专利名称:从微生物发酵液中分离提取透明质酸的方法
技术领域:
本发明涉及透明质酸的制备方法,尤其涉及从微生物发酵液中分离提取透明质酸的方法。
背景技术:
透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖通过β,1-3和β,1-4糖苷键所构成的重复单元而形成的线性高分子粘多糖,双糖单位数为300-1100对,分子量范围105-107Da。
1934年,Meyer和Palmer从牛眼玻璃体中分离出一种大分子多糖,他们把这种多糖命名为透明质酸。HA溶于水,不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂。由于其溶液具有超强的持水性、粘弹性和生物易吸收性,被广泛由于眼科手术、腹腔手术中预防粘连、关节炎以及化妆品等领域。
透明质酸的生产主要有动物组织提取法和发酵法两种生产工艺。在早期主要是提取法,可用于生产透明质酸的动物器官组织主要有鸡冠、人脐带和动物眼球。由于受原料来源少以及透明质酸含量低的限制,提取法生产透明质酸成本较高。与提取法相比,发酵法生产规模不受原料来源限制,发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化和形成规模化工业生产,所以生产成本远低于提取法,而且无动物来源的致病病毒污染的危险,且可以得到大分子量、高产量的HA。因此,目前提取法正逐渐被发酵法取代。
已知的使用微生物分离并纯化透明质酸的方法如下美国专利No.4784990描述的纯化方法包括向兽疫链球菌的培养液中加入乙醇使透明质酸从微生物中分离出来,然后用氯代十六烷基吡啶使其沉淀。HA得率仅60-70%,需要经高温加热、两次过滤、二次络合、四次醇沉及一次过柱才能制得高纯度HA。美国专利No.5316926描述的纯化方法包括向发酵液中加入0.01%的硫酸月桂酯(SLS)表面活性剂以分离附着在细胞壁上的透明质酸,然后加入阳离子表面活性剂氯代十六烷基吡啶以形成透明质酸沉淀,并用醇使其沉淀。该过程也另外包括三次过滤和四次醇沉,还需之前对荚膜用SLS处理。美国专利No.5411874描述了向发酵液中加入福尔马林溶液杀菌,加入十二烷基硫酸钠(SDS)使荚膜脱落,后经一次过滤、一次超滤、一次络合和三次醇沉及后得到的HA,蛋白较高约为0.2%(蛋白/HA(g/g)),为化妆品级HA。美国专利No.4157296公开的一种纯化透明质酸的方法包括用三氯乙酸处理脓链球菌的培养液以除去菌株,然后用有机溶剂使其沉淀。此法通过调节发酵液pH杀菌,但由于也需大量重复使用有机溶剂进行沉淀,导致成本高并且非常耗时。膜技术可纯化HA,但一般均是作为一种辅助分离手段,用于菌体或小分子量去除,仍需有机溶剂进行分离。如美国专利No.4517295、No.4801539等,采用MWCO10000,20000,30000Da超滤膜渗滤去除小分子物质。但美国专利No.6489467描述了一种无须使用有机溶剂,而是通过调节HA的pH至2.5使HA性状改变并使用超滤进行提纯的方法,但滤速很慢很耗时,不利于大规模生产,且HA不宜长期处于pH为2.5环境中,易导致分子量降解。中国专利200610057913.2和200610090586.0也描述了调节HA的pH至3,在电场和磁场的帮助下进行超滤,以加大滤速,同时避免了使用有机溶剂,但是滤速仍然仅为25.8L/(m2·h),不利于放大。日本专利早期公开No.63-012293描述了一种通过使用大网状阴离子交换树脂(DianionHPA-25、HPA-75、IRA-900、IRA-904)处理含透明质酸的溶液以除去分子量等于或小于1500000Da的低分子量透明质酸及发热物质的方法。韩国专利No.10-2002-0048915描述了发酵液经活性炭处理、芳族吸附树脂处理、超滤作用及乙醇沉淀作用等得到高纯度HA。
