专利名称：固定化脂肪酶催化合成α－亚麻酸单甘油酯的方法
技术领域：
本发明属于抗癌药物原料的合成方法技术领域，特别涉及一种通过固定化脂肪酶法催化合成抗癌药物原料α-亚麻酸单甘油酯的方法。
背景技术：
α-亚麻酸单甘油酯主要存在于中药薏苡仁中。α-亚麻酸单甘油酯作为一种非细胞毒性抗癌物质，具有抑制肿瘤生长，调节机体免疫功能的作用。其作用环节主要是诱导细胞凋亡，并能逆转耐药的肿瘤细胞，与化疗有协同作用。在临床上，薏苡仁主要用于治疗鼻咽癌。
α-亚麻酸单甘油酯传统的制备方法是从原料药薏苡仁中通过有机溶剂进行提取，与本发明相近的现有技术是一篇论文，名称为“油相干燥法制备薏苡仁酯微胶囊最佳工艺研究”，源自《时珍国医国药》2006年第17卷第1期。其方法主要采用丙酮分3次对薏苡仁粉末进行提取，得到粗提掖后，加入石油醚，滤除白色絮状物，滤液减压蒸馏，得到薏苡仁提取液。然而，传统的方法有很多的缺点(1)原料药薏苡仁价格较高，并且薏苡仁本身含有α-亚麻酸单甘油酯的量很少(约为1.31％)；(2)提取工艺非常复杂，提取物纯化困难，费用高；(3)制备过程中大量使用有机溶剂，导致药物中有机溶剂残留量超标。因此采用传统制备方法，严重地阻碍了α-亚麻酸单甘油酯作为抗癌药物的原料的广泛应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，1.通过对介孔材料进行扩孔以及表面修饰，通过交联法使脂肪酶分子组装进载体孔道中，从而保证介孔材料固定化酶在有机相中的高稳定性，以及维持脂肪酶的原活性；2.在有机介质正己烷或乙酸乙酯中合成治疗癌症的药物原料α-亚麻酸单甘油酯。
介孔分子筛孔道中功能材料的组装，特别是生物大分子酶蛋白的组装固定，是目前国际上介孔材料研究的热点之一。由于介孔材料孔径的限制，组装固定的基本都是小分子量的酶，而实际应用的一些酶类分子量往往很大，如脂肪酶的分子量约30000左右，酶分子的平均动力学直径约为5nm。常规方法合成的介孔材料SBA-15的孔径虽然能够能达到6nm，但通过实验证明，脂肪酶只能吸附到材料表面，而不能进入孔道内。
本发明的技术方案包括将脂肪酶在扩孔后的SBA-15中进行组装制成固定化酶，再将固定化酶在有机介质中进行α-亚麻酸单甘油酯的合成。
本发明的固定化脂肪酶催化合成α-亚麻酸单甘油酯的方法具体过程如下步骤A.制备固定化酶载体以三嵌段共聚化合物P123(EO20PO70EO20)为模板剂，用盐酸(HCl)调节pH值，水为溶剂，正硅酸乙脂(TEOS)为硅源、乙醇为扩孔剂；摩尔配比为如下范围0.8～1.0模板剂/40～60硅源/300～350HCl/7500～10000H2O/300～350扩孔剂；将P123溶于水中，加入盐酸搅拌溶解；加入正硅酸乙酯(TEOS)在50℃～60℃恒温搅拌30～45min后加入乙醇，搅拌后装入反应釜中，在100℃烘箱中放置48小时；将产物过滤，洗涤，干燥，再经过500℃～550℃灼烧6～8小时可完全除去表面活性剂，得到介孔材料，产品名称为SBA-15/80。将介孔材料SBA-15/80分散于水中，二者质量∶体积比为1g∶20～50ml，加热回流3～4h，混合物冷却后离心分离，除去水分，白色固体在空气中干燥5～6天。取水合后的介孔材料先后加入100～150ml甲苯和10～20ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加热回流4～6h。反应结束后，产物过滤，经氯仿洗涤，室温干燥，即得白色产物固定化酶载体，记为NH2-SBA-15/80。
步骤A对介孔材料SBA-15进行了扩孔和修饰。扩孔和修饰后的固定化脂肪酶载体可通过X射线衍射，透射电镜，红外光谱，热重-差热分析进行表征。
