专利名称：：一种基因打靶用中间载体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体地涉及一种基因打耙用中间载体及其制备方法和用途。技术背景基因敲除(geneknockout)是利用同源重组(homologousrecombination)技术原理，按照研究者预先设计，在小鼠整体水平上进行的可以时空调控的灭活特定靶基因的理论和技术。其广泛涉及分子生物学，分子遗传学，胚胎学，实验动物学等诸多学科领域，是目前研究基因功能最新最权威的技术平台。目前基因敲除的工作大致可分为以下几步1.设计并构建预敲除的基因打靶载体(targetingvector);2.将线性化的打靶载体通过电转法转入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)；3.转染ES细胞的体外培养和筛选；4.将筛选出的中靶阳性克隆显微注射入小鼠囊胚；5.假孕母鼠接受囊胚移植产生出嵌合体小鼠；6.嵌合体小鼠再与囊胚供体小鼠杂交，即可得到杂合型的基因敲除小鼠。从以上实验步骤不难看出获得基因敲除小鼠的关键与基础环节是打耙载体的设计与构建，因其是否成功将直接决定基因敲除工作的进行。打靶载体是用于基因组DNA上特定位点的基因重组和突变的DNA分子构件。其基本组分是载体骨架；以及基因组DNA上打靶位点两侧的同源序列，分别称为左、右两个同源臂。考虑到DNA转染和基因打耙都是小概率事件，往往需在载体中组装正性选择标志(positiveselectionmarker)来选出符合设计要求的打靶产物。正性选择标志(如对G418有抗性的Neo基因)可选择出现概率低于万分之一的稳定整合了打靶载体的转染细胞。目前本领域主要采用的是分步法逐步构建基因敲除打靶载体。此类方法步骤繁琐、周期长，并且在构建过程中极易出错，导致了很大的人力、物力的消耗。其大致实验步骤举例如下第一步采用PCR方法分别得到左右各3-5kb的同源臂，以及要敲除的位于两个同源臂之间的待锚定基因外显子，然后通过TA克隆方法分别将PCR产物装入TA克隆载体从而获得待敲除目的基因组片段，经过限制性内切酶酶切鉴定和测序最终验证扩增序列的正确性(参见图1)。第二步将克隆得到的左右同源臂依次装入pDNR-lr载体中两个loxp位点两侧，然后将要敲除的基因或基因外显子装入两个loxp位点之间(如下图)。由于两个loxp位点之间含有一个四环素抗性基因，两个loxp位点外侧多克隆位点很少，所以，这一步是该种方法的关键，也是最困难的一部分，往往需要花费很长的时间。如果找不到合适的多克隆位点，构建打靶载体以及后面的同源重组将无法实现(参见图2)。第三步将pk-ll载体中的阳性筛选基因装入第二步中构建的带左右同源臂的载体，并最终获得带阳性筛选标记，敲除基因外显子和两端同源臂的打靶载体(参见图3)。通过以上介绍，可知因为载体以及载体的多克隆位点的限制加上PCR的不确定性，采用现有方法构建基因敲除打靶载体步骤复杂，耗时长。一般情况下，采用现有方法构建打靶载体需要进行反复的扩增、TA克隆、限制性内切酶酶切验证和测序，花费大量的时间和经费。因为构建打靶载体成功与否将直接关系到建立基因敲除小鼠工作的顺利进行，为了加快速度，节省更多的人力物力财力，进一步縮短获得基因敲除老鼠的实验周期，本领域需要建立能克服现有技术的缺陷的新技术。
发明内容为了使建立基因敲除打靶载体的工作速度更快，成本更低，成功率更高，本发明提供了一种的基因打耙用中间载体。本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种基因打靶用中间载体。该载体含有两个loxp位点序列和两端各连接一个frt位点序列的阳性筛选基因。两端各连接了一个frt位点序列的阳性筛选基因既可以位于两个loxp位点的上游，业可以位于其下游。其中，上述的两个loxp位点序列之间还有一多克隆位点(MCS)。该多克隆位点可以根据需要打靶的基因序列在现有的多克隆位点中进行选择。优选的，该多克隆位点具有SEQIDNo.4所示的序列。其中，上述的阳性筛选基因也可以在现有的基因打靶常用的阳性筛选基因中选择。优选的，上述阳性筛选基因为pgkNEO基因。进一步的，上述的基因打靶用中间载体还含有抗性筛选基因的序列。上述的抗性筛选基因也可以在本领域常用的抗性筛选基因中选择。优选的，上述抗性筛选基因为AMPr、kan、chl、tet或neo中的至少一种。更进一步的，上述的基因打靶用载体含有SEQIDNo.1所示的序列。SEQIDNo.1所示的序列依次含有由loxp位点序列(SEQIDNo.3)、多克隆位点序列(SEQIDNo.4)、loxp位点序列(SEQIDNo.3)、frt位点序列(SEQIDNo.5)、阳性筛选基因序列(SEQIDNo.6)、frt位点序列(SEQIDNo.5)组成。优选的，上述的基因打靶用载体具有SEQIDNo.2所示的序列。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种制备上述的基因打耙用中间载体的方法。该方法包括以下步骤a、利用限制性内切酶HindIII和KpnI，分步将一个loxp位点，一个frt位点从pk-11载体上切下并装入pCDNA3.1(+)载体上，克隆获得pCDNA3.1-frt-loxp;b、利用限制性内切酶Sail和BstXI，分步将loxp位点从pCDNA3.1-frt-loxp载体上切下并装入pGEM-Teasy载体上，克隆获得pGEM-Teasy-loxp;c、利用限制性内切酶Apal，将loxp位点从pGEM-Teasy-loxp载体上切下并装入pk-11载体上，克隆获得目标载体。本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述基因敲除用中间载体在制备基因打耙载体中的用途。本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种制备上述基因打靶载体的方法。该方法包括以下步骤a、扩增得到待敲除基因或外显子，通过多克隆位点将待敲除基因或外显子装入上述任一项所述的基因敲除用中间载体中，酶切验证并测序。b、扩增含有待敲除基因或外显子及其两端同源臂的基因组DNA片段，通过TA克隆方法将其克隆到TA克隆载体中，并测序验证。