然而,无论提取法还是发酵法,在生产过程中都包含了反复的乙醇沉淀和选择性沉淀。工艺路线较长、复杂、费时,成本高;采用较多有机溶剂,易造成二次污染。致使透明质酸的生产成本仍然很高,严重限制了透明质酸应用范围。各种替代方法如采用一些较贵的性能稳定的吸附树脂或离子交换树脂进行除杂,或采用冷冻离心、pH调控、超滤等方法除杂,所得产品纯度高,但HA得率和分子量损失率则因操作步骤多而有所不足,又涉及复杂的处理过程和处理设备,从而加大了生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从微生物发酵液中收集透明质酸的方法,以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤(1)对含有透明质酸的发酵液,通过氯代十六烷基吡啶进行络合或通过乙醇进行醇沉;(2)收集络合物或醇沉物,加入氯化钠水溶液,使络合物或醇沉物的解离或溶解;
(3)收集解离物或溶解物中的透明质酸沉淀,用水溶解,干燥,获得目标产物;所说的透明质酸的分子量为1~3MDa。
所说的发酵液可以采用田毅红2004年发表在《中国医药工程杂志》上的《高分子量透明质酸的发酵研究》报道的方法,进行制备;所说的透明质酸的分子量为1~3MDa;所说的氯代十六烷基吡啶(简称CPC)可采用市售产品,如国药集团化学试剂有限公司的产品;优选的,本发明的方法包括如下步骤(1)将含有透明质酸的发酵液加水稀释至透明质酸的含量为0.3~0.5g/ml,然后加入氯代十六烷基吡啶;搅拌,络合;CPC与透明质酸的重量比为HA∶CPC=1∶1.5~1∶2.5;(2)将步骤(1)的产物离心分离,收集固体络合物;(3)加入浓度为0.4~1M的氯化钠水溶液至原发酵液体积的0.9~1.1倍,络合物解离,获得HA溶液;(4)加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶2,体积比,搅拌,沉淀,得到纤维状HA沉淀物;(5)加入0.1~0.2M氯化钠至两倍的发酵液体积,搅拌至沉淀溶解;(6)在溶解液中加入珍珠岩和活性炭,搅拌,过滤,得到滤液;所说的珍珠岩选白2号珍珠岩或4号珍珠岩中的一种以上,加入量为2~4g/L,活性炭的加入量为1.5~2.5g/L;(7)向滤液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶1.5~2.5,体积比,搅拌后得到HA沉淀;(8)用水溶解沉淀,喷雾或真空干燥得医用级HA干粉。
所得HA干粉1.2g,葡糖醛酸纯度约44.5%,HA得率为91%,分子量为2.07MDa,分子量损失率为13%,蛋白/HA(g/g)=0.04%。
优选的,本发明的方法包括如下步骤(1)将含有透明质酸的发酵液加水稀释至透明质酸的含量为0.3~0.5g/ml,然后加入氯代十六烷基吡啶;搅拌,络合;CPC与透明质酸的重量比为HA∶CPC=1∶1.5~1∶2.5;
(2)将步骤(1)的产物离心分离,收集固体络合物;(3)加入0.4~1M的氯化钠水溶液至1.8~2.2倍的原发酵液体积,络合物解离,获得HA溶液;(4)在步骤(3)的溶液中加入珍珠岩和活性炭,搅拌,过滤,收集滤液;所说的珍珠岩选自2号珍珠岩或4号珍珠岩中的一种以上,加入量为2~4g/L,活性炭的加入量为1.5~2.5g/L;(5)在滤液中加入氧化铝,加量为HA∶氧化铝=1∶4~1∶8(g/g),另加入1~2g/L活性炭,搅拌,过滤,收集滤液;(6)向滤液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶1.5~2.5,体积比,搅拌后得到HA沉淀;7)用水溶解沉淀,喷雾或真空干燥得医用级HA干粉。
所得HA干粉2.18g,葡糖醛酸纯度约46.1%,HA得率为91%,分子量为1.92MDa,分子量损失率为10.1%,蛋白/HA(g/g)=0.0%。
