专利名称：一种新型非限制性核酸内切酶在大肠杆菌中的表达及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用重组DNA技术生产一种非特异性核酸内切酶的方法。该酶能降解各种形式的核酸(包括DNA及RNA)，可用于除去以核酸为杂质的生物材料中的核酸或排除由核酸引起的影响。
背景技术：
非特异性核酸内切酶是一类能够降解各种形式DNA和RNA的水解酶，对单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯键均具有很高的活性，产生5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸寡核苷酸，且对核酸没有序列要求。可用于除去生物材料中的核酸或排除由核酸引起的干扰。
这类酶的典型代表是来源于Serratia marcescens的非特异性核酸内切酶，已经商品化，商品名
该酶的基因已被克隆和在大肠杆菌中表达，由于该酶具有信号肽，生成的核酸酶被分泌到周质和培养基等不同部位。到目前为止，该酶主要是从培养基中分离纯化都得到的。但是，只有少量的酶被分泌到胞外，还有不少在周质和以无活性的前体包涵体形式存在于胞内。有人将包涵体增溶和复性，虽得到了具有活性的酶，但由于是前体蛋白，有一段信号肽，所以比活不高。因此，该酶的产量较低，工艺繁琐，价格偏贵，不利用于在我国使用。
来源于Anabaena sp.的非特异性核酸内切酶与来源于Serratia marcescens的非特异性核酸内切酶同源，生物功能极其相似。来源于Anabaena sp.的非特异性核酸内切酶的基因也被克隆、测序和在大肠杆菌中表达，也具有信号肽，也属于分泌表达。但与其他非特异性核酸内切酶相比，它有一个显著特征，就是它具有一个天然的抑制剂蛋白，能对抗该酶在胞内的毒性。
发明内容
为了提高非特异性核酸内切酶的产量、简化工艺、降低价格、扩大其使用，本发明利用来源于Anabaena sp.的非特异性核酸内切酶具有天然抑制剂蛋白的性质，改变了非特异性核酸内切酶原有的表达形式，既改分泌表达为胞内高效表达，采用强启动子以无活性的包涵体形式在胞内大量表大，在表达该酶的同时，一起表达其天然抑制剂蛋白，以消除极少量有活性的核酸酶对细胞的强毒性，并利用蛋白质工程技术置换掉一个非活性中心氨基酸，减少了复性时形成多聚体的可能性，提高了复性效率。从提高表达效率和复性效率两方面提高了产量。
通过化学合成法合成来源于Anabaena sp的非特异性核酸内切酶基因(SEQ IDNO.1)及其抑制剂蛋白基因(SEQ ID NO.3)。
采用定点突变技术将非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.1)中第496位的T突变为A得到突变的非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.5)，在相应表达的蛋白中第166位的Cys就变为Ser(SEQ ID NO.6)。
采用反向PCR技术用抑制剂蛋白基因(SEQ ID NO.3)取代pLysE质粒(Novagen公司产品)中的溶菌酶基因，再用改造后的的质粒转化BL21(DE3)细胞，作为表达突变的非特异性核酸内切酶的宿主细胞(已含有表达抑制剂蛋白基因的质粒)。
采用标准PCR技术去除突变的非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.5)信号肽，加入起始密码子ATG，并在起始密码子(ATG)后引入6个组氨酸密码子(CATCACCATCACCATCAC)，得到新的序列(SEQ ID NO.7)，相应得氨基酸序列为(SEQID NO.8)。在片断的首尾引入合适的限制性酶切位点，装配入质粒pET-11a(Novagen公司产品)转化宿主细胞(已含有表达抑制剂蛋白基因的质粒)，完成工程菌的构建。
将构建好的工程菌发酵，离心得到菌体，洗涤后破菌。再离心得到包涵体，洗涤包涵体后增溶溶解，溶液离心后采用镍粒子亲和层析纯化蛋白，纯化的蛋白通过透析复性，加入稳定剂后低温储存。
图1、人工合成Anabaena sp的非特异性核酸内切酶全基因(SEQ ID NO.1)装配于pUC18质粒中得到新质粒pUC18-nse的图谱。
图2、人工合成抑制剂蛋白全基因(SEQ ID NO.3)装配于pUC18质粒中得到新质粒pUC18-inh的图谱。
图3、采用定点突变技术将质粒pUC18-nse中第930位的T突变为A(非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.1)中第496位的T突变为A、得到突变的非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.5))，得到突变的新质粒pUC18-nse-mut的图谱。
