白念珠菌菌丝发育抑制因子及其用途的制作方法

专利名称：：白念珠菌菌丝发育抑制因子及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体地说，本发明涉及新的编码白念珠菌菌丝发育抑制因子CaSfll的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。更具体地，本发明涉及从白念珠菌的基因组中克隆到编码白念珠菌菌丝发育抑制因子CaSfll的基因6kSFZ7及其用途。
背景技术：
：白念珠菌也称为白色念珠菌(C朋力Was^/c朋s)，它是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，在免疫下调的病人屮，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等疾病，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡(0dds，F.C.1994.JAmAcadDermatol.31:S2-S5.)。白念珠菌在不同的生长条件下，呈现不同的生长形态，包括菌体(yeastform),假菌丝(pseudohyphae)和菌丝(hyphae)。各种形态之间的相互转化能力直接影响白念珠菌的致病能力(0dds，F.C.1985.CritRevMicrobiol.12:45-93;Brown,A.J.P.etal.1999.TrendsMicrobiol.7:334-338.)，菌丝生长缺陷的菌株其系统感染能力下降或消失(Lo，H.J.etal'1997.Cell.90:939—949;Braun，B.R.etal.2001.EMB0J.20:4753—61;Hwang，C.S.etal.2003.MolMicrobiol.47:1029-43.)。许多培养条件可以引起白念珠菌的形态转换，包括血清，温度，pH值，氮源利用以及氧压等等。细胞内调节白念珠菌形态转换的分子机制主要有MAPK途径(mitogen-activaiedproteinkinasepathway)禾口cAMP/PKA途径(cAMP-dependentproteinkinaseApathway)。同时还发现Cph2介导的，Efgl介导的以及pH应答的信号途径也都和白念珠菌的形态发生相关(Lane，S.etal.2001.MolCellBiol.21:6418-28;Stoldt，V.R.,etal.1997.EMB0J.16:1982-1991;ElBarkani，A.etal.2000.MolCellBiol.20:4635-4647.)。在白念珠菌屮还存在抑制效应的信号途径，主要是T卯l介导的信号途径，依靠特异性DNA结合抑制因子Rfgl，Nrgl等来发挥作用(Kadosh，D.etal.2001.MolCellBiol.21:2496—2505;Braun，B.R.etal.2001.EMB0J.20:4753—4761.)。由于白念珠菌会严重威胁人们的身体健康，因此，本领域迫切需要开发与白念珠菌的生长或毒性有关的各种蛋白或因子，以便更好地防治白念珠菌的引起的感染。
发明内容本发明的目的是提供一种新的与白念珠菌生长有关的菌丝发育抑制因子CaSfll蛋白生物。本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的CaSfll多肽，它包括具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQIDN0:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-100个，较佳地l-50个，更佳地1-20个，最佳地i-io个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，并且具有抑制白念珠菌菌丝形成的功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，该多肽是具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽。在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸的核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70%相同性(a)编码上述白念珠菌CaSfll多肽的多核苷酸；禾n(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQIDN0:1中1-2415位的序列;(b)具有SEQIDNO:1中1-2418位的序列。在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞(包括含有上述载体或染色体中整合有上述多核苷酸的宿主细胞)。在本发明的第四方面，提供了制备具有白念珠菌CaSfll蛋白活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达白念珠菌CaSfll蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞(b)从培养物中分离出具有白念珠菌CaSfll蛋白活性的多肽。在本发明的第五方面，提供了与上述的白念珠菌CaSfll多肽特异性结合的抗体。在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗白念珠菌CaSfll多肽活性的化合物，以及抑制白念珠菌CaSfll多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是白念珠菌CaSfll多肽的编码序列或其片段的反义序列。在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CaSfll蛋白的方法，它包括将样品与CaSfll蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品屮存在CaSfll蛋白。在本发明的第八方面，提供了一种筛选调控白念菌菌丝形成的候选物质的方法，该方法包括(a)将测试物与白念菌进行接触，并观察白念珠菌CaSfll多肽的表达情况，其中如果白念珠菌CaSfll多肽的表达上调，则表示所述测试物是抑制白念菌菌丝形成的候选物质；如果白念珠菌CaSfll多肽的表达下调，则表示所述测试物是促进白念菌菌丝形成的候选物质。在另一优选实施例中，所述的筛选方法还包括将观察结果与对照组进行比较，其中所述的对照组是不添加所述测试物的白念菌培养物。在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。本发明多肽可被用于筛选促进白念珠菌CaSfll多肽活性的激动剂，或者筛选抑制白念珠菌CaSfll多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的白念珠菌CaSfll蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。在一个优选例中，白念珠菌CaSfll多肽或基因被用于制备检测白念珠菌的试剂，或者筛选抑制CaSfll表达或活性的抑制剂或拮抗剂，或作为筛选抑制CaSfll表达或活性的靶点。