优选的,本发明的方法包括如下步骤(1)将含有透明质酸的发酵液加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶1.5~2.5,体积比,搅拌后得到纤维状HA沉淀;(2)加入0.1~0.2M的氯化钠水溶液至1.8~2.2倍的原发酵液体积,搅拌,沉淀溶解;(3)在步骤(2)的溶液中加入珍珠岩和活性炭,搅拌,过滤,得到滤液;所说的珍珠岩选自2号珍珠岩或4号珍珠岩中的一种以上,加入量为2~4g/L,活性炭的加入量为1.5~2.5g/L,过滤,收集滤液;(4)在步骤(3)的滤液中加入氧化铝,加量为HA∶氧化铝=1∶4~1∶8(g/g),另加入1~2g/L活性炭,搅拌,过滤,收集滤液;(5)向滤液中加入乙醇,向滤液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶1.5~2.5,体积比,搅拌后得到HA沉淀;(6用水溶解沉淀,喷雾或真空干燥得医用级HA干粉。
所得HA干粉2.2g,葡糖醛酸纯度约45.9%,HA得率为92%,分子量为1.90MDa,分子量损失率为11.1%,蛋白/HA(g/g)=0.0%。
本发明采用直接对发酵液进行络合或醇沉操作,既能脱色、使蛋白变性杀菌利于后续过滤除去蛋白,又能保证HA得率,因发酵液所含HA浓度高,HA经醇沉,几乎可完全沉淀。因此避免了采用酸化处理或高温进行杀菌,防止HA遭到降解;也避免了加入福尔马林溶液、SDS或SLS这些杀菌剂或表面活性剂,防止二次污染;避免了对发酵液先过滤后沉淀导致的HA得率较低,因过滤操作需要对发酵液进行稀释,这样得到的滤液所含HA的浓度就较低,此时加乙醇进行沉淀会导致HA得率较低,若滤液经薄膜浓缩后再沉淀,则增加了操作成本。
采用一次络合、一次过滤和两次沉淀的方法时,将发酵液直接用CPC络合,CPC络合HA关键在于控制好溶液离子强度,因此只要将发酵液稀释足够倍数(10倍)后加入CPC即可生成络合物,且CPC的用量只与发酵液中HA的总质量有关,因此发酵液稀释并不会加大CPC用量。络合后将络合物解离到原发酵液体积,此时再用乙醇沉淀,由于不是沉淀发酵液的稀释液,保证了HA高浓度,节省了乙醇的用量,且HA得率高,蛋白去除率高。然后将沉淀物溶解后过滤,由于过滤的除蛋白效率取决于助滤剂和吸附剂的用量,当杂蛋白含量在吸附剂的吸附饱和范围内时可一次性被除去,而CPC络合或乙醇沉淀的除蛋白效率仅约25%,因此若将过滤安排在较为靠前的步骤中,则最终HA的蛋白去除率就只能达到95%左右,若要提高HA纯度,需再次过滤或进行过吸附柱等操作进一步提纯。过滤放在后面进行,除蛋白效率高,还因加入的助滤剂和活性炭等吸附剂更易于吸附变性后的蛋白,而此时蛋白早已得到了充分的变性。对发酵液先进行络合而非醇沉,为了防止先醇沉后络合,则络合物的解离液通过仅有的一次过滤,多余的CPC未必能除尽,影响产品质量。采用一次过滤是为了提高生产效率,因为工业生产中过滤的时间过长或次数过多会直接导致生产效率低下。采用一次络合、二次过滤和一次沉淀的方法,则主要考虑到有机溶剂使用成本高,污染大,通过增加一次过滤操作来替代一次醇沉,连续过滤可避免中间进行浓缩或其他操作,提高HA得率。采用二次过滤和二次沉淀的方法,则主要考虑到CPC较昂贵,大规模生产时若能避免使用,可以降低生产成本,于是采用醇沉来替代络合。
采用简单的设备和简单的四步操作有序组合,就制得医用级HA,且HA得率约90%,分子量损失率约15%,避免复杂的设备不利于放大或增加生产成本,无须烦琐的步骤使HA得率降低,分子量损失率变大或大量使用有机溶剂增大成本,从而利于工业化放大生产透明质酸。
具体实施例方式
实施例1
1)取500ml发酵液,含HA2g,分子量为2.38MDa。发酵液用去离子水稀释十倍2)加入CPC,加量为HA∶CPC=1∶1.5(g/g),搅拌络合后,在3000rpm下离心20min后得到络合物。
3)加入0.5M的氯化钠至原发酵液体积,搅拌至解离4)加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶2(v/v),搅拌后得到纤维状HA沉淀;5)加入0.1M氯化钠至两倍的发酵液体积,搅拌至沉淀充分溶解。