图4、采用反向PCR技术扩增pLysE质粒中的非溶菌酶基因并引入限制性内切酶位点，环化后得到的新质粒pLysE-(+)的图谱。
图5、将抑制剂蛋白基因装配入质粒pLysE-(+)后得到新质粒pLE-inh的图谱。
图6、将最终要表达的新的非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.7)装配于pET-11a质粒中得到新质粒pEa-nse-5的图谱。
具体实施例方式 实施例1非特异性核酸内切酶基因及其抑制剂蛋白基因的合成 根据已公布的基因序列，人工合成来源于Anabaena sp的非特异性核酸内切酶基因(SEQID NO.1)及其抑制剂蛋白基因(SEQ ID NO.3)，相应得氨基酸序列为(SEQ ID NO.2)和(SEQID NO.4)将合成的基因装配于克隆质粒pUC18中，得到质粒pUC18-nse(图1)和质粒pUC18-inh(图2)，转化克隆大肠杆菌DH5α。
实施例2定点突变 采用Stratagene公司的
Site-directed Mutagenesis Kit来完成定点突变。将非特异性核酸内切酶基因中(SEQ ID NO.1)第496位的T突变为A，得到质粒pUC18-nse-mut(图3)。在相应表达的蛋白中第166位的Cys就变为Ser(SEQ IDNO.6)。
(一)建立反应体系 (1)引物设计 按如下序列合成引物 引物-15’-gggaaatttagaagattattgtcgagaattaggtctcag-3’ 引物-25’-ctgagacctaattctcgacaataatcttctaaatttccc-3’ (2)准备对照反应 10×反应缓冲液5μl pWhitescriptTM 4.5-kb对照质粒(5ng/μl)2μl 对照引物-1(100ng/μl) 1.25μl 对照引物-2(100ng/μl) 1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl
DNA polymerase(2.5U/μl)1μl (3)准备样品反应 10×反应缓冲液5μl pUC18-nse质粒(5ng/μl)2μl 引物-1(100ng/μl) 1.25μl 引物-2(100ng/μl) 1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl
DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μl (4)PCR循环条件 1)一次循环95℃ 30s 2)12次循环95℃ 30s 55℃ 1min 68℃ 8min 3)一次循环4℃ 1min 反应结束可以取10μl进行电泳检测。
(二)消化程序 (1)向上述反应体系中直接加入1μl Dpn I(10U/μl) (2)轻轻吸打混匀，离心10s，37℃温浴1h。
(三)转化XL1-Blue细胞 (1)冰上溶解XL1-Blue感受态细胞，各取50μl加入1.5ml Ep管中。
(2)分别加1μl以上经消化的PCR产物入1.5ml Ep管中，轻轻混匀，置于冰上30min。
(3)42℃加热45s，然后插入冰中。
(4)加500μl LB，230r/min，37℃培养1h。
(5)铺皿分别取对照组和样品培养液250μl，加入含Amp的琼脂培养皿，琼脂含20μl 10％的X-gal和20μl 100mM的IPTG。
(6)37℃培养过夜。
(四)结果检查 对照组上可见到500～800个菌落，大于80％的菌落含有突变点，菌落的颜色为蓝色。样品培养皿上也有菌落，通过测序确定突变与否。
实施例3表达核酸酶抑制剂蛋白质粒pLE-inh的构建 pLE-inh质粒是将pLysE质粒(Novagen公司产品)中的溶菌酶基因(lys)替换为抑制剂蛋白基因(inh)衍生而来。pLysE的主要表达产物是溶菌酶，是T7RNA聚合酶的天然抑制剂。之所以选择pLysE，是因为本核酸酶抑制剂蛋白与溶菌酶在相应细胞中的作用相似，都是天然抑制剂，都是为了消除所要表达的目标蛋白对细胞的毒性。
为了构建pLE-inh，采用反向PCR技术，扩增pLysE的非溶菌酶部分，并在两端加入限制性酶切位点，扩增后用引入的同一限制性内切酶酶切、连接环化，转化克隆宿主，筛选测序，制备质粒pLysE-(+)(图4)。