在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.001-99.99wt%)的本发明的白念珠菌CaSfll多肽的拮抗剂或抑制剂(如抗体)以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗白念珠菌感染等病症。在本发明的第十一方面，提供了一种白念珠菌CaSfll多肽或其拮抗剂或激动剂的用途，其中所述的白念珠菌CaSfll多肽或其激动剂被用于制备抑制白念菌菌丝形成的组合物；或者所述的白念珠菌CaSfll多肽的拮抗剂被用于制备促进白念菌菌丝形成的组合物。较佳地，所述的组合物还被用于降低白念菌的毒性(尤其是当组合物含有白念珠菌CaSfll多肽的激动剂或拮抗剂时)。在本发明的第十一方面，提供了白念珠菌CaSfll多肽的激动剂或拮抗剂的用途，所述的白念珠菌CaSfll多肽的激动剂或拮抗剂被用于制备降低白念菌毒性的组合物。本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1A显示了白念珠菌CaSfll蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。图IB显示了白念珠菌CaSfll蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。图1C显示了白念珠菌CaSfll因子与酿酒酵母Sf11因子的结构域比较。图2A显示了白念珠菌Cs57^7基因能够校正酿酒酵母s/77单倍体缺失株的絮凝反应。图2B显示了白念珠菌Cs5FZ7基因能够校正酿酒酵母s/77双倍体缺失株的强菌丝生长表型。图3A显示了白念珠菌CkS7^/基因的敲除策略及其在基因组内的物理图谱。图3B显示了在白念珠菌Ca5T^/基因的敲除过程中相关菌株的Southern杂交图谱。图4A显示了白念珠菌cas/77/cas/77缺失株在SD培养基中促进菌丝发育。图4B显示了白念珠菌cas/77/cas/77缺失株中菌丝特异性基因州F尸/和况S7去抑制表达。图5显示了白念珠菌Ca57^7基因的过表达在菌丝诱导条件下抑制菌丝发育。图6显示了白念珠菌&571/基因的缺失和过表达都降低白念珠菌的毒性。图7显示了白念珠菌CaSfll-GFP融合蛋白在酵母态和菌丝态都定位在细胞核内。具体实施例方式本发明人通过广泛而深入的研究，首次在白念珠菌中克隆了一种编码白念珠菌菌丝发育抑制因子CaSfll的基因Ck5T^/。具体地，本发明人利用同源重组原理，在白念珠菌中敲除&57^/基因，构建了^^/7//^5/77基因缺失株，该缺失株在非菌丝诱导条件下促进菌丝发育，并且降低白念珠菌菌丝诱导所需阀值。在白念珠菌中过表达"571/能够抑制菌丝的发育，说明CaSfll是一个新的白念珠菌菌丝发育抑制因子。小鼠系统感染实验证明cm/77/cm/77缺失株和Cs5"化/高表达菌株的毒性都是减弱的，表明CaSfll在白念珠菌中的表达量与其毒性表现直接相关。在此基础上，本发明人完成了本发明。在本发明中，术语"CaSfll蛋白"、"CaSHl多肽"或"菌丝发育抑制因子CaSf11"可互换使用，都指具有白念珠菌菌丝发育抑制因子CaSfll氨基酸序列(SEQIDN0:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的菌丝发育抑制因子CaSfll。在本发明中，术语"编码菌丝发育抑制因子CaSfll的基因6k57^,'、"。57^/基因"、"CkS7^7或CaSfll编码DNA"可互换使用，都是指编码白念珠菌菌丝发育抑制因子CaSfll的基因Cs57^Z/。如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境屮分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，"分离的CaSfll蛋白或多肽"是指CaSfll多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CaSfll蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括白念珠菌CaSfll蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的天然白念珠菌CaSfll蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语"白念珠菌CaSfll多肽"指具有白念珠菌CaSfll蛋白活性的SEQIDN0:2序列的多肽。该术语还包括具有与白念珠菌CaSfll蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括白念珠菌CaSfll蛋白的活性片段和活性衍生物。该术语还包括与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%,较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%序列相同性，并且具有抑制白念珠菌菌丝发育或形成的功能的多肽。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与白念珠菌编码CaSfll的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗白念珠菌CaSfll多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含白念珠菌CaSfll多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了白念珠菌CaSfll多肽的可溶性片段。通常，该片段具有白念珠菌CaSfll多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约IOO个连续氨基酸。本发明还提供白念珠菌CaSfll蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然白念珠菌CaSfll多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，"白念珠菌CaSfll蛋白保守性变异多肽"指与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明的多核苷酸可以是DNA形式或脂A形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDN0:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQIDN0:2的蛋白质，但与SEQIDNO:l所示的编码区序列有差别的核酸序列。编码SEQIDN0:2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC，0.1%SDS,60°C;或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42。C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDN0:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CaSfll蛋白的多聚核苷酸。