6)在溶解液中加入3g/L的2号珍珠岩,3g/L的4号珍珠岩和2g/L的活性炭,搅拌两小时后,用纸板过滤,得到滤液。
7)向滤液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶2(v/v),搅拌后得到HA沉淀8)用纯水溶解沉淀,喷雾或真空干燥得医用级HA干粉。
所得HA干粉1.2g,葡糖醛酸纯度约44.5%,HA得率为91%,分子量为2.07MDa,分子量损失率为13%,蛋白/HA(g/g)=0.04%。
实施例21)取500ml发酵液,含HA2.4g,分子量为2.14MDa。发酵液需先用去离子水稀释十倍2)加入CPC,加量为HA∶CPC=1∶1.5(g/g),搅拌络合后,在3000rpm下离心20min后得到络合物。
3)加入0.5M氯化钠至两倍的发酵液体积,搅拌至沉淀溶解;4)在溶解液中加入3g/L的2号珍珠岩,3g/L的4号珍珠岩和2g/L的活性炭,搅拌两小时后,用纸板过滤,得到初滤液。
5)在初滤液中加入氧化铝,加量为HA∶氧化铝=1∶5(g/g),另加入1~2g/L活性炭,搅拌2小时后,用纸板过滤得到滤液;6)向滤液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶2(v/v),搅拌后得到HA沉淀7)可用纯水溶解沉淀,喷雾或真空干燥得医用级HA干粉。
所得HA干粉2.18g,葡糖醛酸纯度约46.1%,HA得率为91%,分子量为1.92MDa,分子量损失率为10.1%,蛋白/HA(g/g)=0.0%。
实施例31)取500ml发酵液,含HA2.4g,分子量为2.14MDa。发酵液不稀释2)发酵液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶2(v/v),搅拌后得到纤维状HA沉淀;3)加入0.1M氯化钠至两倍的发酵液体积,搅拌至沉淀溶解;4)在溶解液中加入3g/L的2号珍珠岩,3g/L的4号珍珠岩和2g/L的活性炭,搅拌两小时后,用纸板过滤,得到初滤液。
5)在初滤液中加入氧化铝,加量为HA∶氧化铝=1∶5(g/g),另加入1~2g/L活性炭,搅拌2小时后,用纸板过滤得到滤液;6)向滤液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶2(v/v),搅拌后得到HA沉淀7)此后可用纯水溶解沉淀,喷雾或真空干燥得医用级HA干粉。
所得HA干粉2.2g,葡糖醛酸纯度约45.9%,HA得率为92%,分子量为1.90MDa,分子量损失率为11.1%,蛋白/HA(g/g)=0.0%。
权利要求
1.从微生物发酵液中分离提取透明质酸的方法,其特征在于,包括如下步骤(1)对含有透明质酸的发酵液,通过氯代十六烷基吡啶进行络合或通过乙醇进行醇沉;(2)收集络合物或醇沉物,加入氯化钠水溶液,络合物或醇沉物的解离或溶解;(3)收集解离物或溶解物中的透明质酸沉淀,用水溶解,干燥,获得目标产物;所说的透明质酸的分子量为1~3MDa。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,本发明的方法包括如下步骤(1)将含有透明质酸的发酵液加水稀释至透明质酸的含量为0.3~0.5g/ml,然后加入氯代十六烷基吡啶;搅拌,络合;(2)将步骤(1)的产物离心分离,收集固体络合物;(3)加入浓度为0.4~1M的氯化钠水溶液至原发酵液体积的0.9~1.1倍,络合物解离,获得HA溶液;(4)加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶2,体积比,搅拌,沉淀,得到纤维状HA沉淀物;(5)加入0.1~0.2M氯化钠至1.8~2.2倍的发酵液体积,搅拌至沉淀溶解;(6)在溶解液中加入珍珠岩和活性炭,搅拌,过滤,得到滤液;(7)向滤液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶1.5~2.5,体积比,搅拌后得到HA沉淀;(8)用水溶解沉淀,喷雾或真空干燥得医用级HA干粉。