再采用标准PCR技术扩增核酸抑制剂蛋白基因，并在两端入加限制性酶切位点，限制酶酶切后，装在上述衍生质粒相应酶切位点间，转化克隆宿主，筛选测序，制备质粒pLE-inh(图5)。完成构建。具体操作如下 (1)PCR引物设计 ATG引物(引入Nde I、Pst I酶切位点) 5’-AACTGCAGCATATGTATTTCTTTCCTCCTTTC-3’ TAA引物(引入Pst I、Xho I酶切位点) 5’-AACTGCAGCTCGAGTTAATTGAACTCACTCAC-3’ (2)准备样品反应 10×反应缓冲液5μl pLysE质粒(5ng/μl)2μl ATG引物(100ng/μl)1.25μl TAA引物(100ng/μl)1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl
DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μl (3)PCR循环条件 1)一次循环95℃ 30s 2)12次循环95℃ 30s 55℃ 1min 68℃ 10min 3)一次循环4℃ 1min 反应结束可以取10μl进行电泳检测。
(4)PCR产物回收 用QIAGEN公司的
PCR Purification Kit回收上述PCR产物。
(5)用Pst I酶切回收后的PCR产物，再用T4DNA连接酶环化，转化克隆大肠杆菌DH5α，筛选、测序。
(6)测序正确，提取质粒，用Nde I和Xho I对回收的PCR产物进行双酶切并用碱性磷酸酯酶脱磷酸化，回收脱磷酸化载体，用于与下面的片断连接。
(7)制备抑制剂蛋白基因片段 1)引物设计 上游引物(引入Nde I) 5’-GGAATTCCATATGACCAAAACCAACTCAGAAATTTTAG-3’ 下游引物(引入Xho I) 5’-CCGCTCGAGTCAAGTTTCCACAACTTTAGTAGAAATAC-3’ 2)反应体系 10×反应缓冲液5μl pUC18-inh质粒(5ng/μl)2μl 上游引物(100ng/μl) 1.25μl 下游引物(100ng/μl) 1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)1μl 3)PCR循环条件 1)1次循环94℃5min 2)30次循环94℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 45s 3)1次循环72℃10min 4)4℃或-20℃保存。
反应结束可以取10μl进行电泳检测。
4)PCR产物回收 用QIAGEN公司的
PCR Purification Kit回收上述PCR产物。
5)用Nde I和Xho I对回收的PCR产物进行双酶切，回收酶切产物，用于连接。
(8)将(6)和(7)制备的片段用T4DNA连接酶连接，转化克隆大肠杆菌DH5α，筛选、测序。
(9)测序正确，完成pLE-inh质粒构建，提取质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，再将含有pLE-inh质粒的细胞制备为感受态细胞BL21(DE3)pLE-inh。
实施例4表达非特异性核酸内切酶质粒pEa-nse-5的构建及工程菌的构建 将突变的非特异性核酸内切酶基因通过PCR反应，切除信号肽，引入Nde I和BamH I酶切位点，并在起始密码子ATG后加上六个组氨酸密码子(CATCACCATCACCATCAC)，得到最后要表达的核酸酶基因(SEQ ID NO.4)，然后装配入pET-11a质粒(Novagen公司产品)的Nde I和BamH I之间，完成质粒pEa-nse-5(图6)的构建，转化感受态细胞BL21(DE3)pLE-inh，完成工程菌的构建BL21(DE3)pLE-inh/pEa-nse-5 (1)PCR引物设计 上游引物(引入Nde I酶切位点及六个组氨酸密码子) 5’-GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACGGAATTTGTGGAAAATTG-3’ 下游引物(引入BamH I酶切位点) 5’-CGGAATCCCTAATTATCAACTTTACTCTC-3’ (2)准备样品反应 10×反应缓冲液5μl pUC18-nse-mut质粒(5ng/μl)2μl 上游引物(100ng/μl) 1.25μl 下游引物(100ng/μl) 1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl Taq DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μl (3)PCR循环条件 1)1次循环94℃ 5min 2)30次循环94℃30s 55℃30s 68℃45s 3)1次循环72℃ 10min 4)4℃或-20℃保存。