步骤B.制备固定化脂肪酶取介孔材料NH2-SBA-15/80(固定化酶载体)与交联剂戊二醛，在搅拌情况下反应2～4h，之后用磷酸缓冲液(PBS)洗涤以除去未反应的戊二醛。再向介孔材料NH2-SBA-15中加入20～40ml脂肪酶溶液反应4～6小时；按质量体积比为1g固定化酶载体/20ml～40ml交联剂/20～40ml脂肪酶溶液；最后用PBS洗涤并离心，直到在溶液中检测不到蛋白为止。脂肪酶溶液的浓度可以是16～20mg/ml。
一般情况下可以在离心转速5000rpm下离心10～15min即可。
前述的脂肪酶最好是假丝酵母脂肪酶或铜绿假单胞菌脂肪酶。交联剂也可以使用鞣酸。
步骤C.α-亚麻酸单甘油酯的合成取0.5～1g上述合成的固定化酶，加入有机溶剂正己烷或乙酸乙酯，搅拌均匀。再加入等摩尔量的浓度分别为20～30mmol/ml和25.0～30.0mmol/ml的亚麻酸和甘油各18～22ml。混合液在20～50℃水浴震荡器中，孵育5～15min。最后，过滤反应混合液，去除固定化酶，然后减压蒸发正己烷。残留物为产品α-亚麻酸单甘油酯，一种薏苡仁酯。通过高效液相色谱定性，定量测定，其产率为75～80％。
由本发明得到的α-亚麻酸单甘油酯颜色浅黄，品质高，酶组装进分子筛后热稳定性增强，可以保证介孔材料固定化酶在有机相中的高稳定性，以及维持脂肪酶的原活性；得到的α-亚麻酸单甘油酯疗效确切，低成本，易于连续化生产，从而为工业化奠定了基础。
表1给出固定化脂肪酶与吸附法的操作稳定性比较数据。
由于测定脂肪酶的活性过程中，加入有机溶剂终止反应，从而造成酶无法回收利用，所以采用通过测定酶从载体上脱落的实验来间接反映固定化酶的操作稳定性。酶泄漏结果见表1，用本发明的交联法制备的固定化酶洗涤5次后酶从载体SAB-15/80上脱落累计仅1％，而用吸附法制备的固定化酶，洗涤5次后已有累计34％的酶从载体脱落。结果表明，交联法制备的固定化酶稳定性高，有望在应用于工业生产中。
表1固定化脂肪酶的操作稳定性
本发明的方法中，采用对脂肪酶载体进行了扩孔和修饰，使介孔材料的孔径达到8～12nm，修饰后SBA-15仍呈规则的六方结构，由于孔道均匀，孔径大，保证了α-亚麻酸单甘油酯合成的需要；本发明的方法操作稳定性好；反应条件温和，酶与产物易分离且酶可回收重复使用，低成本，易于连续化生产，有利于大规模工业生产；脂肪酶最适温度提高，这有助于产品产率提高，转化率可达70～80％。
图1为本发明的固定化脂肪酶载体NH2-SBA-15/80的X射线衍射图；图2为本发明的固定化脂肪酶载体NH2-SBA-15/80的透射电镜图；图3为SBA-15(a)与本发明的NH2-SBA-15/80(b)的红外图谱；图4为本发明的固定化脂肪酶载体NH2-SBA-15/80的热重-差热分析图；图5为已有的脂肪酶(▲)和本发明的固定化脂肪酶(■)的最适反应温度曲线图；图6为已有的脂肪酶(▲)和本发明的固定化脂肪酶(■)的最适反应pH曲线图；图7为本发明的固定化脂肪酶的米氏常数(Km)曲线图；图8为已有的脂肪酶(▲)和本发明的固定化脂肪酶(■)的热稳定性曲线。
具体实施例方式
实施例1介孔材料SBA-15的扩孔修饰及表征将0.8g三嵌段共聚化合物P123(Pluronic P123)溶于去离子水中，待P123完全溶解后加入盐酸中，搅拌溶解。该混合物在50℃～60℃恒温搅拌30～45min后加入3ml乙醇，搅拌后装入反应釜中，在100℃烘箱中放置48小时。将产物过滤，洗涤，干燥。再经过500℃～550℃灼烧6～8小时至完全除去表面活性剂。产品名称为SBA-15/80。
将介孔材料SBA-15/80溶于去离子水中，质量∶体积比为1g∶30ml，加热回流3.5h，混合物冷却后离心分离，除去水分，白色固体在空气中干燥6天。取水合后的介孔材料先后加入130ml甲苯和15mlAPTES，加热回流5h。反应结束后，产物过滤，经氯仿反复洗涤，室温干燥，即得白色的固定化酶载体产物，经修饰后的固定化酶载体记为NH2-SBA-15/80。
