一种具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

专利名称：一种具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明公开了一种具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法 背景技术自然界生物体内广泛存在着一种抗菌多肽，过去由于哺乳动物存在有效的抗原特异性反 应因而长期没有引起重视。然而近年来由于抗菌肽的缺失或失活引起的各种疾病，尤其是越 来越多的对经典抗生素耐药性的出现，使得抗菌肽重新受到研究者的重视。抗菌肽研究的真正兴起是从20世纪80年代初开始的。1980年，Bontan等人从美国天蚕蛹中 分离得到了具有抗菌活性的多肽——cer叩ins,并于次年在Nature上公布了其氨基酸序列。 同年，Hirsh等人从兔的巨噬细胞中分离到了另一种抗菌性多肽——防御素(defensins)，并 于3年后公布了其氨基酸序列。在过去20多年，已发现500多种防御素，有的种类分布极广。 其中某些防御素对一些致病细菌和真菌具有很强的抗性。防御素与常规的抗生素不同，抗生素是通过一系列酶合成的产物，而防御素则是某个特 定基因编码的产物。在杀菌机制上，抗生素一般是通过抑制细菌细胞壁、蛋白质或DNA等的 合成来达到杀菌的目的，所以抗生素的抗菌一般是用特殊的受体，细菌容易通过变异对抗生 素产生抗性，而防御素抗菌时一般没有特殊的受体，它一般是通过物理作用造成细胞膜的穿 孔而达到广谱抗菌的效果，所以防御素的使用不容易产生抗性和交叉抗性。许多已报导的防御素基因都已在大肠杆菌中表达，但表达水平低、多肽不能分泌，而且 提取有很大困难，离工业化应用的目标还有一定的距离，所以人们将目光转向了酵母表达系 统。酵母表达系统是近年来兴起的一个真核高效表达系统,具备独特的优点菌体自身分泌蛋 白较少，外源目的基因通过整合型质粒进入酵母染色体组，结构比较稳定，特别是可对表达的
外源蛋白进行翻译后修饰和加工,如二硫键的形成、糖基化等，在表达外源基因方面应用越来 越广泛，并且己经建立了合适的培养方法，操作简单。目前应用的酵母表达系统有酿酒酵母 (& cc/jflramy c^cerevWea)、 巴斯德毕赤酵母(P!'cWa paWonj )和粟酒裂殖酵母 (Sc/nz仍acc/ ara，c^pom6e)系统。用粟酒裂殖酵母作为宿主直到最近才引起重视，国外目 前利用裂殖酵母成功表达外源蛋白的例子很多，但国内研究报道极少。粟酒裂殖酵母与其它 的酵母相比在进化上更高级，2002年2月基因组的测序及其各基因功能的取得更有利于研究外 源蛋白在粟酒裂殖酵母中的表达。粟酒裂殖酵母(S.pom&)是一种单细胞的、真核生物，拥有同高等生物极其相似的属性-染色体结构和功能、细胞循环的控制以及RNA的拼接，这些属性使S.pom&成为生产真核蛋白 的理想系统。5^om&被用来通过基因互补来克隆真核基因，意味着在S.;wm6e中异质基因的 表达是活跃的。利用各种表达构建大量的polyoma virus middle-T抗原、the human antithrombin III、 the human liver epoxide hydrolase 、 the human blood coagulation factor XIIIa、 the human lipocortin I 、 rat arginase、 rat NDP-kinase、 human interleukin-6(IL-6)、 Arabidopsis thaliana sugar transporter STP1等高等真核基因，已在S./ww&被表达和纯化。

发明内容
本发明的目的是提供一种具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。 本发明所提供的重组粟酒裂殖酵母工程菌，是将构建的含有防御素基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中获得的。本发明所提供的重组粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法是将防御素基因插入到粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的多克隆位点处，将构建的该重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵
母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母使防御素基因得到表达。本发明所述的防御素基因来源于绿豆基因组DNA，为绿豆防御素基因(Dl)，其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所述，以粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2为出发载体,构建含有防御素基 因的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESP-2-Dl。本发明选用五SP表达系统，采用pESP-2质粒作为表达载体。这种质粒源自；^/m"ctz>/ /严噬菌粒且由如下四部分组成(l)一个ColE I复制起始点和氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance.Amp+)，其允许在大肠杆菌(￡ co/力克隆时进行载体的复制和抗生素选择；(2)—个 arsl序列可以提供在粟酒裂殖酵母0^o附6e)中使载体自动复制所需要的复制起始点；(3)选择 标记基因LEU2-d，源自酿酒酵母可以作为向粟酒裂殖酵母(S.pom&)细胞中转化表达结构的选 择标定物；(4)一个表达盒，包括粟酒裂殖酵母(S.jwm6e)全长的nmtl启动子(Pn础)-终止子 (Tnmtl)，其中夹着一个GST(glutathione S-transferase)基因和一个多克隆位点(multiple cloning site,MCS)。 pESP-2的MCS处有一个N端使之与GST相结合。带有PnmtI的表达载体被广泛应用于活体基因功能的研究。该载体是含有融合蛋白(GST)、防御素基因、Pnmrt启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2—Dl。 pESP-2质粒 的物理图谱如图l所示。本发明所述防御素基因位于粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处的Nhel和BglII限制 性内切酶酶切位点之间。本发明所述筛选标记有两种， 一种为氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistanceAmp+)，其 允许在大肠杆菌克隆时进行载体的复制和抗生素选择； 一种为选择标记基因LEU2-d，源自酿 酒酵母可以作为向粟酒裂殖酵母(5.;^附^)细胞中转化表达结构的选择标定物。
本发明所述的粟酒裂殖酵母表达载体以PESP-2为出发载体，构建含有D1基因的重组表达 载体为pESP-2-Dl,获得的重组粟酒裂殖酵母工程菌为SP-Q01/pESP-2-D1。本发明所提供的防御素基因表达的方法，是将构建的含有防御素基因的重组粟酒裂殖酵 母表达载体pESP-2—D1的质粒DNA，采用电穿孔法导入粟酒裂殖酵母SP-QOl中，获得重组 粟酒裂殖酵母转化子，培养重组酵母转化子使防御素基因得到表达，重组酵母表达的时间为 2-6天。本发明具有以下优点本发明所提供了具有防御素活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法，弥补了传统防御素制备方法以及原核表达系统、酿酒酵母和毕赤酵母表达系统的不足。(1) 防御素基因在原核表达系统大肠杆菌中表达会对宿主菌构成较大伤害，而且提取有 很大困难，离工业化应用的目标还有一定的距离。(2) 虽然粟酒裂殖酵母属于酵母类，但粟酒裂殖酵母与其它的酵母相比在进化上更高级， 其类似的操作技术也能应用于其它的酵母，但很多性质不同于芽殖的酿酒酵母，如本发明所 用的是含有内含子的防御素基因转入酿酒酵母中不能表达，但同样的基因在粟酒裂殖酵母中 却获得了表达，其产物表达水平高，并具有正常的生物学活性。这样在进行工程菌构建时就不 需要提取总RNA在进行反转录来克隆防御素基因，只需要提取其总基因组DNA,成本低、省时 省力。(3) 本发明所用的粟酒裂殖酵母表达菌株是SP-Q01,是用于ESP酵母表达和纯化系统 中的单倍体菌株，含有h—交配型的和leul-32基因型，这个表达菌株包括一个变异的LEU1基 因，它编码亮氨酸生物合成必备的3-丙基脱氢酶，LEU1基因突变导致亮氨酸营养缺陷。而选 用的表达载体却含有选择标记基因LEU2-d，就可以通过基因互补直接对转化子进行筛选，提