反应结束可以取10μl进行电泳检测。
(4)PCR产物回收 用QIAGEN公司的
PCR Purification Kit回收上述PCR产物。
(5)用Nde I和BamH I对回收的PCR产物进行双酶切，回收酶切产物，用于连接。
(6)提取pET-11a质粒，用Nde I和BamH I对回收的PCR产物进行双酶切并用碱性磷酸酯酶脱磷酸化，回收脱磷酸化载体，用于连接。
(7)将(5)和(6)制备的片段用T4DNA连接酶连接，转化克隆大肠杆菌DH5α，筛选、测序。
(10)测序正确，完成pEa-nse-5质粒构建，提取质粒转化BL21(DE3)pLE-inh感受肽细胞，鉴定，完成工程菌BL21(DE3)pLE-inh/pEa-nse-5的构建。
实施例5重组非特异性核酸内切酶的表达 取经过测序鉴定的种子液，接入含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素的灭菌LB培养基中。37℃下250rpm培养过夜。以1％的接种量接入含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素的灭菌LB培养基中，37℃培养。当A600值达到0.6时，加入IPTG使其终浓度达到0.4mmol/l。诱导表达3h，离心(4℃，5000×g，10min)收集菌体，再用PBS(pH8.0)悬浮菌体，离心(4℃，5000×g，10min)收集菌体，-20℃保存或直接纯化。
实施例6重组非特异性核酸内切酶的纯化 (1)破菌 菌体解冻、按湿重1∶10加入破胞液，悬浮菌体，用高压匀浆器破菌，离心，收集沉淀。
(2)洗涤包涵体 沉淀用1∶10洗涤液II洗涤一次，离心，收集沉淀。
(3)溶解包涵体 沉淀用增溶液溶解，离心，收集上清。
(4)上镍离子亲和柱 ①层析柱预处理 a)柱床高度5cm，至少用2BV蒸馏水冲洗柱床。
b)用0.2BV的0.2M NiSO4溶液上柱，以挂Ni2+。
c)用5BV蒸溜水洗涤柱床，以除多余Ni2+。
②平衡 至少用2BV的增溶液平衡，使平衡流出液的pH与增溶液相同。
③上样 ④洗涤 至少用2BV的增溶液洗涤，使A280基线稳定。
⑤洗脱 用洗脱液洗脱洗脱，收集A280洗脱峰流出液。
⑥柱床的再生、清洗与贮存 a)用0.5BV的0.2M EDTA溶液，0.5M NaCl溶液，拔除金属离子。
b)用1BV的2MNaCl溶液上柱，保持15min。
c)用1BV的1MNaOH溶液上柱，保持1～2h。
d)用蒸馏水洗涤柱床至pH7.0左右。
e)柱床贮存于20％乙醇或0.01M NaOH溶液中。
(5)复性 收集到的A280洗脱峰流出液对10倍量的透析液透析24小时，每12小时换液一次，换2次。
(6)分装 加入100％甘油，使甘油的终浓度达50％，按需要分装，-20℃保存。
以上操作如无特别说明，均要求在4℃环境下进行！ 实施例7降低大肠肝菌裂解液黏度 取大肠杆菌BL21(DE3)7.5g(湿重)悬浮于15ml缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH9.0)。加入MgCl2使其终浓度为6mM。分别取5ml大肠杆菌悬浮液，加入核酸酶使其浓度递增。
加入核酸酶后，悬浮液通过高压匀质器(10000psi)，然后立即放入0℃下。在不同的时间间隔，用枪头吸入悬浮液，然后滴下，获得“水滴”效果时，判定黏度降低。
实施例8除去核酸 将鲱鱼精子DNA溶于缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1mg/ml BSA，pH8.0)中，制备成供试液。供试液在不同温度下(0℃、23℃、37℃)用不同浓度的重组非特异性核酸内切酶处理。在不同的时间间隔，取出10μl(最初含有500ng DNA)转移到硝酸纤维素膜上。以用32P标记的鲱鱼精子DNA为探针，进行斑点杂交。标准DNA量从100ng到10pg，用于核酸残留半定量计算。
供试液在不同温育时间下残留DNA量(ng) 核酸酶浓度为90U/ml，供试液在不同温育时间下残留DNA量(ng) 核酸酶浓度为90U/ml，供试液在不同温育时间下残留DNA量(ng)
一种新型非限制性核酸内切酶在大肠杆菌中的表达及应用SEQUENCE LISTING
<110>上海拜朗生物科技有限公司
<120>一种新型非限制性核酸内切酶在大肠杆菌中的表达及应用
<130>无
<140>200710041024.1
<141>2007-05-22
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<170>PatentIn version 3.3
