专利名称：：蛋白质二硫键异构酶a3及其抗体在检测肝癌中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物技术检测领域，具体地说，本发明涉及一种蛋白质二硫键异构酶A3及其抗体在检测肝癌中的应用。技术背景肝癌是一种严重危害人类的疾病。西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。因此，为治疗和诊断目的研究和开发在肝癌中高表达的基因和/或蛋白具有重要意义。本领域迫切需要新的在肝癌中高表达的基因和/或蛋白。蛋白质二硫键异构酶A3(Protdndisulfide-isomeraseA3)，又成内质网蛋白57(EndoplasmicReticulumprotein57)的Genebank登录号为gi|2507461|，NCBI的登录号为P30101，Swissprot登录号为P30101，IPI号为IPI00025252.K目前的研究表明蛋白质二硫键异构酶A3是一种多定位的，多功能的蛋白质，它的定位除了最初研究发现的内质网外，还有研究发现它存在于细胞膜和细胞核；其功能也不仅仅局限于最初研究发现的二硫键异构酶活性，也有研究发现它具有细胞膜受体功能和DNA结合活性。蛋白质二硫键异构酶A3目前最主要的功能还是最初发现的二硫键异构酶活性，它属于氧化还原酶类的蛋白质二硫键异构酶家族，在哺乳动物细胞内质网中催化蛋白质成熟过程中的非天然二硫键到天然二硫键转化。所谓天然与非天然二硫键是根据二硫键是否是在蛋白质活性状态下区分的，天然二硫键的形成促进蛋白质成熟而使其具有正常的活性。研究表明蛋白质二硫键异构酶A3是一种糖蛋白特异的二硫键异构酶，也是分泌蛋白质成熟过程中内质网质量控制的关键因子。哺乳动物细胞内质网内有至少17种二硫键异构酶，他们对其底物的识别是通过决定底物特异性的B结构域进行的。蛋白质二硫键异构酶A3的这种功能与癌症有一定联系。癌症造成的基因组不稳定性或者低氧微环境通常会引起大量蛋白质不能正常成熟积累在内质网造成内质网压力，进而造成细胞调亡，但是癌细胞本身又可以获得或者增强其缓解内质网压力的能力，从而保证其存活，癌症这种自我平衡可能成为新的治疗靶点。也有文献表明，蛋白质二硫键异构酶A3在细胞核里也有分布。他的C末端区域含有一个A结构域，具有DNA结合活性，研究发现它是STATA3信号通路种的关键因子又有文献表明它同时是一种膜受体，介导类固醇类激素膜起始的信号通路，研究发现它有两个硫氧还蛋白结构域，可以促进二聚化和配体结合.到目前为止，还没有蛋白质二硫键异构酶A3与肝细胞癌有关的报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种蛋白质二硫键异构酶A3及其抗体在检测肝癌中的应用，以解决现有技术中的缺陷。本发明的原理为通过筛选在肝细胞癌癌组织以及肝细胞癌癌旁组织中差异表达的蛋白质，申请人找到了一种在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中上调表达)，经质谱鉴定为蛋白质二硫键异构酶A3。用非酶解样品制备法(nonenzymaticsamplepreparation,NESP)制备的肝细胞癌的癌组织与癌旁组织蛋白质样品，以掺入C13标记的亮氨酸的HepG2和L02细胞系样品的混合物为内标，通过常规凝胶电泳技术，结合串连质谱技术筛选并鉴定差异表达蛋白质，结果发现蛋白质二硫键异构酶A3在肝细胞癌癌组织中上调表达。免疫印迹实验进一步证实蛋白质二硫键异构酶A3的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。基于蛋白质二硫键异构酶A3与肝细胞癌的这种相关性，本发明首先提供了蛋白质二硫键异构酶A3在检测肝癌和/或肝癌易感性中的应用。如果蛋白质二硫键异构酶A3在待检肝细胞中呈上调表达，则提示该待检肝细胞为肝癌细胞。另外，本发明还提供了抗蛋白质二硫键异构酶A3的抗体(包括单克隆抗体和多克隆抗体)在检测肝癌和/或肝癌易感性中的应用。本发明还提供了一种用于检测肝癌和/或肝癌易感性的试剂盒，该试剂盒包含了蛋白质二硫键异构酶A3和使用说明书。其中所述说明书上记载了蛋白质二硫键异构酶A3，合并使用蛋白质二硫键异构酶A3的抗体。其中所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。本发明还提供了一种体外检测肝组织中蛋白质二硫键异构酶A3的方法，该方法包括以下步骤A、用特异性抗蛋白质二硫键异构酶A3的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)检测待测肝细胞中蛋白质二硫键异构酶A3的数量；B、将步骤A测得的蛋白质二硫键异构酶A3的数量与正常肝组织中的蛋白质二硫键异构酶A3的数量进行比较。如测得的蛋白数量高于正常值，则表示待测肝细胞中蛋白质二硫键异构酶A3的表达存在异常。本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。作为肝细胞癌的潜在标志，蛋白质二硫键异构酶A3在可作为肝癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。