本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。本发明的编码白念珠菌CaSfll多肽的核苷酸全长序列或相应片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞屮分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的CaSfll蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的CaSfll蛋白序列中。应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，etal.Science1985;230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CaSfll蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science,1984;224:1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CaSfll多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码白念珠菌CaSfll多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，编码白念珠菌CaSfll的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,etal.Gene,1987，56:125);在哺乳动物细胞屮表达的pMSXND表达载体(LeeandNathans,JBioChem.263:3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含白念珠菌CaSfll编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,etal.MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导raRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；入噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞屮表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。重组的白念珠菌CaSfll蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)用于筛选促进或对抗CaSfll蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组白念珠菌CaSfll蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制白念珠菌CaSfll蛋白功能的多肽分子。另一方面，本发明还包括对白念珠菌CaSfll编码DNA或其DNA片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。"特异性"是指抗体能结合于白念珠菌CaSfll蛋白或片段。较佳地，指那些能与白念珠菌CaSfll蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制白念珠菌CaSfll蛋白的分子，也包括那些并不影响白念珠菌CaSfll蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的白念珠菌CaSfll蛋白结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778);或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员巳知的各种技术进行制备。例如，纯化的白念珠菌CaSfll蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达白念珠菌CaSfll蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur..T.Immunol.6:511，1976;Kohler等人,Eur.,J.Immunol.6:292，1976;Hammer1ing等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断白念珠菌CaSfll蛋白功能的抗体以及不影响白念珠菌CaSfll蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用白念珠菌CaSfll蛋白的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与白念珠菌CaSfll蛋白的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如￡CbW)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗白念珠菌CaSfll蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的白念珠菌CaSfll蛋白。本发明中的抗体可用于治疗或预防与白念珠菌CaSfll蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断白念珠菌CaSfll蛋白的产生或活性。抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如白念珠菌CaSfll蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭表达CaSfll蛋白的白念珠菌。多克隆抗体的生产可用白念珠菌CaSfll蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。利用本发明的CaSfll蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CaSfll蛋白发生相互作用的物质，如抗体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。本发明的CaSfll蛋白的抗体、抑制剂、或拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质屮，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)口腔内、阴道内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。例如，本发明的CaSfll蛋白的抗体、抑制剂、或拮抗剂可直接用于疾病治疗，例如，用于抑制白念珠菌的正常生长，进而减轻白念珠菌造成的感染。在使用本发明CaSfll蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如其他抗真菌剂氟康唑等。