专利名称:香菇野生43菌种的分子特异标记及方法与应用的制作方法
技术领域:
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种香菇野生43菌种的分子特异标记及其获得方法与应用。
背景技术:
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨,占全球香菇总产量的70%以上,改写了世界食用菌产量的排行榜,并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距,有专家预测,由于中国香菇产业的迅猛发展,在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度,优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目,中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重,这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》,这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权,同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权,为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权,必须首先建立成熟的品种鉴定技术,为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》,对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言,香菇栽培菌种“同种异名,异种同名”的现象,不仅给菇农带来了极大的损失,影响了他们的栽培积极性,也极大地影响了中国香菇的快速发展;而且,随着大规模的工厂化栽培方式的出现,对香菇栽培菌株质量的要求越来越高,需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术,以保证每批次的用种都准确无误。
随着分子生物学技术的快速发展,特别是分子标记和基因标记技术的建立与成熟,为发展简便、快速、准确的菌株鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记,在应用上具有迅速、简便、低成本的特点,本发明建立了香菇野生43菌种的SCAR分子标记,能对香菇野生43菌种进行快速鉴定。
发明内容
本发明的目的是为了能对香菇野生43菌种进行简便、快速、准确的鉴定和检测,提供了一种香菇野生43菌种的分子特异标记,同时提供了这种香菇野生43菌种的分子标记的获得方法。
一种香菇野生43菌种的分子特异标记为400bp大小的特异片段,其特异性PCR扩增引物对序列为5′AGAGAAAAACAAGAAAAAGAAAAC3′和5′GAAGAAGGTAGTAACAGTCGC3′。
一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法,包括下列步骤(1)菌丝培养和基因组DNA的提取。
(2)香菇菌株野生43的特异DNA片断的获得采用PCR技术,经过大量的筛选试验,采用简单重复序列引物获得了香菇菌株野生43的特异DNA片断,将该片段克隆测序。
(3)特异PCR扩增引物的获得以得到的DNA序列为基础,设计特异PCR扩增引物,引物对的序列如下5′AGAGAAAAACAAGAAAAAGAAAAC3′和5′GAAGAAGGTAGTAACAGTCGC3′。
(4)用特异PCR扩增引物对对野生43菌株进行SCAR-PCR扩增。
(5)电泳检测可见400bp大小的特异片段(图1)。而其它香菇菌种均未见特异性片断。
根据采用这一对特殊引物进行PCR扩增,以能否产生400bpDNA片段作为对香菇野生43菌株进行鉴定和检测的依据。
该检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短,准确性高的优点。该检测所需时间只需要2-3天,而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间,出菇试验则需要至少3个月的时间;该方法在所收集的我国164个香菇生产菌株中具有野生43菌株的专一性。
图1香菇野生43菌株专用检测引物对香菇菌株进行SCAR-PCR扩增结果图中1豹皮0820;2豹皮0821;3虎皮0826;4虎皮0827;5申10;626;7野生43;8野生47;9野生50;109015;117402;12苏香13武香;NC为阴性对照,箭头所示为香菇野生43菌株扩增出分子量约为400bp的特殊DNA条带。
具体实施例方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1(1)菌丝培养和基因组DNA的提取将低温保藏的香菇菌株野生43转接到PDA斜面上,25℃培养活化。两周后接到100mL PD液体培养基中,25℃100r/min振荡培养两周,收集菌丝,放入-20℃冰箱冻存。用改进的CTAB法提取基因组DNA,DNA稀释至20ng/μL,-20℃冰箱贮藏备用。
(2)香菇菌株野生43的特异DNA片断的获得采用PCR技术,经过大量的筛选试验,采用简单重复序列引物获得了香菇菌株野生43的特异DNA片断,将该片段克隆测序。
(3)特异PCR扩增引物以得到的DNA序列为基础,设计特异PCR扩增引物,引物对的序列如下5′AGAGAAAAACAAGAAAAAGAAAAC3′和5′GAAGAAGGTAGTAACAGTCGC3′。