将合成的固定化酶载体通过X射线衍射，透射电镜，红外光谱，热重-差热分析进行表征。见说明书附图1～4。
由图1，本发明的固定化脂肪酶载体NH2-SBA-15/80的X-射线衍射图可以辨别出三个衍射峰，经计算可分别归属为二维六方晶系100、110和200晶面的衍射峰。所以，修饰过程没有造成SBA-15结构的破坏，其仍保持原有结构。
由图2透射电镜照片可以看出NH2-SBA-15/80仍呈规则的六方结构，孔道均匀，保证了之后的α-亚麻酸单甘油酯合成的需要。
图3是溴化钾(KBr)压片，在Impact410 FT-IR光谱仪上测定NH2-SBA-15/80的红外光谱(IR)，测量范围400～4000cm-1。从图3中可以看出，SBA-15/80分子筛在用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰之后，出现了两个新峰，位置为2934cm-1和1564cm-1，这两个谱带可分别归属为C-H键的伸缩振动和伯胺中的N-H键的弯曲振动。此结果说明产物中存在-CH2NH2基团。另外，SBA-15中位于960cm-1处的峰代表Si-OH的弯曲振动，它在经硅烷修饰之后基本消失，这说明分子筛表面的硅羟基与有机硅烷发生了反应。由此可以证明3-氨丙基三乙氧基硅烷已经与分子筛表面的硅羟基充分发生了反应从而将-NH2引入分子筛的表面。
图4为氨基修饰后的SBA-15/80的热重-差热分析图。差热分析(b)结果显示307.2℃为SBA-15/80表面修饰的NH2基团降解的放热峰，这同时表明已有NH2基团修饰在SBA-15/80表面，热重图谱(a)显示，100℃时质量下降为水分损失，之后平台期无物质分解，然后氨基开始降解，到第二个平台出现降解完全。根据热重图谱可计算出氨基的修饰量为1.57mmol/g载体。
在实施例1中，各原料的用量及工艺条件有微小的增减(在本发明内容的范围内)，对制备固定化酶载体NH2-SBA-15/80基本没有影响。
实施例2固定化脂肪酶的组装及其最适条件确定取实施例1制得的介孔材料NH2-SBA-15/80与戊二醛，按质量∶体积比为1g∶30ml，在搅拌情况下反应3h，之后用磷酸缓冲液洗涤以除去未反应的戊二醛。再向介孔材料中加入30ml假丝酵母脂肪酶溶液反应5小时，最后用PBS洗涤并离心(5000rpm，13min)，直到在溶液中检测不到蛋白为止。
本实施例中的假丝酵母脂肪酶用铜绿假单胞菌脂肪酶替代，用法相同，二者的效果亦相同。
固定化脂肪酶的最适温度，最适pH，米氏常数(Km)的确定以及热稳定性，见说明书附图5～8。
图5显示了脂肪酶固定前后最适温度的变化，即酶被固定后最适温度由50℃提高到70℃，在80℃时仍能保持85％以上的活力。由于高温可以提高反应速度，降低细菌的污染机率，提高底物溶解度，从而提高产率，所以脂肪酶最适温度的提高有助于生产。
图6显示了脂肪酶固定前后最适pH的变化，脂肪酶被固定后最适pH是9.0，和溶液酶相比，最适pH没有改变。
见图7，由于脂肪酶的底物为橄榄油，系混合物，分子量不确定，故Km值以百分浓度表示，而不是摩尔浓度。溶液酶的Km值为4.27％，而固定化酶为5.6％，与溶液酶相比，表明通过交联固定脂肪酶，Km值略有升高，其原因推测为孔道经修饰后使酶与底物接触存在障碍所至。
图8是将固定化脂肪酶(■)和溶液酶(▲)的热稳定性进行比较。将固定化脂肪酶样品在50℃下分别保温一定时间，迅速冷至室温后，测定酶活力。测定结果显示将脂肪酶通过交联法被介孔材料固定后其热稳定性明显增强，即使在保温6h.仍保留活力75％，而溶液酶保温6h后已无活力，说明酶组装进分子筛后热稳定性增强。
在实施例2中，各原料的用量及工艺条件有微小的增减(如本发明内容的范围内)，对固定化脂肪酶的组装影响不大。