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的抗CaSfll多肽的抗体或其拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的CaSfll蛋白的拮抗剂或抗体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约l毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。能与白念珠菌CaSfll蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，宜对白念珠菌CaSfll蛋白分子进行标记。本发明还涉及定量和定位检测白念珠菌CaSfll蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的白念珠菌CaSfll蛋白水平，可以用作判断白念珠菌是否会造成严重的感染。一种体外非诊断性检测样品中是否存在CaSfll蛋白的方法是利用CaSfll蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与CaSfll蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaSfll蛋白。CaSfll蛋白的多聚核苷酸可用于CaSfll蛋白相关疾病的诊断。在诊断方面，CaSfll蛋白的多聚核苷酸可用于检测CaSfll蛋白的表达与否。如编码CaSfll的DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CaSfll蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为"基因芯片")上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CaSfll蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CaSfll蛋白的转录产物。检测编码CaSfll的基因的突变也可用于诊断CaSfll蛋白相关的疾病。CaSfll蛋白突变的形式包括与正常野生型CaSfll编码DNA序列相比的点突变、缺失、和其它任何异常等。可用己有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从白念珠菌基因组DNA中分离出的。其序列如SEQIDN0:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为2418个碱基，其开放读框位于1-2415位，编码全长为805个氨基酸的白念珠菌CaSfll蛋白(SEQIDNO:2)。CaSfll蛋白为治疗白念珠菌感染提供新的治疗途径，具有潜在的应用前景。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例材料限制性内切酶、T4DNA连接酶、探针标记试剂盒均购自美国Invitrogen公司；消解酶(Zymolyase100T)购自日本Seikagaku公司；酸洗玻璃珠(425600fxm)，CalcoflourWhite荧光染料，FLAGM2抗体，蛋白酶抑制剂均购自Sigma公司，proteinG-bead悬液购自Roche公司，GFP抗体购自SantaCruz公司，ECL试剂购自Pierce公司，用于PCR扩增的K0Dplus购自日本的Toyobo公司。通用方法(l)白念珠菌基因组DNA抽提白念珠菌培养过夜用ddH20洗1次，悬浮在500^1溶液A中(1M山梨醇，lOOmMEDTApH8.0)，加入5|ll20mg/ml的Zymolase，37°C放置1小时后，高速离心去上清，细胞用500|xlofTEbuffer(20mMTris.HClpH7.5，lmMEDTA)洗一次，悬浮在350^1ofTEbuffer中，并加入90plof溶液B(250mMEDTApH8.0，400mMTris.HClpH8.0，2%SDS)，65。C放置30分钟，加入80|Lllof5MKAc，冰上放置1小时，高速离心5分钟，吸取上清并加入lml的无水乙醇，-20°(]放置20分钟，高速离心5分钟，沉淀用70%乙醇洗一次，离心后烘干。(2)Southern分析基因组DNA用,p/2l/^a[完全酶切，电泳完成后的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡45min,尼龙膜用双蒸水或10xSSC浸透，搭好转膜平台，胶与膜间用Parafilm封闭，加一个500g砝码。，以10xSSC为转膜液转移过夜，第二天漂洗晾干交联。交联后的膜装入杂交管，加入10ml预杂交液(6xSSC，5xdenhardt'sReagent,0.5%SDS，100(ig/ml鱼精DNA于65'C预杂交lh，探针在IO(TC变性5min，加入150(^1(约1/3所标记的探例)65。C杂交10-16h。0.lxSSC，0.1。/。SDS洗两到三次，每次30min，取出膜，晾干，磷屏显影5h。探例标记用invitrogene的随机引物标记试剂盒，并按照其说明操作。将含25ngDNA的溶液于100°C加热变性5-10min，置于冰浴中，再依次加入RandomPrimersBufferMixture,2|LildCTP，2|ildGTP，2^1dTTP，3|il[oc-32P]_dATP(10|LiCi/|il)，混匀后加入l^llKlenow酶，于25。C保温lh，以S印hadexG-25柱以3000rpm离心4min，收集离心液，即为纯化后的探例溶液。探例于100°C变性5min冰上冷却后加入杂交体系中。(3)Northern分析用常规的热酚法抽提白念珠菌总RNA。各菌株在YPD，3(TC中培养至对数生长期后期，转接至SD培养基中，起始0D二0.2，并在相应温度下培养指定时间，用热酚法抽提白念珠菌总RNA。20^1上样量包括RNA样品12nl(25吗)，4^1甲醛，2|il10xM0PS，2^1上样缓冲液、65。C加热10min，(TC冷却2min，离心5s，上样。电泳在含甲醛的变性胶上进行(lg琼脂糖，l(M10xM0PS，87mlDEPC处理水，加热融化稍冷后加入2.7ml37%甲醛)。电泳条件为100mA，50-70V，5-7h电泳完成后同样用毛细法转膜，转膜液用5xSSC。转膜过夜后，取出膜，不能使膜干透，用Bio-RaGSGeneLinkerC3protocol紫外交联，加入10ml预杂交液，65°C，2h后更换为10ml杂交液，加入探针65'C杂交过夜，用2xSSC，0.1%SDS，65'C洗膜两次，每次30min。杂交好的膜不要晾干，用保鲜膜包好后磷屏显影。重杂交洗膜用0.5%SDS，90-100°C加热5-10min，或按照Clontech推荐用0.5%SDS，90-100'C加热10min后让其自然冷却10min后取出备用，若不立即位用，用保鲜膜包好后置于-20'C保存。(4)白念珠菌和酿酒酵母的转化准备PEG/LiAc溶液(pH7.5)10ml;在1.5mlEppendof管中依次加入质粒(如果转酿酒酵母，质粒O.