采用蛋白质二硫键异构酶A3检测肝癌与现有肝癌检测方法相比，具有可靠性高，特异性好等特点，可以减少检测过程中的假阳性率，提高检测的准确度。图l:蛋白质二硫键异构酶A3的免疫印迹分析结果具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备本实施例中所使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-l-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)均购自Sigma公司。本实施例以非酶解样品制备法(nonenzymaticsamplepreparation,NESP)制备肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品，具体如下手术切除的新鲜组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块。用预冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基(5%胎牛血清，0.2mMPMSF，lmMEDTA，苯甲异噁唑青霉素25mg/mL，庆大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL，两性霉素B0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL)洗涤组织小块数次后，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，细胞沉淀分别溶于适量裂解液(8moI/L尿素、4%CHAPS、40mmol/LTris和65mmmol/LDTT)中，超声细胞破碎仪(Sonipr印150，英国，MSE)冰浴间歇超声2min,15000r/min、4。C离心lh。取上清，以改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)进行总蛋白质定量，制备好的肝细胞癌癌组织及相应癌旁组织的蛋白质样品分装，-8(TC保存备用。以上述方法制备16对肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品。16例肝细胞癌标本均来自东方肝胆外科医院，由2个病理科医生明确为肝细胞癌。均为男性，平均年龄49.4岁Gl65岁)，血清检测hepatitisB病毒感染阳性，16例(100%)属TNM分级III级。其中，AFP高于25pg/L的15例(93.75%);14例肿瘤大于5cm。16例肝细胞癌标本的病理资料详见以下表l。表l、16例肝细胞癌标本的病理资料No.性别年龄HBVHCV等级AFP尺寸f31男性56+—III〉10007X6fi2男性51+III>100014X12X12f33男性50+一III〉10005X6f39男性55+一III>画5X5.5327男性44+一III,〉10008X8X7328男性45+一III〉10007.5X6415男性40+—III>100010X8X67<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本实施例所用癌组织及癌旁组织样品均为取自同一肝细胞癌患者的成对样品，所有16例肝细胞癌病例有极相似的病例诊断指标均为男性，平均年龄49.4岁(31-65岁)，血清检测hepatitisB病毒感染阳性，16例(100%)属TNM分级III级。其中，AFP高于25pg/L的15例(93.75%);14例肿瘤大于5cm。这种取样方法有利于降低个体间差别对实验分析工作的影响。实施例2、掺入CB标记的亮氨酸的HepG2和L02细胞系样品的制备本实施例中使用的C13标记的亮氨酸购自CambridgeIsotopeLaboratories,Inc公司；透析胎牛血清购自hyclone公司；D9785培养基购自Sigma公司。肝细胞癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02细胞在惨入掺入C13标记的亮氨酸的D9785培养基(20%透析胎牛血清)中培养六代以上，转移到10cm培养皿，待细胞长满80%的时候，在冰上用4°C预冷的磷酸缓冲液洗三次，用适量裂解液(8mol/L尿素、4°/。CHAPS、40mmol/LTris和65mmmol/LDTT)裂解，用细胞刮刮下，超声细胞破碎仪(Soniprep150，英国，MSE)冰浴间歇超声2min，15000r/min、4。C离心lh。取上清，以改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)进行总蛋白质定量，制备好的肝细胞癌癌组织及相应癌旁组织的蛋白质样品分装，-80'C保存备用。实施例3、运用凝胶电泳技术、胶内酶解技术和质谱技术进行肝细胞癌癌组织和癌旁组织的差异表达蛋白的筛选本实施例中使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-l-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺等购自Fluka公司。过硫酸胺(IAA)、TEMED、PDQuest软件等为Bio-Rad产品。