c、利用待敲除基因所选定外显子两端的限制性内切酶酶切位点，通过PCR扩增，将步骤a所得载体中含双loxp位点、待敲除基因或外显子以及阳性筛选基因的片段返装入含有步骤b所得的TA载体中，获得打靶载体。通过对现有技术的缺点的分析，本发明首次提出使同时具有双loxp位点和带有两个frt位点的阳性筛选基因的中间载体，以克服上述缺点。只要使用本发明载体，构建基因敲除打靶载体就可以通过简单的两步方法完成，而且速度快，简易，节约，减少了出错的可能。本发明基因敲除用中间载体可以在现有的众多载体(如pk-ll、pdnr-lr)上进行改建或重头设计，其中的各项拼接操作都可以根据现有的本领域常规技术实现。因打靶用中间载体主要是基因敲除打靶载体本发明基因打靶用中间载体中起重要作用的几个元件的序列如下loxp位点(SEQIDNo.3):5，-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3，；frt位点(SEQIDNo.4):5，-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC-3，；多克隆位点(SEQIDNo.5):5'-TCGAGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCCCCTCGA-3，。显然，根据本发明提出的构建具有双loxp位点和带有两个frt位点的阳性筛选基因的中间载体的思想，是可以用众多的现有载体为基础，进行从头设计或改建获得本发明基因打靶用中间载体，根据本领域常识，可以选用不同的阳性筛选基因和抗性筛选基因，载体上也可以再连接其它的功能单元，但是只要基因打靶用中间载体上同时具有了双loxp位点和带有两个frt位点的阳性筛选基因，那么都应在本发明的保护范围之内。本发明的有益效果在于从构建打靶载体的根本出发，在以往实验方法的基础上，本发明首次开发出了一种能用于基因打靶载体构建的中间载体。由于pKDL-HZG载体具有普遍、通用的使用价值，可以运用到现阶段几乎所有类型的基因敲除打靶载体构建系统，而且简化构建打靶载体的实验路线，易化实验的操作，减少试验出错的几率；节约时间，降低成本，相对于现有技术都有很明显的优点，使用范围广，具有很好的应用市场前景。图1表示现有技术的第一阶段流程。图2表示现有技术的第二阶段流程。图3表示现有技术的第三阶段流程。图4表示本发明基因打耙中间载体pKDL-HZG的构建示意图。图5表示本发明基因打耙中间载体pKDL-HZG的示意图。图6表示使用本发明基因打耙中间载体构建基因打耙载体的第一阶段流程。图7表示使用本发明基因打耙中间载体构建基因打耙载体的第二阶段流程。以下结合具体实施方式进一步说明但并不限制本发明具体实施方式实施例一、本发明基因打靶用中间载体的制备因为loxp位点全长仅34bp，最好在两个lo邓位点之间插入常用的多克隆位点以便于使用。目前，同时具备两个loxp位点和常用的多克隆位点的片段尚不存在，只有通过拼接或者直接设计合成，如直接合成，则费用高昂且不易抄作，现阶段很少有公司能直接合成150bp以上的DNA序列。为了节约资金和减少克隆中带来的突变，采用拼接的方式，简要流程参见图4。现将方法细述如下l.利用限制性内切酶HindIII和KpnI，分步将一个loxp位点，一个frt位点从pk-11载体上切下并装入pCDNA3.1(+)载体上，克隆获得pCDNA3.1-frt-loxp。酶切体系如下(限制性内切酶购自fermentas公司)10xKpnlbuffer10ul10xKpnlbuffer5ulKpnl1ulKpnl1ulPlasmid—pk-1189ulPlasmid—pCDNA3.144ullOOul50ul37'C水浴反应12小时，1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压100伏；30分钟。采用promega公司胶回收试剂盒进行回收。lOxredbuffer10ullOxredbuffer5ulHindIII1ulHindIII1ulPlasmid—pk-ll89ulPlasmid—pCDNA3.144ullOOul50ul37。C水浴反应12小时，1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压100伏；30分钟。采用promega公司胶回收试剂盒进行回收。连接体系如下(连接酶购自fermentas公司)10xT4廳ligasebuffer1ulT4DMligase1ul插入片段(frt-loxp)5ul载体(pCDM3.1)_3ul10ul16'C水浴连接反应2小时，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，挑取单菌落并酶切用1%的琼脂糖凝胶电泳验证，结果正确；进一步送到invitrogen(上海)公司进行测序，结果与预期一致，从而获得pCDNA3.1-frt-loxp克隆。2.利用限制性内切酶SalI和BstXI，分步将loxp位点从pCDNA3.1-frt-loxp载体上切下并装入pGEM-Teasy载体上，克隆获得pGEM-Teasy-1oxp。酶切体系如下(限制性内切酶购自fermentas公司)10xorangebuffer10ul10xKpnlbuffer5ulSail1ulSail1ulPlasmid-pCDNA3.l-frt一loxp89ulPlasmid-pGEM-Teasy44ullOOul50ul37'C水浴反应12小时，1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压100伏；30分钟。采用promega公司胶回收试剂盒进行回收。10xorangebuffer10ullOxKpnlbuffer5ulBstXI1ulBstXI1ulPlasmid-pCDM3.1-frt-loxp89ulPlasmid-pGEM-Teasy44ullOOul50ul55。C水浴反应6小时，1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压100伏；30分钟。采用promega公司胶回收试剂盒进行回收。