(ig，如果转白念珠菌，线形化质粒大约5|ig)，10^110mg/ml鱼精DNA，混匀；加入O,lml感受态细胞和O.6mlPEG/LiAc，votex混匀;30°C200rpm培养30min;加入70|xlDMS0，轻轻混匀；42'C热冲击15min，期间不时轻轻摇匀；冰浴2min:高速离心15s，吸掉上清，用0.2mlTE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD平板上。(5)絮凝沉淀反应所需菌在SD液体培养基里培养过夜，使之达到饱和状态。转至试管中剧烈摇晃后，静置15分钟，观察照相。(6)双倍体酵母菌的假菌丝生长及细胞形态观察挑取单个酵母菌落，均匀的划线涂于SLAD平板，3(TC培养3-5天观察单个细胞形成的克隆形态并拍照记录。(7)小鼠系统感染实验以体重在18-21gICR雄性小鼠为实验对象，通过尾静脉注射IO(HU白念珠菌各菌株，并培养观测25天。各个菌株注射浓度为5x106细胞/毫升。实施例l编码白念珠菌CaSfll蛋白的基因的获得及结构分析利用同源序列搜索的方法从白念珠菌(C朋WAs"ica/s)基因组序列中(http:〃genolist.pasteur.fr/CandidaDB/，http:〃w丽.candidagenome.org/)得至U—个与酿酒酵母Sfll(ScSfll，5"acc力arCT7^cescerew'w'aeSfll)同源性最高的蛋白CaSf11。根据搜索结果，合成以下引物上游引物ATGAGTCATTTGGTACTGTCT(SEQIDNO:3)下游引物:TTATTCTAATTTTCTCTTTTTATG(SEQIDNO:4)以野生型白念珠菌基因组DNA为模板，通过常规的PCR反应获得长度约2.42Kb的扩增产物。通过合成一系列引物对扩增产物所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，该扩增产物所含的全长DNA是一个新的DNA序列(如SEQIDNO:1和图1A所示)，编码一个新的805个氨基酸的蛋白质(如SEQIDNO:2和图IB所示)。此蛋白质被命名为CaSfll(C朋力'cfea^/ca/sSfll)蛋白，其编码基因命名为6^67^7基因。CaSfll蛋白全长805aa(图1B)，分子量90.2KD，等电点9.54。与ScSf11类似，在CaSfll蛋白的N端部分(113-223位)含有一个HSF结构域，这个结构域可以与启动子上称为热休克元件的反向重复序列GAAnnTTC特异结合(Conlanetal..JMolBiol309:1007-1015);CaSfll中间部分(363-383位)含有一个coiledcoil结构，此外CaSfll还具有4个酿酒酵母Sfll不具有的多聚谷氨酰胺序列(图1C)。由于酿酒酵母的5FZ7基因以及Sfll蛋白最早命名，白念珠菌中的同源基因和同源蛋白也是以相同的名字命名，这是白念珠菌的命名规则之一。为了区别白念珠菌(Candidaalbicans)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的SFL1基因及其对应的Sf11蛋白，我们有时在名称前加上前缀Ca代表白念珠菌(Candidaalbicans)(caSFL1,CaSfll)，Sc代表酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(ScSFL1，ScSfll)，斜体表示基因，正体表示蛋白。在不引起误解的地方，也可直接用5FZ/表示白念珠菌57=17基因而用Sfll表示白念珠菌Sfll蛋白，这是沿用了白念珠菌研究领域的惯例。实施例2白念珠菌CkS7^7互补酿酒酵母5b57^的功能酿酒酵母57^/最初是作为能够抑制酵母细胞的絮凝作用而被发现的。它的缺失能够增强絮凝反应，以至于在双倍体缺失株中都能观察到细胞下沉的絮凝现象，而这一现象却无法在野生型双倍体菌株中观察到。Sfll也参与对酿酒酵母细胞假菌丝形成的调控，在氮源缺乏条件下，s/77/9/77缺失株解除抑制呈现强烈的假菌丝生长。为了检测"57^Z7是否可以互补酿酒酵母57^/基因的功能，将6k5FZ/基因克隆到载体pVTU102(Vernetetal.Gene.198752:225-233)的5awHIA&I位点上，形成pVTU-CaSFLl，并将这个质粒转化酵母s/7/缺失株。试验菌株在液体培养基中培养至饱和状态，静置。结果表明外源表达6kS7^7能校正s/77缺失株的絮凝表型回复到野生型状态(图2A);试验菌株在低氮源的SLAD固体培养基上培养2天，s/77/9/77缺失株形成边缘具有浓密假菌丝的菌落，而表达的s/77/s/7/缺失株生成边缘光滑的菌落(图2B)，说明Ck5Z7也能校正s/〃/s/77缺失株的假菌丝强烈形成表型。以上结果证明6k5KU是酿酒酵母5FZ/的同源基因，表达的CaSfll是ScSfll的同源蛋白。实施例3白念珠菌CaSFLl基因的敲除为了研究6k57^/基因在白念珠菌形态发生中的作用及其机制，采用PCR同源重组法构建css/77/c"/77缺失株。基因敲除示意图如图所示(图3A)。合成的上下游引物分别为5DR:5-ATGAGTCATTTGGTACTGTCTTCACTTGGTACGACAACGACTGCTACTCCAACTTCAAGAGTTTTCCCAGTCACGACGTT(SEQIDNO:5);和TGTGGAATTGTGAGCGGATA(SEQIDNO:6)。其中每个引物的5'端的60个碱基和6kSFZ7同源，3'端的20个碱基和用于PCR扩增模板质粒中的DNA配对。分别以质粒pGEM-HISl(Wilsonetal.JBacteriol1999181:1868-1874)和pRS-ARG4ASpeI(Wilsonetal.JBacteriol1999181:1868-1874)为模板，以5DR和3DR为引物，通过PCR扩增得到片段用于转化白念珠菌。首先用pGEM-HIS1扩增出的片段转化受体菌HLY1902(力i's-,"rs-arg-)，在SD(Ai's-)平板上筛选得到24个克隆，挑取12个克隆用Southern杂交进行鉴定。鉴定结果显示正确插入#/57的菌株为单拷贝敲除株CaLl。再把CaLl作为受体菌进行第二拷贝CkS7^/的敲除，PCR合成的/!/ft^片段用于转化，经过营养筛选和Southern杂交鉴定得到^f+，#/5+的sf11双拷贝缺失株CaL2(图3B)。将含有一段1.3kb启动子和全长开放阅读框的6k5FZ7片段插入到质粒pBES116(Fengetal.J.Bacteriol1999181:6339-6346)上，形成pBES116-CaSFLl。利用限制性内切酶顺el酶切线性化该质粒并转化cas/77/c^/77缺失株CaL2，得到^57=1/整合回到本身基因位置的回复菌株用于表型分析。实施例4CkSFZ/基因的缺失增强白念珠菌菌丝的形成观察cas/77/cs^77缺失株在酵母生长条件下的表型，发现cm/7Z/cm/77缺失株促进菌丝的形成。在SD固体培养基30。C生长6天，Ck57^7缺失株解除对菌丝生长的抑制，形成干燥褶皱的菌落，在显微镜下观察菌落内的部分细胞呈伸长的菌丝状。野生型和回复菌株都形成表面湿润光滑的菌落，镜检细胞也都呈椭圆型的酵母态。css/77/cas/7/缺失株在液体SD培养基屮也表现出了类似的表型，大约有30%的细胞呈菌丝态生长，而野生型和回复菌都呈酵母态生长(图4A)。这些结果证明CaSfll是个形态发生的抑制因子，在白念珠菌中抑制菌丝生长，与酿酒酵母Sfll功能类似。