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,CPC与透明质酸的重量比为HA∶CPC=1∶1.5~1∶2.5。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所说的珍珠岩选自2号珍珠岩或4号珍珠岩中的一种以上,加入量为2~4g/L,活性炭的加入量为1.5~2.5g/L。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,本发明的方法包括如下步骤(1)将含有透明质酸的发酵液加水稀释至透明质酸的含量为0.3~0.5g/ml,然后加入氯代十六烷基吡啶;搅拌,络合;(2)将步骤(1)的产物离心分离,收集固体络合物;(3)加入0.4~1M的氯化钠水溶液至1.8~2.2倍的原发酵液体积,络合物解离,获得HA溶液;(4)在步骤(3)的溶液中加入珍珠岩和活性炭,搅拌,过滤,收集滤液;(5)在滤液中加入氧化铝,加量为HA∶氧化铝=1∶4~1∶8(g/g),另加入1~2g/L活性炭,搅拌,过滤,收集滤液;(6)向滤液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶1.5~2.5,体积比,搅拌后得到HA沉淀;(7)用水溶解沉淀,喷雾或真空干燥得医用级HA干粉。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,CPC与透明质酸的重量比为HA∶CPC=1∶1.5~1∶2.5。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所说的珍珠岩选自2号珍珠岩或4号珍珠岩中的一种以上,加入量为2~4g/L,活性炭的加入量为1.5~2.5g/L。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括如下步骤(1)将含有透明质酸的发酵液加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶1.5~2.5,体积比,搅拌后得到纤维状HA沉淀;(2)加入0.1~0.2M的氯化钠水溶液至1.8~2.2倍的原发酵液体积,搅拌,沉淀溶解;(3)在步骤(2)的溶液中加入珍珠岩和活性炭,搅拌,过滤,得到滤液;(4)在步骤(3)的滤液中加入氧化铝,加量为HA∶氧化铝=1∶4~1∶8(g/g),另加入1~2g/L活性炭,搅拌,过滤,收集滤液;(5)向滤液中加入乙醇,向滤液中加入乙醇,加量为HA溶液∶乙醇=1∶1.5~2.5,体积比,搅拌后得到HA沉淀;(6)用水溶解沉淀,喷雾或真空干燥得医用级HA干粉。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所说的珍珠岩选自2号珍珠岩或4号珍珠岩中的一种以上,加入量为2~4g/L,活性炭的加入量为1.5~2.5g/L。
全文摘要
本发明提供了一种从微生物发酵液中分离提取透明质酸的方法,包括如下步骤(1)对含有透明质酸的发酵液,通过氯代十六烷基吡啶进行络合或通过乙醇进行醇沉;(2)收集络合物或醇沉物,加入氯化钠水溶液,络合物或醇沉物的解离或溶解;(3)收集解离物或溶解物中的透明质酸沉淀,用水溶解,干燥,获得目标产物。采用简单的设备和简单的四步操作有序组合,就制得医用级HA,且HA得率约90%,分子量损失率约15%,避免复杂的设备不利于放大或增加生产成本,无须繁琐的步骤使HA得率降低,分子量损失率变大或大量使用有机溶剂增大成本,从而利于工业化放大生产透明质酸。
文档编号C12P19/00GK101089021SQ200710043728
公开日2007年12月19日 申请日期2007年7月12日 优先权日2007年7月12日
发明者谭文松, 胡怡虹, 张旭, 蔡海波 申请人:华东理工大学