连接体系如下(连接酶购自fermentas公司)10xT4DMligasebuffer1ulT4DMligase1ul插入片段(loxp)5ul载体(pGEM-Teasy)_3ul10ul16'C水浴连接反应2小时，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，挑取单菌落并酶切用1%的琼脂糖凝胶电泳验证，结果正确；进一步送到invitrogen(上海)公司进行测序，结果与预期一致，从而获得pGEM-Teasy-loxp克隆。3.利用限制性内切酶ApaI，将loxp位点从pGEM-Teasy-loxp载体上切下并装入pk-ll载体上，最终克隆获得pKDL-HZG。酶切体系(限制性内切酶购自fermentas公司)10xbluebuffer10ul10xbluebuffer5ulApal1ulApal1ulPlasmid-pGEM-Teasy-loxp89ulPlasmid-pk-ll44ullOOul~^Tl37。C水洛反应12小时，1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压100伏；30分钟。采用promega公司胶回收试剂盒进行回收。连接体系如下(连接酶购自fermentas公司)10xT4DMligasebuffer1ulT4腿ligase1ul插入片段(loxp)5ul载体(pk-11)_^10ul16'C水浴连接反应2小时，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，挑取单菌落并酶切验证，1%琼脂糖凝胶电泳验证结果正确；进一步送到invitrogen(上海)公司进行测序，结果与预期一致，获得了这一关键的基因敲除用中间载体，将其命名为pKDL-HZG(具有SEQIDNo.l所示的序列)，其结构见图5。该载体具有双loxp和带有两个frt位点的阳性筛选基因pgkNEO，而且在双loxp位点之间插入了多达15个多克隆位点，这更加简化了插入敲除外显子的实验过程。实施例二、使用本发明基因打靶用中间载体构建打靶载体使用实施例一制备的基因敲除用中间载体构建小鼠PNAS-4(GENEBANK登录号NC—000067,位置Chrl:180074587-180086143bp，+strand，全长11.3kb)基因敲除载体以用于敲除小鼠PNAS-4基因。1.采用primer5软件设计扩增长链基因组DNA以及待敲除外显子的引物，并递交invitrogen(上海)公司合成。2.PCR扩增获得小鼠PNAS-4基因外显子2(exon2，序列见SEQIDNo.12)，利用引物两端设计的酶切位点EcoRI将外显子2装入PKDL-HZG载体，酶切所得用1%的琼脂糖凝胶电泳验证，进一步送到invitrogen(上海)公司进行测序。获得片段frt-pgkNE0-frt_1oxp-exon2-1oxp。2.1扩增外显子2(exon2)片段2.1.1引物上游弓I物A(SEQIDNo-6):5，-gaattcaagtgatagag"cacctgact-3，下游弓I物A(SEQIDNo.7):5，-gaattcaccctgggcaaaetaga-3，2.1.2扩增条件94°C2分钟94°C30秒；52°C30秒；72°C1分钟；循环30次72°C7分钟4°C°°2.2TA克隆获得TA-exon22Xr印idligasebuffer5ulPCR产物2ulTA载体0.5ulT4■ligase1ulMilliqH20_1.5ul10ul2.3酶切与连接酶切体系如下(限制性内切酶购自fennentas公司)10xEcoRIbuffer5ul10xEcoRIbuffer5ulEcoRI1ulEcoRI1ulPlasmid-TA-exon244ulPlasmid-pkd卜HZG44ul50ul50ul连接体系如下(连接酶购自fermentas公司)10xT4薩ligasebuffer1ulT4DNAligase1ul插入片段(exon2)5ul载体(pkdl-HZG)_3ul10ul2.4酶切用1%的琼脂糖凝胶电泳验证，结果正确；阳性克隆送到irwitrogen(上海)公司进行测序，结果与预期一致，验证正确。酶切验证体系如下(限制性内切酶购自fermentas公司)10xEcoRIbuffer3ulEcoRI1ulPlasmid-pkd卜HZG-exon226ul30ul3.PCR扩增获得11.3KB的长链基因组DNA片段，装入TA克隆载体，釆用酶切，PCR，测序等手段进行验证。3.1扩增长链基因组DNA片段3.1.1引物上游引物B(SEQIDNo.8):5，-gcttactgtcttgetcgtcatg-3，下游引物B(SEQIDNo.9):5，-tcagatggtaggcgttgc-3，3.1.2扩增条件94°C2分钟94°C30秒；55°C30秒；68°C11分钟；循环30次72°C7分钟4°C°°1.4酶切验证，结果正确。酶切验证体系如下(限制性内切酶购自fermentas公司)10xEcoRIbuffer3ulEcoRI1ulPlasmid-pkd卜HZG-exon226ul30ul4.利用待敲除外显子两端的可以利用的酶切位点BsaBI和SanDI，设计两端带BsaBI和SanDI的引物扩增frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp片段，然后将frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp片段返装回TA-长链，置换掉长链的外显子2，最终获得打靶载体。4.1扩增frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp片段4.1.1引物上游弓I物C(SEQIDNo.10):5，-gatacacatcgaattgccgcggtaccg-3，下游弓I物C(SEQIDNo.11):5，-tacgtaggagetccaccgeggt-3，4.1.2扩增条件94°C2分钟94'C30秒；56°C30秒；72°C3分钟；循环30次72°C7分钟4。