然而，css/7力/css/7/缺失株在丰富培养基YPD中却没有促进菌丝生长，"57^7的缺失株可能只有在营养贫瘠的信号激活下才能表现出去抑制表型。白念珠菌的形态发生伴随着菌丝特异性基因如州『厶^G57的特异表达(Birseetal.Infect.Imniun.199361:3648-3655;Staabetal.J.Biol.Chem.1996271:6298-6305)。我们检测了cas/77/cas/"缺失株中和￡T￡7的转录情况，结果表明在SD培养基30°C培养6小时后，6kS"凡/双拷贝缺失株中州f/3/，被大量的诱导，而野生型和单拷贝缺失株以及^67^7回复菌株都没有检测到这两个基因的表达(图4B)，证明CaSfll是菌丝特异性基因转录的抑制因子。实施例5Ca57^基因的过表达抑制白念珠菌的菌丝形成为了研究CaSfll的表达剂量对菌丝形成的影响，将Ca5FiJ基因克隆到质粒pBAl(FangCaoetal.MolBiolCell.200617:295-307)上，在启动子下过表达Ck5F〃，观察在菌丝诱导条件下菌株的形态变化。在含有血清的固体培养基上37°C培养3天，6k5FZ7过表达菌形成圆形的边缘带有少量短菌丝的菌落，而野生型菌形成长长的边缘带有浓密菌丝的菌落，表明Ca57^/的过表达抑制菌丝的形成。在固体Lee's培养基中更明显，野生型形成褶皱的菌落，边缘环绕的菌丝能侵入到琼脂里，而^571/过表达菌形成光滑的菌落(图5)。在液体培养基中过表达Cs5FZ7同样抑制菌丝的形成，在YPD+10y。血清或者Lee's中性pH培养条件下，Ca5F〃过表达菌只有10%的细胞形成粗短的菌丝，而90%的细胞以酵母态生长。Ck5Z7基因的缺失增强丝状生长，把Cs57^7整合到本身基因座内在内源启动子控制下表达能回复css/77/css/77缺失株强丝状生长的表型，在c^/7M^/77缺失株中过表达Ck5FZ7则又能抑制丝状生长(图5)，表明CaSfll对菌丝的抑制作用是剂量依赖型的，这表明CaSfll蛋白是一种白念珠菌菌丝发育抑制因子。实施例6Ca5FZ7基因的缺失和过表达都能减弱白念珠菌的毒性酵母-菌丝形态之间转换的能力与白念珠菌的致病能力密切相关。一些正调控因子FloS，Crkl，Efgl等的缺失株不能形成菌丝同时也丧失了毒性，一些负调控因子Tupl，Nrgl，Ssn6等的缺失株能组成型形成菌丝但其毒性或丧失或大幅下降。目前认为一些重要的毒性因子只在白念珠菌的形态转变过程中被释放，锁定在任何一种的形态，都会阻断这些毒性因子的表达释放，因而毒性下降。本实施例中，通过小鼠系统感染试验来检测基因对白念珠菌的毒性或者感染能力的影响。将18-20克的ICR雄性小鼠作为实验对象，通过尾静脉对每个小鼠注射5xl05个细胞，然后观察小鼠的存活率来判断菌株的致病能力。已有文献报道，^A的拷贝数目影响了菌株的毒性。t/27^缺失菌株不能形成菌丝，也没有毒性。由于本发明人改造过的菌株都只有一个拷贝的^A基因，所以为了避免WA的拷贝数干扰6k57^/对毒性的影响，改用只有一个拷贝"^A基因的野生型菌株CAF2-1作为阳性对照。结果显示，注射CAF2-1的小鼠和注射^57^7回复菌的小鼠在第14天全部死亡，而注射css"7/ras/77缺失株和Ck57^Z2高表达菌株的小鼠在第25天分别还有38%和25%的存活，说明Ck57^7基因的缺失和过量表达使白念珠菌的致病能力下降，CaSfll的表达量影响白念珠菌的毒性表现(图6)。实施例7CkSFZ7基因的缺失降低白念珠菌菌丝诱导的阈值在实验室条件下，多种环境信号影响白念珠菌的形态发生。血清是诱导菌丝形成最强的外界刺激因子，它不仅能够促进菌丝芽管的生成还能抑制菌丝生长成酵母态细胞。此外，高温(37。C)、屮性pH，营养贫瘠的培养条件也能促进菌丝的生成。相反，低温(25。C或者30°C)，酸性pH，营养丰富的培养条件则有利于酵母态细胞生长。通常情况下，一种诱导信号并不足以使野生型白念珠菌形成菌丝，而需要两种或多种信号的组合。比如丰富培养基YPD要加入10%血清并在高温下诱导才能形成菌丝，高温中性pH的Lee's或者高温Spider培养基诱导才可以形成菌丝。我们初步观察到c^/77/c^/W缺失株在营养相对贫瘠的SD培养基中形成菌丝而在丰富培养基YPD中形成酵母细胞，说明CaSfll受到营养信号的调控。为了分析CaSfll是否受某种专一的菌丝诱导信号调控，我们检测了该缺失株在不同温度、不同pH、不同营养、以及有无血清的培养基中形成菌丝的能力(表1)。在高温37。C，cas/77/cas/7/缺失株在所有检测的液体培养基中都能形成菌丝，包括营养丰富的YPD培养基，低氮源的SLAD培养基，低碳源的SLCD培养基，酸性pH的Lee's培养基。而野生型对照菌SC5314在YPD中只能形成短的菌丝，在酸性pH的Lee's培养基屮不能形成菌丝，说明c^/7厶/css/7/缺失株具有菌丝生长的去抑制作用，在高温下降低了pH阈值使白念珠菌在pH4.0就能诱导形成菌丝在中等温度30°C，野生型菌株SC5314在所有检测的液体培养基中都不能被诱导形成菌丝。然而，cas/77缺失株却能够在除了YPD之外的所有培养基中都能形成菌丝，形成菌丝的比例从在酸性pH培养基中的10%到营养限制培养基(Spider)中的100%变化。血清的添加不能促进野生型细胞生成菌丝，但却能足够的促进C3S/W缺失株形成更高比例的菌丝。这些结果表明，Ca^Z/的缺失降低了白念珠菌感应营养限制信号和血清刺激的阈值。低温25。C是酵母态细胞生长的最佳温度，cas/77/cas/77缺失株在丰富培养基中以酵母态生长，但是在营养贫瘠的SCLD，SLAD，Spider培养基中有2-5%的细胞能够形成短的菌丝。在营养限制培养基中添加10-30%的血清能够提高菌丝形成的比例达到30-50%。这种联合效应在其它的营养较丰富的培养基没有观察到，说明CkSFU的缺失使白念珠菌在营养缺乏或加入血清的条件下，降低了感应温度的阈值。表1cas/77/cas/77缺失株在各种培养基中的丝状生长表型。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例8.CaSfll定位于细胞核CaSfll具有与HSF结构域，该结构域能结合于靶基因启动子区的DNA元件，PS0RTII软件分析表明在其N端210-224位有一个NLS核定位序列。为了确认CaSfll蛋白定位在细胞核内发挥功能，本实施例中利用重叠PCR的方法将GFP蛋白融合在CaSfll蛋白的C末端，在J/W/强启动子下表达该融合蛋白。在酵母态培养条件和菌丝诱导条件下观察，发现该融合蛋白的定位没有发生改变，说明CaSfll的核定位不受形态调控，组成型地分布在细胞核内，而表达对照GFP的菌株其GFP均匀分布在整个细胞中(图7)。此外，还检査了CaSfll-GFP融合蛋白在&々2缺失株和外源加入cAMP条件下的定位情况，结果显示，CaSfll依然定位在细胞核内，表明CaSfll的定位不受cAMP/PKA信号通路的调控。白念珠菌CaSfll的核定位进一步支持了它在白念珠菌中是作为转录调控因子来调节白念珠菌的形态发生。实施例9CaSfll蛋白重组表达和纯化在该实施例中，以实施例1中的PCR扩增产物为模板，用序列如下的5'和3'端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得白念珠菌CaSfll编码DNA作为插入片段。