LCQTMDecaXPsystem和ProteomeXWorkstation购自ThermoFinnigan公司。取实施例1得到的16对肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品中的5对，另取实施例2取得的掺入C13标记的亮氨酸的HepG2和L02细胞系样品，结合凝胶电泳技术、胶内酶解技术和质谱技术进行癌组织和癌旁组织差异表达蛋白质的筛选，具体如下首先将5对癌组织与癌旁组织样品(f31、f32、f33、f39、320)各取20pg，分别混合成癌组织混合样品10(Hig和癌旁组织混合样品10(Hig;将掺入C13标记的亮氨酸的HepG2和L02细胞系样品也等质量混合成细胞系混合样品；在分别取100pg细胞系混合样品分别与癌组织混合样品和癌旁组织混合样品等质量混合成200Mg。然后将两组混合样品各200pg与上样缓冲液混合，采用浓度7.5-17.5%的梯度十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(即SDS-PAGE)分离，电泳条件为15mA/胶30min，然后30mA/胶保持至溴酚蓝离胶下缘0.5cm。接下来的胶内酶解与质谱鉴定过程如下含有混合蛋白质样品的泳道由质谱兼容的考玛斯亮蓝染色的凝胶上手工切取，每个泳道切取23个条带，在100mMNH4HC03，30%乙腈中脱色，真空冷冻干燥，100pl50mmol/LNH4HCO3(pH8.3，蛋白质胰蛋白酶=1:5，w/w)中4°C放置2hr,加入20pl50mmol/LNH4HCO3(pH8.3)，37。C酶解过夜。抽提蛋白(60%乙腈、0.1%三氟乙酸)，真空冷冻干燥。LCQTMDecaXP系统(ThermoFinnigan)鉴定酶解好的样品，Bioworks软件进行数据库搜索。应用凝胶电泳技术、胶内酶解技术、质谱技术，本实施例鉴别出了491种差别表达的蛋白质。其中，肝细胞癌癌组织中高表达的为259种蛋白质；肝细胞癌癌旁组织中高表达的为232种蛋白质。在差异表达谱中，蛋白质二硫键异构酶A3在癌组织中表达明显上调，1D-LC-MS/MS质谱鉴定和数据库搜索得9个非重复肽段(共鉴定到60个肽段)与蛋白质二硫键异构酶A3相符并满足打分条件(DeltaCn值》0.1，并且Xcorr值若为1个电荷>1.9，若为2个电荷》2.2，若为3个电荷》3.75)，氨基酸覆盖率为37.23%，具体结果详见以下表2:表2、蛋白质二硫键异构酶A3质谱鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>K.TFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR.T2576.84326.19830.643K.TFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR.T2588.84325.22040.6074K.TFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR.T2576.84324.87640.6257K.TFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR.T2576.84325.36810.6861R.ELSDFISYLQR.E1371.5222.90620.2243R.ELSDFISYLQR.E1371.5223.00840.4R.ELSDFISYLQR.E1371.5222.6090.3578R.ELSDFISYLQR.E1383.5223.32250.426R.ELSDFISYLQR.E1383.5223.8170.5401R.ELSDFISYLQR.E1371.5223.79550,3869R.ELSDFISYLQR.E1383.5223.83380.5005R.ELSDFISYLQR.E1371.5223.65520.4227R.ELSDFISYLQR.E1371.5223.61470.3848R.ELSDFISYLQR.E1383.5223.57060.4645R.ELSDFISYLQR.E1383.5222.90210.247R.ELSDFISYLQR.E1371.5223.29320.3562R.ELSDFISYLQR,E1383.5223.14540.4542R.ELSDFISYLQR.E1371.5223.53650.3693R.FAHTNVESLVNEYDDNGEGIILFR.P2753.96122.82310.4837R.FAHTNVESLVNEYDDNGEGIILFR.P2753.96123.06590.4815R.FLQDYFDGNLK.R1360.49623.15490.1858R.FLQDYFDGNLK.R1360.49623.56270.3775R.FLQDYFDGNLK.R1360.49623.32160.3633R.FLQDYFDGNLK.R1360.49623.39010.2931R.FLQDYFDGNLK.R1360.49622.47840.1346R.FLQDYFDGNLK.R1360.49622.60670.1358R.FLQDYFDGNLK.R