C>4.1.3TA克隆10XligasebufferPCR产物TA载体T4DNAligeiseMilliqH20301ul5ul5ul1ul4ul1.4酶切与连接5ul1ul44ul50ul10xorangebuffer5ulBsaBI1ulPlasmid-TA-长链基因组片段_44ul50ul10xyellowbuffer5ulSnaBI1ulPlasmid-TA-frt一pgkNE0-frt-loxp-exon2-loxp44ul50ul酶切体系(限制性内切酶购自fermentas公司)10xorangebufferBsaBIPlasmid—TA—frt—pgkNE0—frt—loxp—exon2—loxp10xyellowbufferSnaBIPlasmid-TA-长链基因组片段5ul1ul44ul50ul连接体系如下(连接酶购自fermentas公司)10xT4■ligasebufferT4DMligase插入片段(frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp)载体(TA-长链基因组片段)1ul1ul5ul3ul10ul4.1.5验证10xorangebuffer5ulBsaBI1ulPlasmid-TA-长链-frt-pgkNEO-frt-1oxp-exon2-loxp44ul50ul10xyellowbuffer5ulSnaBI1ulPlasmid-TA-长链-frt-pgkNEO-frt-1oxp-exon2-loxp44ul50ul所得用1%的琼脂糖凝胶电泳验证，结果正确；进一步送到invitrogen(上海)公司进行测序，结果与预期一致，表明得到了预期的打靶载体。由上述实施例可以知道以该载体为基本工具，建立一个新的方法，可将打耙载体的构建缩减为两个主要步骤进行第一阶段扩增获得待敲除基因的外显子，将待敲除外显子装入实施例一制备的的pKDL-HZG中间载体，酶切验证并测序。同时扩增含有待敲除基因的外显子两端同源臂以及敲除外显子本身的基因组DNA片段通过TA克隆方法分别将其克隆到TA克隆载体中，并测序验证(参见图6)。第二阶段然后利用待敲除基因所选定外显子两端的限制性内切酶酶切位点(下图为A，B)，通过PCR扩增，将包含双loxp位点，待敲除基因或外显子以及阳性筛选基因的片段返装入含有左右同源臂的TA载体，最终获得打靶载体(参见图7)。以上实验路线和实施例二的具体说明清楚的反映了运用该本发明中间载体来构建基因打靶载体的简易性。时间上，运用该载体大致需要15-30天(见表l)，这大大的缩短了整个基因敲除实验的总时间，使实验周期大大缩短。表1使用本发明中间载体pKDL-HZG构建打靶载体的时间分析实验步骤所用时间1.PCR分别扩增待敲除基因的外显子；待敲除基因的外显子两端同源臂以及敲除外显子本身的基因组DNA片段，通过TA克隆方法将其克隆到TA克隆载体中约l天2.TA克隆酶切验证约l天3.送阳性克隆至测序公司测序约5-10天4.测序完毕后将敲除外显子装入pkdl-HZG约l天5.将包含双loxp位点，待敲除基因或外显子以及阳性筛选基因的片段返装入含有左右同源臂的TA载体，最终获得打靶载体约2天6.最后将获得的打耙载体送测序公司测序测序验证约5-10天同时，由于pKDL-HZG载体具有普遍、通用的使用价值，可以运用到现阶段几乎所有类型的基因敲除打靶载体构建系统，而且在时间，成本，出错率上相对于现有技术都有很明显的优点(见表2)。目前，运用这一载体已经成功顺利的构建了多个打靶载体。表2使用pKDL-HZG载体与使用现有技术构建打耙载体优劣比较<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>从上述实例可知，在现有技术的基础上，本发明首次公开了一种能用于基因敲除打靶载体构建的关键中间载体。采用本发明中间载体能简化构建打靶载体的实验路线，易化实验的操作，减少试验出错的几率；能从根本上縮短实验周期减少实验开支，为整个实验进程的顺利进行打下了坚实的基础；且使用范围广，市场前景广阔。序列表SEQUENCELISTING<110>四川大学华西医院<120>—种基因打靶用中间载体及其制备方法和用途<130>A070200<160>12<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>2068<212>DNA<213>Artificial<220><223>Artificial<220><221>misc一feature<222>(361)..(361)<223>nisa,c，g,ort<220><221>misc—feature<222>(1384)..(1384)<223>nisa，c,g，ort<220><221>misc一feature<222>(1445)..(1445)<223>nisa，c,g,ort<400>1ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcgaggtcgacctgcaggcggccgcg60aattcactagtgattatcgaattcccgcggccgccatggcggccgggagcatgcgacgtc120gggcccccctcgaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcgaggtcgacga180agttcctatactttctagag肌taggaacttcctcgacggtatcgataagcttctgatgg240aattagaacttggcaaaacaatactgagaatgaagtgtatgtggaacagaggctgctgat300ctcgttcttcaggctatgaaactgacacatttgga肌ccacagtacttag肌ccacaaag360nggg犯tcaag3g肌a肌caatgatcccacgagagatctatagatctatagatcatgagt420gggaggaatgagctggcccttaatttggttttgcttgtttaaattatgatatccaactat480gaaacattatcat肌agc肌tagt肌agagccttcagtaaagagcaggcatttatctaat540cccaccccacccccacccccgtagctccaatccttccattcaaaatgtaggtactctgtt600ctcacccttctt肌caaagtatgacaggaaaaacttccattttagtggacatctttattg660tttaatagatcatcaatttctgcagacttacagcggatcccctcagaagaactcgtcaag720aaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgta肌gcacgagg肌780gcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtc840ctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccatt900ttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcatcgccgtc960gggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttc1020gtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcg1080atgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcat1140tgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagc肌ggtgggatgacaggagatcctg1200ccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgac肌cgtcgagcac1260agctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcag1320ttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctga1380cagncgg肌cacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaa1440tagcutttccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatggccga1500tcccatattggctgcaggtcg肌aggcccggagatgaggaagaggag肌cagcgcggcag1560acgtgcgcttttgaagcgtgcagaatgccgggcctccggaggaccttcgggcgcccgccc1620cgcccctgagcccgcccctgagcccgcccccggacccaccccttcccagcctctgagccc1680agaaagcgaaggagcaaagctgctattggccgctgccccaaaggcctacccgcttccatt1740gctcagcggtgctgtccatetgcacgagactagtgagacgtgctacttccatttgtcacg1800tcctgcacgacgcgagctgcggggcggggggg肌cttcctgactaggggaggagtagaag1860gtggcgcgaaggggccaccaaagaacggagecggttggcgcctaccggtggatgtggaat1920gtgtgcgaggccagaggccacttgtgtagcgcc肌gtgcccagcggggctgcta肌gcgc1980atgctccagactgccttgggaaaagcgcctcccctacccggtagaattggccgcg肌gtt2040cctatactttctagagaataggaacttc2068<210>2<211>4967<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<220><221>misc_feature<222>(1037)..(1037)<223>nisa，c，g，ort<220><221>misc_feature<222>(2060)..(2060)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc—feature<222>(2121)..(2121)<223>nisa，c，g，ort<400>2ctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggtt狄gcgcagcgtga60ccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcg120ccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgat180ttagtgctttacggcacctcgaccccaa肌肌cttgattagggtgatggttc狄gtagtg240ggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaata300gtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatt360tat肌gggattttgccgatttcggcctattggtta肌aaatgagctgattt肌caa通aat420ttaacgcgaa簡aacaaaatatt肌cgcttacaatttccattcgccattcaggctgcg480caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagg540gggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttg600t肌aacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcg肌ttgccgcggta660ccgggceecccctcgaat肌cttcgtat肌tgtatgctatacg肌gttattcgaggtega720cctgcaggcggccgcgaattcactagtgattatcgaattcccgcggccgccatggcggcc780gggagcatgcgacgtcgggcccccctcgaataacttcgtataatgtatgctatacgaagt840tattcgaggtcgacgaagttcctatactttctagagaataggaacttcctcgacggtatc900gataagcttctgatggaattagaacttggc肌aacaatactgagaatgaagtgtatgtgg960aacagaggctgctgatctcgttcttcaggctatgaaactgacaca付tggaaaccacagt1020acttagaaccacaaagnggg肌tcaagagaaaaacaatgatcccacgagagatctataga1080tctatagatcatgagtgggaggaatgagctggcccttaatttggttttgcttgt"aaat1140tatgatatcc肌ctatga肌cattatcata肌gc肌tagtaaagagccttcagta肌gag1200caggcatttatctaatcccaccccacccccacccccgtagctccaatccttccattcaaa1260atgtaggtactctgttctcacccttcttaacaaagtatgacaggaaaaacttccatttta1320gtggacatctttattgtttaatagatcatc肌tttctgcagacttacagcggatcccctc1380agaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgatac1440cgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacggg1500tagcc肌cgctatgtcctgatagcggtccgccac狄ccagccggccacagtcgatg肌tc1560cagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacga1620cgagatcatcgccgtcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcga1680gcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtac1740gtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcg肌tgggcaggtagccggatc肌gcg1800tatgcagccgccgeattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtggg1860atgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtccctteccgcttcag1920tgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcg1980ctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgaca肌aag肌ccg2040ggcgcccctgcgctgacagncggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtg2100cccagtcatagccgaatagcntttccaccc肌gcggccggag肌cctgcgtgc肌tccat2160cttgttcaatggccgatcccatattggctgcaggtcgaaaggcccggagatgaggaagag2220gagaacagcgcggcagacgtgcgcttttgaagcgtgcagaatgccgggcctccggaggac2280cttcgggcgcccgccccgcccctgagcccgcccctgagcccgcccccggacccaccccttcccagcctctgagcccagaaagcg肌ggagc肌agctgctattggccgctgcccc肌agg2400cctacccgcttccattgctcagcggtgctgtccatctgcacgag狄tagtgagacgtgct2460acttccatttgtcacgtcctgcacgacgcgagctgcggggcgggggggaacttcctgact2520aggggaggagtag肌ggtggcgcg肌ggggccaccaaagaacggagccggttggcgccta2580ccggtggatgtgg肌tgtgtgcgaggccagaggccacttgtgtagcgccaagtgcccagc2640ggggctgcta肌gcgcatgctccagactgccttggga肌agcgcctcccctacccggtag2700aattggccgcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggccgccaccgcggtg"60gagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtc2820atagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccgg2880aagcata肌gtgt肌agcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgtt2940gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcgg3000ccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactga3060ctcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagetcaetcaaaggcggtaat3120acggttatccacagaatcaggggataacgcagg汪a级gaacatgtgagcaaaaggcc级gca3180肌aggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctcegcccccc3240tgacgagcatcacaaa级atcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactata3300aagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgcc3360gcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctc3420acgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacga3480accccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaaccc3540ggt肌gacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgag3600gtatgtaggcggtgctacagagttcttg肌gtggtggcct肌ctacggct狄actagaag3660gacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtag3720ctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagca3780gattacgcgcagaa汪aaaagg汪tctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctga3840cgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatt级tc级a级aaggat3900cttcacctagatcctttt肌att肌肌atg肌gtttt肌atcaatcta肌gt由tatga3960gtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctg4020tctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacggga4080gggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctcc4140agatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaac4200tttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgcc4260agtt肌tagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtc4320gtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccc4380catgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagtt4440ggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgcc4500atccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtg4560tatgcggcgaccgagttgctcltgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatag4620cag肌ctttaa肌gtgctcatcattgg肌aacgttc"cggggcg肌肌ctctc肌ggat4680cttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagc4740atcttttactttcaccagcgtttctgggtgagc肌肌acagg肌ggcaaaatgccgc肌a4800aaagggaata汪gggcgacacgg汪a汪tgttga汪tactcatactcttcctttttcaatatta4860ttgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacat汪tttgaatgt汪tttagaa4920aa由肌c肌ataggggttccgcgcacatttccccg肌aagtgccac4967<210>3<211>34<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<400>3ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat34<210>4<211>34<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<400>4gaagttcctatactttctagagaataggaacttc34<210>5<211>99<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<400>5tcgaggtcgacctgcaggcggccgcgaattcactagtgattatcgaattcccgcggccgc60catggcggccgggagcatgcgacgtcgggcccccctcga99<210>6<211>27<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<400>6gaattcaagtgatagagatcacctgac27<210>7<211>23<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<400>7gaattcaccctgggcaaactaga<210><211><212><213>822DNAArtificial<220><223>artificial<400>8gcttactgtcttgctcgtcatg22<210>9<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<400>9tcagatggtaggcgttgc18<210>10<211>27<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<400>10gatacacatcgaattgccgcggtaccg27<210>11<211>22<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