PCR反应中使用的5'端寡核苷酸引物序列为5'-CTGGGATTCATGAGTCATTTGGTACTGTCT-3'(SEQIDNO:7)该引物含有5sMH限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的部分编码序列；3'端引物序列为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>该引物含有Sa/zin限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和白念珠菌CaSfll的部分编码序列。白念珠菌CaSfll编码DNAPCR产物纯化后经BamHI酶切再与质粒pGEX-2T(购自美国Irwitrogen公司)按常规方法重组形成载体pGEX_2T-CaSfll并转化至感受态大肠杆菌DH5oc，挑取阳性克隆用EcoRI酶切鉴定插入方向，酶切产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDyeTerminator试剂盒，PE公司)。经测序证实，已插入了完整的CaSfll编码序列。挑表达CaSfll的阳性DH5oc克隆接种于100ml2xYTA培养基中，37°C300rpm振荡培养12-15hr，1:10稀释于预热的2xYTA培养基继续振荡培养1.5hr,加100mMIPTG至0.lmM后30。C诱导2-6hr，5，000g4°C离心10min去上清，置冰上用50mllxPBS(0.14MNaCl，2.7mMKCl，10.lmMNa2HP04,1.8mMKH2P04，pH7.3)重悬，超声(B.BraunLabsonicU)破碎后再加入20%TritonX-100至1%轻摇30min，然后12,000g4。C离心10min，上清用0.8(im滤膜过滤后，过lml50%谷胱甘肽S印harose4B层析柱，lxPBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mMTris-HC1，pH8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到白念珠菌CaSfll蛋白。实施例10抗CaSfll蛋白抗体的产生将实施例9中获得的重组白念珠菌CaSfll蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund's佐剂乳化。用50-100pg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freimd's佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100|ig/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀白念珠菌CaSfll蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明的CaSfll蛋白发生结合。实施例11筛选调控白念菌菌丝形成的候选物质在白念菌的培养物中，添加测试物质(Cs57^7基因的反义核酸片段)，作为测试组(每组有5个培养物)；在另一白念菌的培养物中，不添加测试物质，作为对照组(每组有3个培养物)。观察测试组和对照组中观察白念珠菌CaSfll多肽的表达情况。结果表明，与对照组相比，测试组中白念珠菌CaSfll多肽的表达下调，因此所述测试物是促进白念菌菌丝形成的候选物质。这提示，所述的"57^7基因的反义核酸片段通过抑制CaSfll多肽的表达，进而促进了白念菌菌丝的发育和形成。讨论由于酿酒酵母和白念珠菌在许多细胞过程中的保守性，通常用其来研究白念珠菌的形态相关基因和信号转导途径。酿酒酵母Sfll是调控酵母形态发生的转录抑制因子。57^/的缺失能够增强酵母细胞的絮凝反应、侵入琼脂的能力以及形成假菌丝的能力(Fujita.Aetal.1989.Gene85,321-8;Pan,Xetal.1999.MolCellBiol22,3981-93)。Sfll通过其N端的热休克因子结构域(HSFdomain)结合到耙基因启动子的特异DNA序列上，然后通过与Ssn6蛋白的相互作用，募集T叩l/Ssn6抑制复合物，抑制靶基因的转录，从而影响酵母的形态发生(Conlanetal.JMolBiol2001:309，1007-15)。在氮源缺乏条件下，缺失株解除其对假菌丝生长的抑制作用，呈现强烈的丝状生长，即使在调控假菌丝生长的重要激酶Tpk2(PKA的一个催化亚基)缺失时，s/7/Zs/7/缺失株仍然能够生成菌丝。酿酒酵母Flo8是cAMP/PKA途径下游的一个重要的转录调控因子，也参与酵母细胞的絮凝作用，侵入生长和假菌丝形成(R叩pSetal.EMBOJ.1999Mar1;18(5):1257-69)。下游耙基因化肌的转录需要Flo8的激活，凡^9的缺失会阻断FZW/的表达，从而抑制酵母细胞的侵入生长和假菌丝形成。有证据表明，Flo8蛋白能够结合到尸ZW7启动子的特异元件上，而这种结合依赖PKA催化亚基Tpk2的磷酸化作用(Pan，Xetal.1999.MolCellBiol22,3981-93)。Sfll与Flo8结合于凡W7启动子上的区域相同，两者对该区域的结合呈竞争关系。上游激酶Tpk2通过磷酸化作用来调控Sfll或Flo8对^ZW/启动子的竞争结合Tpk2磷酸化Sf11，使Sfll蛋白解聚并从f!W7启动子解离，抑制解除；同时FloS被Tpk2磷酸化后结合到相同的启动子区域激活凡W7的转录。白念珠菌(C朋力Wss^yc朋s)是一种人体机会性致病真菌，可以引起广泛的感染，多种调控因子与其致病相关。利用生物信息学比较分析，我们在白念珠菌的基因组序列中找到一个基因，该基因编码的产物和酿酒酵母(5"scc力aro扱ycescereWw'se)转录调控因子Sfll(ScSfll)具有最高的序列同源性和结构域相似性，因此把该基因称为白念珠菌5FZ7基因(Ca67^7)，对应的蛋白称为白念珠菌Sfll因子(CaSfll)。在酿酒酵母s/77缺失株中表达CkSFZ7能够互补s/77缺失株的过絮凝反应和强菌丝形成表型，说明"57^Z7在功能上也是&571/的同源物。在白念珠菌中表达CaSfll-GFP融合蛋白，该融合蛋白定位于细胞核内。在白念珠菌中敲除Ck57^厶构建cas/77/c^/77缺失株，该缺失株在非菌丝诱导条件下促进菌丝发育，并且降低白念珠菌菌丝诱导所需阀值。在白念珠菌中过表达"5FZ/能够抑制菌丝的发育，说明CaSfll是一个新的白念珠菌菌丝发育抑制因子。另外，小鼠系统感染实验证明cas/77/cas/77缺失株和&57=17高表达菌株的毒性都是减弱的，表明CaSf11在白念珠菌中的表达量与其毒性表现直接相关。至于cas/77/cas/7/缺失株和6k5^Z7高表达菌株的毒性都减弱的原因，是因为白念菌的毒性与白念菌的"菌丝一酵母"转化能力有关，转化能力越强，则毒性越强。抑制菌丝发育，会导致转化能力下降，故白念菌毒性下降；而促进菌丝发育，也会导致转化能力下降，故白念菌的毒性也下降。因此，基于本发明，白念珠菌CaSfll多肽的激动剂或拮抗剂可被用于制备降低白念菌毒性的组合物。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110〉中国科学院上海生命科学研究院<120〉白念珠菌菌丝发育抑制因子及其用途<130>074592〈160>8<170>Patentlnversion3.4〈210〉1<211>2418<212>隨<213〉白念珠菌(Candidaalbicans)<220〉<221〉CDS<222>(1)..