高了筛选效率；而毕赤酵母系统需要用价格昂贵的抗生素进行筛选。(4)本发明所获得的工程菌在进行培养使防御素基因获得表达时，无需加入诱导物，弥 补了传统防御素制备方法以及原核表达系统、酿酒酵母和毕赤酵母表达系统的不足。S./wm6e 中的PnmU被培养基中硫胺(维生素B,)的浓度严格调控，当培养基中含X).5pM硫胺时，Pnmtl 就被强烈的抑制，防御素基因不表达，而当培养基中不含硫胺时，启动子的诱导率约为400 倍，防御素基因高度表达。防御素产品因具有广谱抗菌作用，对畜禽有促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副 作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。由于防御素分子小，分离提取存在一定 的困难，故天然资源有限。但其分子空间结构较大，能耐受词料制粒时的高温。本试验采取 基因工程方法，利用粟酒裂殖酵母表达系统表达生产防御素，规模化发酵生产防御素。产品 在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题。防御素以工程菌工业化发酵生产 的方法可大规模生产，生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响。防御素基因在 酵母中克隆并表达成功，为进一步研究防御素的抗菌活性、影响因素和其在医药、畜牧业生 产上的应用奠定基础，防御素有望成为替代抗生素的无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性 的新型词料添加剂和抗菌药物抗生素在疾病防治中具有非常重要的地位。因此，若将发明应 用于工业化防御素的生产，则具有生产规模大，防御素活性高，生长周期短，提取成本低的 优点，具有重要的实际意义和广阔的开发前景。


图1为粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的物理图谱。图2为含有防御素基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体构建流程图。
图3为防御素基因PCR扩增结果。图4为重组克隆载体pMD18-T-Dl的PCR和酶切鉴定。图5为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-Dl的PCR鉴定。图6为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-Dl的酶切鉴定。图7为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-Dl的电穿孔转化子。图8为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-Dl质粒DNA的PCR鉴定。图9为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-Dl表达产物的SDS-PAGE分析。图10为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-Dl表达产物抑菌活性检测结果。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、防御素基因的克隆1、 以东北绿豆(Mgrarafifeta)为材料，采用改良的CTAB法进行基因组DNA的提取。2、 引物设计根据GenBank已发表的防御素基因Dl (GenBank的登录号为AY437639)的DNA序列， 应用PrimerPremier5.0引物设计软件分别设计一对特异性引物，为了便于定向克隆和载体构 建，在上游引物和下游引物的5'端分别加入限制性内切酶位点和保护碱基(画线部分为加入 的酶切位点)Dl上游引物5'-TTT GCTAGCTTG GAT CCA CCT CAA CAA TTC ATC ACT C -3， (Nhel) 下游引物5'-GGT AGA TCT GGG AAT TCC GAA AAG GGT TCAACA G -3' (BglII) 3、防御素基因的PCR扩增以东北绿豆(K/卵a raoYate) DNA为模板，通过PCR扩增防御素基因的DNA片段，PCR