<400>11tacgtaggagctccaccgcggt22<210>12<211>1209<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<400>12aagtgatagagatcacctgactgaagcaccgggatcaaaggcatgccacatcatgctctg60gggctgtgtgtgtgctgttttgatcactaatggcacttttatgtcaatcttgttatcaac120ctgactgaaatttagatttcgtttcatttacattttatttattatgtgctaaaccctaag180taaaatgaaacctttgtctatacacaggaaagccttccaagttagatgtgggagaatagg240cgaggtaggctgctcttggtagagtgcagcattggaaaggaaaatacc肌gacttggatt300tatacttgtcc付tcctgtagagttaggctataaatgatgatatgctaaagttgtttttt360ctctctttagtactggatgaatgaatacacctcatctattggaattggagUtttcattc420tggaattgaagtatatggcagaggtatgtgtgcacatagcttaaatatgttttctgagga480ttctgccagctttaaaagaaatacagaatcatgatgttaggtctttttgtctcttttctt540ttaagtaacttacatatgttgtagaaagtagaataaaactcccccatttgtttatactgt600ttcaaaaactgtctgtggtagcatacatttgttccattatctttttttctaattactatg660tcttctaaaacattttcttaaccagctctggtggcacacacttaatcccagtattcagga720ggcagaggcagagag汪ttcctgtgagtttgaagcc汪gcctagtatacagagtgagttcca780ggacagccagagctacacagtaagaetctgtcttaaaaacaaa汪acaaagaagccattgt840ttatgaagttatta肌ccatgattgtttttctttactatgtatcagagtttctaagaaac900ttgtacactttgaaaaaactacataacaaaaat肌tcattttagttagtagaagtgtcaa960actttaaataccattttctgagggagtttcagtagaatgttggatttggcaggcctgtga1020gcatcaataaagtctaagacattgctgagaaaatcttgtgttcagtaatatctagcattt1080ttctcagagttatagcgaaatatcattgtg肌ttataagcttgccctttagcaggaggtc1140ctgtacttggtagtctttgaactaggtagtctttgt肌cct肌aatacattatctagttt1200gcccagggt1209权利要求1、一种基因打靶用中间载体，其特征在于含有两个loxp位点序列和两端各连接一个frt位点序列的阳性筛选基因。2、根据权利要求1所述的基因打靶用中间载体，其特征在于所述的两个loxp位点序列之间还有一多克隆位点。3、根据权利要求1所述的基因打靶用中间载体，其特征在于所述的多克隆位点具有SEQIDNo.4所示的序列。4、根据权利要求1所述的基因打靶用中间载体，其特征在于所述的阳性筛选基因为pgkNEO基因。5、根据权利要求1所述的基因打靶用载体，其特征在于还含有抗性筛选基因的序列。6、根据权利要求15任一项所述的基因打靶用载体，其特征在于含有SEQIDNo.l所示的序列。7、根据权利要求16任一项所述的基因打靶用载体，其特征在于具有SEQIDNo,2所示的序列。8、一种制备权利要求17任一项所述的基因打靶用中间载体的方法，其特征在于包括以下步骤a、利用限制性内切酶HindIII和KpnI，分步将一个loxp位点，一个frt位点从pk-ll载体上切下并装入pCDNA3.1(+)载体上，克隆获得pCDNA3.1-frt-loxp;b、利用限制性内切酶Sail和BstXI，分步将loxp位点从pCDNA3.1-frt-loxp载体上切下并装入pGEM-Teasy载体上，克隆获得pGEM-Teasy-loxp;c、利用限制性内切酶Apal，将loxp位点从pGEM-Teasy-loxp载体上切下并装入pk-ll载体上，克隆获得目标载体。9、权利要求17任一项所述的基因敲除用中间载体在制备基因打靶载体中的用途。10、一种制备基因打耙载体的方法，其特征在于包括以下步骤a、扩增得到待敲除基因或外显子，通过多克隆位点将待敲除基因或外显子装入权利要求17任一项所述的基因敲除用中间载体中，酶切验证并测序；b、扩增含有待敲除基因或外显子及其两端同源臂的基因组DNA片段，通过TA克隆方法将其克隆到TA克隆载体中，并测序验证；c、利用待敲除基因所选定外显子两端的限制性内切酶酶切位点，通过PCR扩增，将步骤a所得载体中含双loxp位点、待敲除基因或外显子以及阳性筛选基因的片段返装入含有步骤b所得的TA载体中，获得打靶载体。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，具体地涉及一种基因打靶用中间载体及其制备方法和用途。基因打靶用中间载体含有两个loxp位点序列和两端各连接一个frt位点序列的阳性筛选基因。本发明从构建打靶载体的根本出发，在以往实验方法的基础上，首次开发出了一种能用于基因敲除打靶载体构建的中间载体。由于该载体具有普遍、通用的使用价值，可以运用到现阶段几乎所有类型的基因敲除打靶载体构建系统，而且简化构建打靶载体的实验路线，易化实验的操作，减少试验出错的几率；节约时间，降低成本，相对于现有技术都有很明显的优点，使用范围广，具有很好的应用市场前景。文档编号C12N15/63GK101397570SQ20071005016公开日2009年4月1日申请日期2007年9月29日优先权日2007年9月29日发明者吕小岩,钦周,铮张,胡忠国,魏于全申请人:四川大学华西医院