(2415)〈400〉1atg叫tcatttggtactgtctteacttggtacgacgactgetact48MetSerHisLeuValLeuSerSerLeuGlyThrThrThrThrAlaThr151015acttea卿agtccacat3CC331catageaccccctacaatca396ProThrSerArg20SerProHisThrAsn25HisSerThrProTyr30AsnGintctateactteaaat卿agetecCC3gttcct犯g犯tteagtc144AsnSerlie35ThrSerAsnArgSer40SerProValProLys45AsnSerValtea卿attatac犯atgaatCC3cctatagatatgsag192AsnSer50Arglie工leProGin55ThrMetAsnProPro60lieAspMetLystcg肌catattaaatccag犯gacgatacttctgga240SerAsnAsnlieLeuAsnProGluLysAspThrAspThrSerArgGly65707580gaccatctgteaaaa_gettctsgt已ttagt3gCgccsgcgga288AspHisLeuGluSer85LysAlaSerSerlie90SerSerAlaSerGly95Thractaacaataacgttagt犯t犯caatteaacggggaaa336ThrThrThrAsn100AsnAsnAsnValSer105AsnAsnAsnSerThr110GlyLysactattgttmateC3Cttatatgacatgttgcatgacgag384ThrGinlie115ValPhelieHisLys120LeuTyrAspMetLeu125HisAspGlutcg3t3teccatcttatatggtggtctCC3agtttggatteatttUt432Serlie130SerHisLeulieTrp135TrpSerProSerLeu140AspSerPheTyrgtaacgggag肌gsgttttctcgagtgttgtectatttcaag480ValThrProGlyGluGluPheSerArgValLeuSerGinTyrPheLys145150155160C3Cacg犯tattgcateatttata卿c犯tu犯catgtatggattc528HisThrAsnlieAla165SerPhelieArgGin170LeuAsnMetTyrGly175Phecataaagtaaatgagtutta犯cc肌gacgatc肌c犯c犯576HisLysValAsn180GluProPheLeuAsn185GinAspAspGinGin190GinGinttac犯teaaat卿tggg3attt卿tct3CC犯cc犯624GinGinLeu195GinSerAsnArgTrp200GluPheArgHisSer205ThrAsnGinttt柳犯3ggcgacactg3￡Ltcgtta卿atacga卿age672PheArg210LysGlyAspThrGlu215SerLeuLysAsnlie220LysArgArgSertec犯gttg犯tgcacaagttgtca_atataaaatcttta720SerLysThrLeuAsnAlaGinLysGluValValAsnlieLysSerLeu225230235240CC3ccgacttctcatatgg肌tacaacactggctactcttatc￡ia768ProProThrSerHis245ProMetGluTyrAsn250ThrGlyTyrSerTyr255GinaatgatagtgetcattattttgttcaccatC3Cagtacc3CC816AsnGluAspSerAlaHisTyrPheValHisHisHisSerlieThrThr260265270c肌teacctgetgacagacctcgttcttctactcct3t3864MetGinSerProAlaAspMetArgProArgSerProSerThrProli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)具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQIDNO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，并且具有抑制白念珠菌菌丝形成的功能的由(a)衍生的多肽。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是SEQIDN0:2氨基酸序列的多肽。3.—种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求l所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽；更佳地，所述的多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQIDNO:1中1-2415位的序列；(b)具有SEQIDNO:1中1-2418位的序列。5.—种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。6.—种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体或染色体中整合有权利要求3所述的多核苷酸。7.—种权利要求l所述的白念珠菌CaSfll多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出白念珠菌CaSfll蛋白多肽。8.—种能与权利要求l所述的白念珠菌CaSfll多肽特异性结合的抗体。9.一种筛选调控白念菌菌丝形成的候选物质的方法，其特征在于，该方法包括(a)将测试物与白念菌进行接触，并观察白念珠菌CaSfll多肽的表达情况，其中，如果白念珠菌CaSfll多肽的表达上调，则表示所述测试物是抑制白念菌菌丝形成的候选物质；如果白念珠菌CaSfll多肽的表达下调，则表示所述测试物是促进白念菌菌丝形成的候选物质。10.—种白念珠菌CaSfll多肽或其拮抗剂或激动剂的用途，其特征在于，(a)所述的白念珠菌CaSfll多肽或其激动剂被用于制备抑制白念菌菌丝形成的组合物；或者(b)所述的白念珠菌CaSfll多肽的拮抗剂被用于制备促进白念菌菌丝形成的组合物；或者(C)所述的白念珠菌CaSfll多肽的激动剂或拮抗剂被用于制备降低白念菌毒性的组合物。全文摘要本发明提供了一种新的菌丝发育抑制因子-CaSfl1蛋白，编码CaSfl1蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种CaSfl1蛋白的方法。本发明还公开了这种CaSfl1蛋白及其编码序列的用途。实验证明，CaSfl1蛋白是白念珠菌菌丝发育抑制因子。小鼠系统感染实验证明，CaSfl1在白念珠菌中的表达量与其毒性表现直接相关。文档编号C12N15/31GK101362798SQ20071004467公开日2009年2月11日申请日期2007年8月8日优先权日2007年8月8日发明者李砚东,陈江野申请人:中国科学院上海生命科学研究院