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<212>DNA
<213>丝状体蓝藻鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)
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ctgctgggaa atcccagtgg tgcaacgcca acaaagctta cacctgataa ttacctgatg180
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aaaacattgc ctgcgggttg ggtgcgagtg actccttcta tgtactctgg gagtggttat360
gaccgggggc atattgcacc ttcagcagac cgcaccaaga caacagaaga taatgcggct420
actttcctga tgacaaacat gatgccccaa acacccgata acaatagaaa tacgtgggga480
aatttagaag attattgtcg agaattagtc agtcagggta aagagcttta cattgttgcc540
gggcctaatg gtagtcttgg caaacccctc aaaggtaagg tgacagttcc caaatccact600
tggaagattg ttgtcgtact agatagccca ggctcagggc ttgaaggtat tactgctaat660
actcgcgtta tcgcagtaaa tattcccaac gacccagaat taaataatga ctggagggct720
tataaagtca gtgttgatga attagaaagt ttgacgggtt atgatttttt gtctaatgtt780
tcccccaata ttcaaacaag tattgagagt aaagttgata attag825
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Val Gly Cys Ser Pro Val Gln Ser Gln Val Pro Pro Leu Thr Glu Leu
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Ser Pro Ser Ile Ser Val His Leu Leu Leu Gly Asn Pro Ser Gly Ala
35 40 45
Thr Pro Thr Lys Leu Thr Pro Asp Asn Tyr Leu Met Val Lys Asn Gln
50 55 60
Tyr Ala Leu Ser Tyr Asn Asn Ser Lys Gly Thr Ala Asn Trp Val Ala
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Trp Gln Leu Asn Ser Ser Trp Leu Gly Asn Ala Glu Arg Gln Asp Asn
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Ser Met Tyr Ser Gly Ser Gly Tyr Asp Arg Gly His Ile Ala Pro Ser
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Ala Asp Arg Thr Lys Thr Thr Glu Asp Asn Ala Ala Thr Phe Leu Met
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Tyr Ile Val Ala Gly Pro Asn Gly Ser Leu Gly Lys Pro Leu Lys Gly
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Tyr Lys Val Ser Val Asp Glu Leu Glu Ser Leu Thr Gly Tyr Asp Phe
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Lys Val Thr Val Pro Lys Ser Thr Trp Lys Ile Val Val Val Leu Asp
195 200 205