扩整的反应体系使用大连宝生物公司的Taq酶。PCR反应结束后，全量反应液进行1%琼脂 糖凝胶电泳检测反应产物，结果如图3所示图3为防御素基因电泳检测图(泳道1、 2为 PCR产物，泳道3为DNA分子量标准)泳道l、 2在355bp处有一条清晰条带，所得结果与预 期结果相符。绿豆防御素基因(Dl)的核苷酸序列如SEQ ID NO. l所述。4、 重组克隆载体的构建PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，采用V-gene公司的DNA Gel Extraction Kit回收 目的片断。将回收的目的片段分别克隆到pMD18-T Vector,进行蓝白斑筛选。在Eppendorf 管内配制10pl反应体系，混匀16'C反应16h。反应液直接转化大肠杆菌DH5a感受态细胞， 用含50mg/mlAmp+的LB抗性平板37。C培养过夜进行筛选。5、 对阳性菌落进行鉴定1) 重组克隆载体质粒DNA的提取对于每一个连接，挑取在上述抗生素平板上长出的单菌落接于5ml含50mg/ml Amp+的液 体LB培养基中，190rpm, 37'C过夜培养。次日，取400y 1菌液于1. 5mlL离心管中，加80% 甘油存于-80'C冰箱。其余菌液用碱裂解法提取质粒DNA。2) 重组克隆载体质粒DNA的PCR和酶切检测以重组质粒認A为模板，分别PCR扩增防御素基因，反应体系和反应条件同上；同时对 重组质粒DNA做限制性内切酶双酶切(Nhel和BglII)， 酶切体系20u 1，混合液置于37')C 反应3h。反应结束后，对PCR和酶切产物进行1% Agarose凝胶电泳，观察片段的位置和大 小。结果如图4所示图4为Dl基因电泳检测图(泳道1为酶切产物，泳道2为20ulPCR 产物)泳道l、 2在355bp处各有一条清晰条带，结果与预期结果相符，初步证明克隆载体构
建成功。将PCR和酶切鉴定都正确的重组克隆载体分别命名为pMD18-T-Dl，然后将保存的菌液 送去测序，测序由北京三博远志公司完成。Dl测序结果与Genebank AY437639防御素Dl基因 同源性达99.08%，表明所克隆的防御素基因都正确，达到预期目的。 实施例2、防御素基因重组粟酒裂殖酵母表达载体的构建含有目的基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-Dl的构建过程如图2所示,具体步骤 如下1、 重组粟酒裂殖酵母表达载体的构建碱裂解法大量提取重组克隆载体pMD18-T-Dl和表达载体pESP-2(购自美国Stratagene公司) 质粒DNA，然后分别双酶切重组克隆载体pMD18-T-D1和粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2。酶切 体系20u 1， pMD18-T-D1和pESP-2用限制内切酶Nhel和BglII双酶切，37。C酶切3h。反应 结束后，全量反应液于1%的琼脂糖凝胶电泳，分别回收DNA。最后分别用T4DNA连接酶连接 目的片段和载体，反应体系10ul，混匀，16'C反应16h。反应液直接转化大肠杆菌DH5a感 受态细胞，用含50mg/mlA卿+的LB抗性平板37'C培养过夜进行筛选。2、 重组粟酒裂殖酵母表达载体的鉴定1) 重组粟酒裂殖酵母表达载体质粒DNA的提取对于每一个连接，挑取在上述抗生素平板上长出的单菌落接于5ml含50mg/ml AmP+的液 体LB培养基中，190rpm， 37。C过夜培养。次日，取400ul菌液于1. 5mlL离心观管中，加 80%甘油存于-8(TC冰箱。其余菌液用碱裂解法提取质粒DNA。2) 重组粟酒裂殖酵母表达载体PCR和酶切鉴定 以重组表达载体质粒DNA为模板，分别对表达载体质粒进行PCR扩增和限制性内切酶双 酶切，反应体系和反应条件同重组克隆质粒的PCR检测和酶切检测。反应结束后，对PCR和 酶切产物进行1% Agarose凝胶电泳，观察片段的位置和大小。结果如图5、 6所示图5为 重组粟酒裂殖酵母表达载体PCR电泳检测图(泳道1为DNA分子量标准，泳道2为PCR产物)； 图6重组粟酒裂殖酵母表达载体酶切电泳检测图(泳道1、 2为酶切产物，泳道2为DNA分子 量标准)，结果与预期结果相符，证明重组表达载体构建成功，将PCR和酶切鉴定都正确的为 阳性菌种命名为pESP-2-Dl。实施例3、重组粟酒裂殖酵母表达载体的转化及鉴定1、 碱裂解法大量提取重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-Dl的质粒DNA。2、 电穿孔转化法宿主菌SP-Q01YCD培养基酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水解酪蛋白2g，山梨醇218.6g溶于1L蒸馏水中 1.2M山梨醇218.604g山梨醇溶于1L蒸镏水中。 