1360.49622.30510.1978R.FLQDYFDGNLK.R1360.49622.5550.4037R.FLQDYFDGNLK.R1360.49622.40340.263811<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例4、蛋白质二硫键异构酶A3表达蛋白的免疫印迹验证为确认蛋白质二硫键异构酶A3的差异表达，取IO位肝细胞癌患者的癌组织及相应癌旁组织蛋白质样品(NESP法制备，表l中f31、f32、f33、f39、320、317、45、48、415、424)，用购买的抗蛋白质二硫键异构酶A3抗体进行免疫印迹分析，具体过程简述如下每个样品取20pg蛋白质样品用12%SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自AmershamBiosciences公司)上，一抗使用鼠抗人蛋白质二硫键异构酶A3单克隆抗体(购自abcam,Inc，1:1000)，4'C孵育过夜，用TBST(每升含Tris2.42g，氯化钠8g，Tween20ml,用HCl调节pH到7.6)洗涤三次，每次5分钟，二抗为抗鼠抗体(购自SantaCruz公司，1:10000)，室温孵育1小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟，最后用ECLplus试剂(AmershamBiosciences)反应5分钟后，以X-光片曝光检测，检测结果如图l所示。图1的免疫印迹结果显示，10对癌组织与癌旁组织中至少有9对呈现这样的现象癌组织中蛋白质二硫键异构酶A3的杂交条带的浓度都明显高于相应的癌旁组织；可见蛋白质二硫键异构酶A3在肝细胞癌的癌组织中存在高表达。综上所述，蛋白质二硫键异构酶A3在肝细胞癌的癌组织及癌旁组织中存在差异表达，显然与肝细胞癌的发生发展有着密切的相关性，因此其表达量可以作为一个指标用于检测肝细胞癌。相应的，特异性抗蛋白质二硫键异构酶A3的抗体，包括各种抗蛋白质二硫键异构酶A3的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测蛋白质二硫键异构酶A3的表达量，因而可以用于检测肝癌和/或肝癌易感性，或者用于制备检测肝癌肝癌易感性的制剂，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。虽然有关蛋白质二硫键异构酶A3动态的生物学功能及肿瘤相关机制还有待进一步研究，但是将其作为检测肝癌或肝癌易感性的标记物却是肯定的。蛋白质二硫键异构酶A3可作为肝细胞癌的潜在标志，而其在胞内的生物学功能提示蛋白质二硫键异构酶A3可能作为肝癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。权利要求1、蛋白质二硫键异构酶A3在检测肝癌和/或肝癌易感性中的应用。2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于蛋白质二硫键异构酶A3在肝癌细胞组织中呈上调表达。3、抗蛋白质二硫键异构酶A3的抗体在检测肝癌和/或肝癌易感性中的应用。4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。5、一种用于检测肝癌和/或肝癌易感性的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含了蛋白质二硫键异构酶A3和使用说明书。6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述说明书上记载了蛋白质二硫键异构酶A3，合并使用蛋白质二硫键异构酶A3的抗体。7、根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。8、一种体外检测肝细胞组织中蛋白质二硫键异构酶A3的方法，其特征在于包括以下步骤A、用特异性抗蛋白质二硫键异构酶A3的抗体检测待测肝细胞中蛋白质二硫键异构酶A3的数量；B、将步骤A测得的蛋白质二硫键异构酶A3的数量与正常肝组织中的蛋白质二硫键异构酶A3的数量进行比较。9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。全文摘要本发明通过筛选在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在差异表达的蛋白，并通过免疫印迹实验证实蛋白质二硫键异构酶A3在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。公开了蛋白质二硫键异构酶A3在检测肝癌和/或肝癌易感性中的应用，以及蛋白质二硫键异构酶A3的抗体在检测肝癌和/或肝癌易感性中的应用。因此作为肝细胞癌的潜在标志，蛋白质二硫键异构酶A3在可作为肝癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。文档编号C12Q1/533GK101323876SQ200710041958公开日2008年12月17日申请日期2007年6月13日优先权日2007年6月13日发明者晓周,辰李,薇陈申请人:上海中科新生命生物科技有限公司