Ser Pro Gly Ser Gly Leu Glu Gly Ile Thr Ala Asn Thr Arg Val Ile
210 215 220
Ala Val Asn Ile Pro Asn Asp Pro Glu Leu Asn Asn Asp Trp Arg Ala
225 230 235 240
Tyr Lys Val Ser Val Asp Glu Leu Glu Ser Leu Thr Gly Tyr Asp Phe
245 250 255
Leu Ser Asn Val Ser Pro Asn Ile Gln Thr Ser Ile Glu Ser Lys Val
260 265 270
Asp Asn
<210>7
<211>774
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
atgcatcacc atcaccatca ccaagtgcca ccattaactg aactttcccc atcaatcagc 60
gtgcatttac tgctgggaaa tcccagtggt gcaacgccaa caaagcttac acctgataat 120
tacctgatgg tcaaaaatca atatgcactc tcctacaaca acagcaaggg aactgctaac 180
tgggtagctt ggcagcttaa ctcctcatgg ctagggaacg cagagcgtca agataacttc 240
cgcccagaca aaacattgcc tgcgggttgg gtgcgagtga ctccttctat gtactctggg 300
agtggttatg accgggggca tattgcacct tcagcagacc gcaccaagac aacagaagat 360
aatgcggcta ctttcctgat gacaaacatg atgccccaaa cacccgataa caatagaaat 420
acgtggggaa atttagaaga ttatagtcga gaattagtca gtcagggtaa agagctttac 480
attgttgccg ggcctaatgg tagtcttggc aaacccctca aaggtaaggt gacagttccc 540
aaatccactt ggaagattgt tgtcgtacta gatagcccag gctcagggct tgaaggtatt 600
actgctaata ctcgcgttat cgcagtaaat attcccaacg acccagaatt aaataatgac 660
tggagggctt ataaagtcag tgttgatgaa ttagaaagtt tgacgggtta tgattttttg 720
一种新型非限制性核酸内切酶在大肠杆菌中的表达及应用
tctaatgttt cccccaatat tcaaacaagt attgagagta aagttgataa ttag774
<210>8
<211>257
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Met His His His His His His Gln Val Pro Pro Leu Thr Glu Leu Ser
1 5 10 15
Pro Ser Ile Ser Val His Leu Leu Leu Gly Asn Pro Ser Gly Ala Thr
20 25 30
Pro Thr Lys Leu Thr Pro Asp Asn Tyr Leu Met Val Lys Asn Gln Tyr
35 40 45
Ala Leu Ser Tyr Asn Asn Ser Lys Gly Thr Ala Asn Trp Val Ala Trp
50 55 60
Gln Leu Asn Ser Ser Trp Leu Gly Asn Ala Glu Arg Gln Asp Asn Phe
65 70 75 80
Arg Pro Asp Lys Thr Leu Pro Ala Gly Trp Val Arg Val Thr Pro Ser
85 90 95
Met Tyr Ser Gly Ser Gly Tyr Asp Arg Gly His Ile Ala Pro Ser Ala
100 105 110
Asp Arg Thr Lys Thr Thr Glu Asp Asn Ala Ala Thr Phe Leu Met Thr
115 120 125
Asn Met Met Pro Gln Thr Pro Asp Asn Asn Arg Asn Thr Trp Gly Asn