EMM培养基(L):15.5mM lllmM0.1%(v/v)1000X stock邻苯二甲酸氢钠14.7mM Na2HP04 NH4C1 93.5mM 葡萄糖Salts2 %(v/v) 50Xstock Vitamins Minerals 0.01%(v/v)10000X stock Salts (50Xstock) (L)MgCl2' 6H20 0.26M CaCl2* 2H20 4.99mM KC1Vitamins (1000X stock)0.67M Na2S0414.1mM泛酸 肌醇4.20mM 烟酸55.5mM 生物素81.2mM 40.8UmMinerals (10000X stock) (L)硼酸80.9mM MnS04ZnS04 7H2013.9mM FeCl3* 6H20钼酸2.47 mM KI23.7mM7.40mM6.02mM47.6mMCuS04 5H20 1.60mM 拧檬酸1)酵母感受态细胞的准备(1)将酵母单菌落过夜培养于lOmlYCD液体培养基中30°C， 190rpnu(2)次日将10ml菌液转入250mlYCD中30°C, 250rpm过夜培养，至0D6。。=0. 7C(3)将细胞放到冰浴上15min，使其停止生长((4)轻轻将细胞倒入无菌250ml离心管中，3000rpra, 15min， 4 °C,收集菌体c(5)弃上清，将收集细胞的离心管置于冰上。(6)每管加入50ml灭过菌的冰上预冷的1.2M山梨醇悬浮细胞沉淀，加山梨醇至 250ml，3000g, 5min，4。C，收集菌体，弃上清。(7)重复步骤6。(8)加入20ml灭菌冰上预冷的1. 2M山梨醇悬浮沉淀，每管分装200 y 1，将细胞放到冰上,尽可能快的用于电击-2)用BIO-RAD MicroPluser进行电击(1) 将预转化的质粒DNA(约Wg)加入到200 u 1感受态细胞中，混均。(2) 将MicroPluser设为"ShS"。(3) 将DNA细胞样品转入0. 2cm已预冷的电击杯中，轻轻敲打管底悬浮液，1. 5kv， 25PF， 200 Q， 4.48ms电击一次。(4) 将杯拿出，加入冰冷的1. 2M山梨醇0. 8ml，然后将稀释的细胞转入到灭菌的离心管中。(5) 室温下，将离心管室温放置40-60min，使电击细胞在1. 2M山梨醇的微量培养基中培养 生长。(6) 将液体平铺于EMM-thiamine筛选培养基平板上，3(TC培养4 6天，直到长出单菌落。 结果如图7所示图7为pESP-2-Dl筛选出的酵母转化子。3、重组粟酒裂殖酵母转化子的分子鉴定1) 挑取E画-thiamine筛选培养基平板上的单菌落于E醒-thiamine液体培养基中，30 'C培养2天，使用试剂盒提取酵母质粒，将质粒DNA储存于-2(TC冰箱。2) 重组粟酒裂殖酵母转化子质粒DNA的PCR鉴定将上述提取的质粒DNA进行PCR鉴定，反应条件和反应体系同重组克隆质粒的PCR检测。 将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，观察片段的位置和大小。图8为Dl基因电泳 检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量标准)泳道1在355bp处有一条清晰条带， 结果与预期结果相符，证明得到重组菌株。将鉴定正确的阳性菌株命名为SP-QOl/pESP-2-Dl。实施例4、防御素基因在粟酒裂殖酵母中表达的检测1、目的蛋白的诱导表达YES培养基酵母浸粉0.5%(w/v)葡萄糖3.0%(w/v) 腺嘌呤,组氨酸，亮氨酸,尿嘧啶，赖氨酸，氢氧化物50-250 mg/1 PBS缓冲液(100ml): NaCl 0.82g KC1 0.02gNa2HP04 0.36g KH2P04 0.025gESB缓冲液(可在4'C贮存数天)80 mmol/L Tris-HC1 (pH 6.8) 10%甘油 2% SDS 1.5% 二硫基苏糖醇(DTT) 0. lmg/ml溴酚蓝1) 酵母细胞培养的准备(1)将含有重组质粒的酵母转化子细胞及含有空载体的酵母转化子细胞接种到含5ml YES培养基的指型管中，250rpm、 30。C下过夜培养。(2) 接种约lnd过夜酵母细胞于含10ml YES培养基的50ml的三角瓶中过夜培养，直到 0D=0. 2-0.4。(3) 250rpm、 30°C继续培养约5小时，使OD=0. 7-1.0。(4) 将10ml的细胞分装入两个50ml的离心管中，每个5ml。用"没诱导"标志一试管，另 一试管标志"诱导"。(5) 1000g、室温下离心5min，收集酵母细胞沉淀。(6) 弃上清，每管中加入50ml的去离子水洗涤酵母细胞沉淀，lOOOg、室温下离心5min弃上清。(7) 重复一次步骤5。2) GST蛋白的诱导步骤(1) 将酵母细胞沉淀分别培养于10ml EMM培养基中，加的5mM抽滤的硫胺于标记"没 诱导"的试管中，250rpm、 30°C培养酵母细胞18 20个小时。(2) 为判断重组蛋白诱导是否成功，分别吸移lml的菌液于1.5ml离心管中。