(4)SCAR分子标记的PCR扩增扩增体系总体积为25μL,10×PCR buffer 2.5μL,25mmol/L MgCL22μL,10mmol/L dNTP 0.25L,2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL,10μmol/L野生43菌株检测专用引物对各1μL,模板DNA 1μL(浓度1ng~10ng/μL),ddH2O 18.6μL。PCR反应条件94℃ 1min;94℃ 15second,65℃15second,72℃1min,30个循环;72℃5min。
为了排除其它菌种的假阴性情况,在SCAR-PCR反应体系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物对(ITS1、ITS4),验证所有模板DNA的完整性。
(5)电泳检测取上述PCR扩增产物8μL,与1μL加样缓冲液混匀,点样于1.5%的琼醋糖凝胶上,于0.5 X TBE缓冲液中,5V/cm电压下电泳,电泳结束后,用EB染色,然后在凝胶成像仪上照相。
实施例2对114(为生产用种)个收集自全国各地的香菇生产用菌种及少数野生种共164个菌株进行SCAR扩增。164个菌种中有1个菌种扩增出了野生43的SCAR标记。
权利要求
1.一种香菇野生43菌种的分子特异标记,其特征在于特异性PCR扩增引物对序列为5′AGAGAAAAACAAGAAAAAGAAAAC3′和5′GAAGAAGGTAGTAACAGTCGC3′;DNA片断大小为400bp。
2.一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法,包括如下步骤(1)菌丝培养和基因组DNA的提取;(2)香菇菌株野生43的特异DNA片断的获得;(3)特异PCR扩增引物的获得;(4)用特异PCR扩增引物对对野生43菌株进行SCAR-PCR扩增;(5)电泳检测。
3.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于所述步骤(2)中香菇菌株野生43的特异DNA片断是通过采用PCR技术,经过大量的筛选试验,采用简单重复序列引物获得,将该片段克隆测序。
4.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于所述步骤(3)中特异PCR扩增引物通过下列方法获得以得到的DNA序列为基础,设计特异PCR扩增引物,引物对的序列如下5′AGAGAAAAACAAGAAAAAGAAAAC3′和5′GAAGAAGGTAGTAACAGTCGC3′。
5.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于所述步骤(1)中菌丝培养和基因组DNA的提取包括下列步骤将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上,25℃培养活化,两周后接到100mL PD液体培养基中,25℃100r/min振荡培养两周,收集菌丝,放入-20℃冰箱冻存;用改进的CTAB法提取基因组DNA,DNA稀释至20ng/μL,-20℃冰箱贮藏备用。
6.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于所述步骤(4)中的SCAR-PCR扩增扩增体系总体积为25μL,扩增体系10×PCR buffer2.5μL,25mmol/L MgCL22μL,10mmol/L dNTP 0.25L,2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL,10μmol/L香菇野生43菌株检测专用引物对各1μL,模板DNA 1μL(浓度1ng~10ng/μL),ddH2O 18.6μL,PCR反应条件94℃ 1min;94℃ 15second,65℃ 15second,72℃ 1min,30个循环;72℃ 5min。
7.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于所述步骤(4)中SCAR分子标记的PCR扩增反应体系中加入ITS(Internal TranscribedSpacer),通用引物对(ITS1、ITS4)。
8.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于所述步骤(5)电泳检测为取步骤(4)PCR扩增产物8μL,与1μL加样缓冲液混匀,点样于1.5%的琼醋糖凝胶上,于0.5 X TBE缓冲液中,5V/cm电压下电泳,电泳结束后,用EB染色,然后在凝胶成像仪上照相。
9.一种香菇野生43菌种的分子特异标记在香菇野生43菌种的快速鉴定和检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种香菇野生43菌种的分子特异标记及其获得方法与应用。香菇野生43菌种的分子标记DNA片断大小为400bp,特异性PCR扩增引物对序列为5′AGAGAAAAACAAGAAAAAGAAAAC3′和5′GAAGAAGGTAGTAACAGTCGC3′。方法包括步骤菌丝培养和基因组DNA的提取;香菇菌株野生43的特异DNA片断的获得;特异PCR扩增引物的获得;SCAR-PCR扩增;电泳检测。本发明的分子标记可应用于香菇野生43菌种的快速鉴定和检测。
文档编号C12N15/11GK101086020SQ200710040329
公开日2007年12月12日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者谭琦, 陈明杰, 尚晓冬, 宋春艳, 秦莲花, 潘迎捷 申请人:上海市农业科学院食用菌研究所