130 135 140
Leu Glu Asp Tyr Ser Arg Glu Leu Val Ser Gln Gly Lys Glu Leu Tyr
145 150 155 160
Ile Val Ala Gly Pro Asn Gly Ser Leu Gly Lys Pro Leu Lys Gly Lys
165 170 175
Val Thr Val Pro Lys Ser Thr Trp Lys Ile Val Val Val Leu Asp Ser
一种新型非限制性核酸内切酶在大肠杆菌中的表达及应用
180 185 190
Pro Gly Ser Gly Leu Glu Gly Ile Thr Ala Asn Thr Arg Val Ile Ala
195 200 205
Val Asn Ile Pro Asn Asp Pro Glu Leu Asn Asn Asp Trp Arg Ala Tyr
210 215 220
Lys Val Ser Val Asp Glu Leu Glu Ser Leu Thr Gly Tyr Asp Phe Leu
225 230 235 240
Ser Asn Val Ser Pro Asn Ile Gln Thr Ser Ile Glu Ser Lys Val Asp
245 250 255
Asn
权利要求
1.一种编码新型非限制性核酸内切酶的DNA序列，其特征在于该DNA序列与来源于Anabaena sp.Anabaena sp.PCC 7120的染色体DNA序列相比，第496位的胸苷酸变异为腺苷酸，并在起始密码子ATG后加上六个组氨酸密码子(CATCACCATCACCATCAC)。
2.一种重组表达载体，其特征在于该重组表达载体为质粒pET-11a，并含有权利要求1所述的编码新型非限制性核酸内切酶的DNA序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于该重组表达载体为质粒pLysE，并含有编码来源于Anabaena sp.的非限制性核酸内切酶抑制剂蛋白质的DNA序列。
4.一种重组细胞，其特征在于该重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，并被权利要求2和3所述的重组表达载体所转化。
5.一种编码新型非限制性核酸内切酶的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列由权利要求1所述的DNA序列所编码，。
6.根据权利要求5所述的新型非限制性核酸内切酶的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列与来源于Anabaena sp.的非限制性核酸内切酶的氨基酸序列相比，第166位的半氨酸变异为丝氨酸、切除了信号肽、并在起始蛋氨酸后加入六个连续的组氨酸序列。
7.一种生产如权利要求5或6所述的新型非限制性核酸内切酶的方法，其特征在于该方法包括如下步骤
(1)合成编码来源于Anabaena sp.的非限制性核酸内切酶的DNA序列；
(2)采用定点突变技术将步骤(1)所述的DNA序列第496位的T变异为A；
(3)采用标准PCR技术去除步骤(2)所述的DNA序列的信号肽，并在起始密码子(ATG)后引入6个组氨酸密码子；
(4)如权利要求2所述表达载体的构建；
(5)合成编码来源于Anabaena sp.的非限制性核酸内切酶抑制剂蛋白质的DNA序列；
(5)如权利要求3所述表达载体的构建；
(6)如权利要求4所述的重组细胞的构建；
(7)步骤(6)所获得的重组细胞的培养表达；
(8)步骤(7)所获得的表达产物的分离纯化；
(9)步骤(8)所获得的分离纯化产物的复性；
8.根据权利要求5或6所述的新型非限制性核酸内切酶在去除生物材料中的核酸和降低核酸对生物材料提取、分析影响的应用。
全文摘要
本发明利用来源于Anabaena sp.的非特异性核酸内切酶具有天然抑制剂蛋白的性质，改变了非特异性核酸内切酶原有的表达形式，即改分泌表达为胞内高效表达，采用强启动子以无活性的包涵体形式在胞内大量表大，在表达该酶的同时，一起表达其天然抑制剂蛋白，以消除极少量有活性的核酸酶对细胞的强毒性，并利用蛋白质工程技术置换掉一个非活性中心氨基酸，减少了复性时形成多聚体的可能性，提高了复性效率。从提高表达效率和复性效率两方面提高了产量。
文档编号C12P19/30GK101311268SQ20071004102
公开日2008年11月26日 申请日期2007年5月22日 优先权日2007年5月22日
发明者汪寄宇, 张建新 申请人:上海拜朗生物科技有限公司