1000g、 4°C 下离心5min收集酵母细胞沉淀。(3) 弃上清，保存酵母细胞沉淀于-80°C，在下一步的SDS-PAGE验证中使用。(4) lOOOg、室温离心5min后收集三角瓶中剩余的酵母细胞。(5) 弃上清，用10ml的冷PBS回溶酵母细胞沉淀。(6) 1000g、室温离心5min，弃上清，在下一步蛋白纯化中应用。2、 酵母蛋白的提取(1) 向GST蛋白的诱导步骤3中得到的酵母细胞沉淀中加入50mmol/L Tris-HCl(m=7. 5) 和10ramol/L叠氮化钠溶液悬浮沉淀。(2) 12000rpm， 5min， 4'C离心收集沉淀细胞。(3) 弃上清，用30 yl ESB缓冲液悬浮细胞。(4) IO(TC保温3min，使蛋白酶失活之后，将样品存放于-2(TC。(5) 加入0. 3g直径0. 2mm的玻璃珠，剧烈振荡混合2min。(6) 加入150ul ESB缓冲液，稍加振荡，置10(TC 保温lmin。(7) 取5 20ul抽提液上样进行SDS凝胶电泳。3、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析将上述所提蛋白进行SDS-PAGE，结果如图9所示在约35KD处有一特异蛋白带，与已知 的理论分子量一致，说明防御素基因在粟酒裂殖酵母中得到了表达。4、琼脂凝胶扩散法对防御素基因进行生物学活性测定转化的酵母接种于EMM培养基中培养至对数中后期，离心(4 000r/min)收集菌体，细胞 重悬于5 ml预冷的PBS，加入5(^120%的Triton X-IOO，充分混匀后冰浴30 min。超声波破 碎细胞，超声循环为超声l S:间隔l S;全程40 S。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴 中混匀，避免局部温度太高，使蛋白质变性。样品暂存于-20'C冰箱中备用。以金黄色葡萄球 菌为试验敏感菌，挑单菌落接种于液体培养基中过夜培养，加入到冷却至50。C左右的固体培 养基内摇匀后铺板。待培养基凝固后用无菌打孔器在平板上打直径为0.5mm的小孔，滴加50^1 上述样品点于琼脂平板孔中检测其抑菌活性，并滴加50jilPBS作对照(作用16-18h检测)。 结果见图10: 1为PBS， 2、 3为抑菌圈。经生物学活性实验检测，防御素基因在酵母中得到表达。
序列表〈110〉吉林农业大学〈120〉一种具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法〈130〉wangpiwu200707〈160〉1〈170〉Patentln version 3.2〈210〉1〈211>1115<212〉腿〈213〉绿豆〈400〉1aaactttc3gcttcttgttcttgctccttcttgtcttagcCtCtggt33gatgcatatac60aatatacaattctctctctatatatatatagttatgatgttattttactg120attaatgtgttatgatgtg3aatcagatgtggccgt卿g卿gg卿ggctagaacttg180t3tgELtaEL已gBaag犯gggtggggaaaatgcttaattgax;accacctgtgcacsttcgtg240caagaaccgcggttacataggtgg咖ttgc犯aggcatgacgcgcacctgctattgcct300cgtc犯ctgttgaacccttttcgagatctcatgcatgcixtgtcctgacccgggt朋卿360gaatgtctccct"tgcca.gtactgctagggtttttctttcagcccattcaa420gctgcatattacgattttgtttttcgctttt卿aagtggtttagatgag480犯ttcttgatctccgacaacgagtacttttatttt"ttttgctaatcaLctttactcaatat540tagctcgaaatcgtagaaacgt卿cgggtgcg卿taccgagtggtgtagtt犯gaatt600acgtggcccacccaaaacgtgtatacttta660agaaggctataccccttcgtgttagatgtagttttagctaCCCMCCCg3gtct3tgagc720ttgacttcaggcWt￡Laatcgttttg犯ta11 aat t aaaa780attaaatatttaaaagcaatcatacgctgaa犯tttagtgctgtggct犯tcct"tcacat840gaaatgcceitaaaagtgactcaggtagt犯ctcatctact900tcattgactttgttacagcatgtg卿gst3tttatgctaaatcgtsigttacatc已tagt960aatactatgaaatcgacagatgccgcatgagcattggcttgggaatagtx1020aaaaac 111 atgatctagtccctcgcgccctgctgatgtc1080agaaccttgcgatt犯ttagacatggtaga111权利要求