实施例3固定化酶在有机相中合成α-亚麻酸单甘油酯取1g实施例2合成的固定化酶，加入有机溶剂正己烷，搅拌均匀。加入亚麻酸，甘油(加入量各20ml)，最初浓度分别为25mmol/ml和30.0mmol/ml。混合液在恒温水浴震荡器中，20～50℃孵育一定时间。最后，过滤反应混合液，去除固定化酶，然后减压蒸发正己烷。残留物为产品α-亚麻酸单甘油酯，一种薏苡仁酯。通过高效液相色谱定性，定量测定，其产率为75～80％。
本实施例中，有机溶剂正己烷可以用乙酸乙酯替代。
本实施例中，各原料的用量有微小的增减(如本发明内容的范围内)，也是能够合成适合应用的药物原料α-亚麻酸单甘油酯的。
权利要求
1.一种固定化脂肪酶催化合成α-亚麻酸单甘油酯的方法，有制备固定化酶载体、制备固定化脂肪酶和α-亚麻酸单甘油酯的合成的工艺过程所说的制备固定化酶载体是，以三嵌段共聚化合物P123为模板剂，用盐酸调节pH值，水为溶剂，正硅酸乙脂为硅源、乙醇为扩孔剂；按摩尔配比为0.8～1.0模板剂/40～60硅源/300～350HCl/7500～10000H2O/300～350扩孔剂；将模板剂溶于水中，加入盐酸搅拌溶解，加入正硅酸乙酯在50℃～60℃搅拌30～45分钟后加入乙醇，搅拌后装入反应釜中，在100℃烘箱中放置48小时；将产物过滤，洗涤，干燥，再经过500℃～550℃灼烧6～8小时，得到介孔材料；按质量体积比为1g介孔材料/20～50ml水将介孔材料分散于水中，加热回流3～4小时，混合物冷却后离心分离，除去水分，白色固体在空气中干燥5～6天；取水合后的介孔材料先后加入甲苯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，加热回流4～6小时，其中按质量体积比为1g水合后的介孔材料/100～150ml甲苯/10～20ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷；反应结束后，产物过滤，经氯仿洗涤，室温干燥，即得白色产物固定化酶载体；所说的制备固定化脂肪酶是，取固定化酶载体与交联剂戊二醛或鞣酸在搅拌情况下反应2～4小时，之后用磷酸缓冲液洗涤除去未反应的交联剂；再加入20～40ml脂肪酶溶液反应4～6小时；按质量体积比为1g固定化酶载体/20ml～40ml交联剂/20～40ml脂肪酶溶液；最后用磷酸缓冲液洗涤并离心，直到在溶液中检测不到蛋白为止；所说的α-亚麻酸单甘油酯的合成是，将固定化脂肪酶加入到有机溶剂正己烷或乙酸乙酯中，搅拌均匀，再加入等摩尔量的浓度分别为20～30mmol/ml和25.0～30.0mmol/ml的亚麻酸和甘油，按质量体积比为1g固定化脂肪酶/18～22ml亚麻酸；混合液在20～50℃水浴震荡器中孵育5～15分钟；最后，过滤反应混合液，去除固定化酶，然后减压蒸发有机溶剂，残留物为产品α-亚麻酸单甘油酯。
2.按照权利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成α-亚麻酸单甘油酯的方法，其特征在于，所说的脂肪酶是假丝酵母脂肪酶或铜绿假单胞菌脂肪酶。
全文摘要
本发明的固定化脂肪酶催化合成α－亚麻酸单甘油酯的方法属用于一种抗癌药物原料的制备方法领域。步骤有制备固定化酶载体、制备固定化脂肪酶、α－亚麻酸单甘油酯的合成的过程。其中制备固定化酶载体过程包括对介孔材料SBA－15的扩孔和氨基修饰；最后将固定化酶在有机介质中进行α－亚麻酸单甘油酯的合成。本发明方法操作稳定性好、修饰后SBA－15仍呈规则的六方结构，孔道均匀，孔径大，保证了α－亚麻酸单甘油酯合成的需要；脂肪酶最适温度的提高有助于产品产率提高；反应条件温和，酶与产物易分离且酶可回收重复使用，低成本，有利于大规模连续化工业生产得到的产物颜色浅黄，品质高，疗效确切，热稳定性增强。
文档编号C12N11/00GK101058820SQ20071005563
公开日2007年10月24日 申请日期2007年5月15日 优先权日2007年5月15日
发明者高波, 滕利荣, 孟庆繁, 王博 申请人:吉林大学