测值在2个月保持基本稳定，处于正常 值范围；异常质控血桨测值变化趋势与正常质控血浆基本相同，因此在37'C加速 破坏条件下，本试剂可以稳定2个月以上，与进口试剂稳定性具有可比性。在4。C条件下产品贮存24个月时三批试剂的PT值一直稳定处于正常范围内， 对24个月数据进行重现性和批间差分析，4t条件下产品贮存同样时间后(24个 月内)其批间差变异系数在0.5%-2.9%之间，符合标准条款PT试剂盒批间差变 异系数不应超过8%的要求；其三批试剂的重现性分别为1.1%、 0.8%和0.8%， 符合标准条款PT试剂盒重现性的变异系数不应超过5X的要求。4'C条件下产品贮 存24个月内，异常质控血浆测值偏差在2%以内，低于5%，所以在产品贮存稳定 期长于24个月。
图1:人凝血活酶核苷酸序列和氨基酸序列 图2:重组pPIC9-TF表达质粒图对以上各技术指标的考察结果证明，本发明方法生产的试剂盒操作简单、使用方便、 敏感性好，稳定性强，与国外试剂盒具有可比性'适合临床应用'可作为新一代标准化PT试剂替代进口试剂。人凝血活酶核苷酸序列和氨基酸序列:TCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATTTAACTTGGAAASerGlyThrThrAsnThrValAlaAlaTyrAsnLeuThrTrpLysTCAACTAATTTCAAGACAATTTTGGAGTGGGAACCCAAACCCGTCSerThrAsnPheLysThrlieLeuGluTrpGluProLysProValAATCAAGTCTACACTGTTCAAATAAGCACTAAGTCAGGAGATTGGAsnGinValTyrThrValGluIleSerThrLysSerGlyAspTrpAAAAGCAAATGCTTTTACACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCLysSerLysLysPheTyrThrThrAspThrGluCysAspLeuThrGACGAGATTGTGAAGGATGTGAAGCAGACGTACTTGGCACGGGTCAspGlulieValLysAspValLysGinThrTyrLeuAlaArgValTTCTCCTACCCGGCAGGGAATGTGGAGAGCACCGGTTCTGCTGGGPheSerTyrProAlaGlyAsnValGluSerThrGlySerAlaGlyGAGCCTCTGTATGAGAACTCCCCAGAGTTCACACCTTACCTGGAGGluProLeuTyrGluAsnSerProGluPheThrProTyrLeuGluACAAACCTCGGACAGCCAACAATTCAGAGTTTTGAACAGGTGGGAThrAsnLeuGlyGinProThrlieGinSerPheGluGlvValGlyACAAAAGTGAATGTGACCGTAGAAGATGAACGGACTmGTCAGAThrLysValAsnValThrValGluAspGlu.ArgThrLeuValArgAGGAACAACACTTTCCTAAGCCTCCGGGATGTTTTTGGCAAGGACArgAsnAsnThrPheLeuSerLeuArg.AspValPheGlyLysAspTTAATTTATACACTTTATTATTGGAAA'TCTTCAAGTTCAGGAAAGLeulieTyrThrLeuTyrTyrTrpLysSerSerSerSerGlyLysAAAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTGATTGATGTGGATLysThrAlaLysThrAsnThrAsnGluPheLeuIleAspValAspMAGGAGAAAACTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGATTCCCTCCLysGlyGluAsnTyrCysPheSerValGinAlaVallieProSerCGAACAGTTAACCGGAAGAGTACAGACAGCCCGGTAGAGTGTATGArgthrvalasnarglysS6rthraspserprovalglucysmetGGCCAGGAGAAAGGGGAATTCAGAGAAATATTCTACATCATTGGAGlyginglulysglygluphesrggluilephetyrileileglyGCTGTGGTATTTGTGGTCATCATCCTTGTCATCATCCTGGCTATAAlavalvalpheVEllvalileileleuvalileileleualaileTCTCTACACAAGTGTAGAAAGGCAGGAGTGGGGCAGAGCTGGAAGSerLeuHisLysCysArgLysAlaGlyValGlyGinSerTrpLysGAGAACTCCCCACTGAATGTTTCAGluAsnSerProLeuAsnValSer
权利要求
1.人重组凝血活酶的构建表达方法，其特征是从人胎盘组织获取RNA，通过PCR方法得到人凝血活酶基因，将其与酵母表达质粒重组，线性化后转化甲醇酵母GS115，筛选获得稳定高表达基因工程菌株，经发酵诱导，得到含人凝血活酶的菌体。
2. 权力要求1所述人重组凝血活酶的构建表达-方法，其特征是表达的重组凝血活酶包括胞外 区、跨膜区和胞内区。
3. 权力要求1所述人重组凝血活酶的构建表达方法，其特征是所述载体不限于特定的酵母表 达载体，只要可以与人凝血活酶cDNA连接，形成表达质粒。
4. 权力要求1所述人重组凝血活酶的构建表达方法，其特征是所述宿主细胞不局限于某种特 定的酵母细胞，只要能够适合表达所述重组载体。
5. 权力要求1所述人重组凝血活酶的构建表达方法，其特征是高表达菌株的筛选方法为 immunodot blot， 一抗为鼠抗人p32， 二抗为anti-p32 HRP，经TBST和TBS洗涤后 DAB显色，印迹的强弱可反映蛋白的表达量。
6. 权力要求1所述人重组凝血活酶的构建表达方法，其特征是菌株表达的人重组凝血活酶由 甲醇诱导产生。
7. 权力要求2所述人重组凝血活酶，其纯化方法是Ni-NTA Agarose柱层析，特征是层析柱 平衡液为含0.5mol/LNaCl的pH7.4 0.02mol/L磷酸钠缓冲液(Buffer B)，分步洗脱， 上样后依次用Buffer B、含0.3 mol/L咪唑的Buffer B洗去杂蛋白，最后用含0.5 mol/L 咪唑的Buffer B洗脱收集目的蛋白。
8. —种新型PT试剂盒，其特征是人重组凝血活酶经脂化后，'与缓冲剂和稳定剂混合制成液 体产品。
9. 权力要求8所述的PT试剂盒，其特征是缓冲剂和f定剂由4%糖胶，0.5%聚乙烯二醇， llmmol/LCaCl2， 30mmol/LNaCl ， 2%甘露醇，0.1%叠氮钠，0.25%明胶组成。
全文摘要
本发明属生物技术领域，发明的目的在于解决PT测定的临床标准化问题。PT试剂的质量是PT实验的关键影响因素，减少各实验室测定结果差异的一种有效方法是统一试剂中凝血活酶的化学组成和生化特性，采用基因工程方法制备的重组凝血活酶分子结构稳定、蛋白均一，可以提高实验的敏感度、精密度、准确度。本发明应用酵母细胞表达全长人凝血活酶，一步纯化即可获得高纯度、高活性的目的蛋白，发明中还提供了基于重组型凝血活酶制备液体型PT试剂的方法，该试剂具有良好的敏感性和稳定性，各项技术指标均合格，经实验证实适合临床使用。
文档编号C12N1/19GK101294163SQ20071003979
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月23日 优先权日2007年4月23日
发明者肖国伟 申请人:上海长岛生物技术有限公司