1、一种具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于是将构建的含有防御素基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。
2、 如权利要求1所述的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征在于是将防御素基因 插入到粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的多克隆位点处，将构建的重组粟酒裂殖酵母表达载体 采用电穿孔法导入粟酒裂殖酵母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母 使防御素基因得到表达。
3、 如权利要求2所述的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征在于重组粟酒裂殖酵母表达载体是含有融合蛋白(GST)、防御素基因、Pnmtl启动子和终止子序列、多克隆位点 以及筛选标志的粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-Dl。
4、 根据权利要求3所述的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征在于防御素基因为 绿豆防御素基因(Dl)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. l所述。
5、 根据权利要求3和4所述的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征在于所述防御 素基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的多克隆位点处的Nhel和BglII限制性内切酶酶 切位点之间。
6、 根据权利要求3、 4所述的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征在于所述筛选 标志有两种， 一种为氨苄青霉素抗性基因，其允许在大肠杆菌克隆时进行载体的复制和抗生 素选择； 一种为选择标记基因LEU2-d，源自酿酒酵母可以作为向粟酒裂殖酵母细胞中转化表 达结构的选择标定物亮氨酸。
7、 根据权利要求2所述的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征在于是将构建的含 有防御素基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2—D1的质粒DNA，采用电穿孔法导入粟酒 裂殖酵母SP-Q01中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组酵母转化子使防御素基因得 到表达，重组酵母表达的时间为2-6天。
全文摘要
本发明提供了一种具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。本发明所提供的粟酒裂殖酵母工程菌，是将含有防御素基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中获得的。本发明将防御素基因插入到粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处，将构建的粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中获得重组粟酒裂殖酵母，培养重组粟酒裂殖酵母使防御素基因得到表达。本发明弥补了传统防御素制备方法以及原核表达系统、酿酒酵母和毕赤酵母表达系统的不足。发明应用于工业化防御素的生产时，具有生产规模大，防御素活性高，杀菌能力强，生长周期短，提取成本低的优点。
文档编号C12N1/19GK101157899SQ20071005595
公开日2008年4月9日 申请日期2007年8月3日 优先权日2007年8月3日
发明者付永平, 王丕武, 王俊玲 申请人:吉林农业大学