专利名称：一种嗜热解烃的地芽孢杆菌dm－2及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株地芽孢杆菌Geobacillus sp.DM-2菌株，及其在微生物采油中的应用。
背景技术：
当前，随着石油资源的日益短缺和勘探费用的不断增加，单纯注水的二次采油技术由于效率较低(水驱后几乎有60～70％的原油仍残留在油藏中)，已逐渐不能满足人们对石油资源有增无减的需求。近年来，以微生物提高原油采油率(Microbial EnhancedOil Recovery，MEOR)技术为代表的三次采油方法正逐渐受到广泛重视。该技术利用微生物的有益活动及代谢产物来提高原油采收率，是继热力驱、化学驱、聚合物驱等传统“三采”方法之后的一项综合性技术。微生物的有益活动包括有效细菌细胞在地层中的调堵作用，其可以扩大水驱波及体积，从而提高采收率；细菌的代谢产物，包括表面活性物质、有机溶剂、有机酸、生物聚合物或生物气等，在油藏中作用于残余油，可以改善原油流动性。此外，微生物在代谢过程中，能直接改变原油性质，如降解原油部分组份，引起原油性质变化，使原油易于流动，以提高残余油的洗油效率，从而起到提高采收率的作用。与其它三次采油技术相比，MEOR具有适用范围广、工艺简单、投资少、见效快、功能多、费用低、不损伤油层和无污染等优点，是目前最具发展前景的一项提高原油采收率的技术。
随着轻质油和中质油产量的下降，重质原油和沥青砂代表着已知可采用原油能源中的最大潜能部分。世界范围内约有3×1012bbl重油和沥青资源，其中有2.5×1012bbl潜在可采储量是分布在油页岩和沥青砂中。针对这些潜在的石油资源，开发行之有效的石油采收技术，为人类在21世纪提供充足的能源是非常必要的。许多重质原油的理化性质限制了其开采，不断增加的环境问题也限制了一些重油开采技术在敏感区域的应用。然而，至今还未形成专门用于重油开采的微生物体系，其主要原因是要求微生物能适应油藏中油层的理化特性，如温度、盐度、pH、压力及可利用的营养物等。利用微生物采收重质原油的成功应用，取决于微生物能否在诸如温度、压力和盐度等油储层环境的理化条件下生长。特别是在高温油藏进行微生物采油，尤其是驱油，菌种的嗜热性就显得特别重要，所选菌种需要在高温、缺氧条件下，能利用原油进行快速增殖和有效的代谢。1999年，Setti等研究了Pseudomonas sp.对重油的降解特性；2001年，张廷山等研究指出某些微生物能降解原油的重质组分，降低原油的粘度和凝固点，提高原油的流动性，从而可以提高石油采收率。因此，利用能降解长链烷烃的微生物开采重质原油也是一种合理的、可行的方法。
在微生物采油和含油废水处理的过程中，经常会用到烃降解菌株，它们以自己的方式摄取烃类，然后参与自身代谢，最终生成小分子有机酸。目前所知的微生物细胞对于烷烃的摄取机制有以下几个方面一是细胞与烃液滴直接作用微生物细胞可吸附到比自己大得多的烃液滴表面，物质的运输主要靠被动扩散和主动运输。这些细胞对烷烃具有很高的亲和力。通过相差和扫描电镜可以观察到不动杆菌可附着于烷烃小液滴的表面，絮凝物的形成也使得细胞可与烷烃保持紧密接触，从而造成一种微生态环境。当然并非依靠烷烃生长的微生物种群都会附着于烃类，有的细胞与烃的接触可能是依靠一种非特异性疏水作用引起的。二是细胞与“拟增溶”的小液滴互相作用微生物所产生的胞外的生物表面活性剂和生物乳化剂有增加油水界面之间接触面积的作用。
加快国内微生物采油技术的发展，符合我国石油工业发展的需要，有利于实现“稳定东部、发展西部”的战略决策。对能以烷烃为碳源的嗜热菌的烷烃降解特性进行研究，使其适用于高温油田而提高石油采收率具有很好的发展前景。
发明内容本发明的目的在于针对石油资源的日益短缺和勘探费用不断增加的问题，提供一种地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2和该菌在微生物采油领域的应用。
本发明提供的地芽孢杆菌(Geobacillus thermoparaffinivorans，以下称Geobacillus sp.)DM-2菌株，于2005年12月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.1565。
本发明提供的地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2菌株，是从极端嗜热油井水样中分离，经紫外照射诱变，挑选乳化原油最快的转化子，并以液蜡为唯一碳源的情况下在70℃反复驯化培养十代而获得。
地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2 CGMCC No.1565的菌落特征在LB平板上培养一天的菌落大小直径3～5mm，菌落呈圆形，边缘整齐，表面湿润，乳白色。
地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2 CGMCC No.1565的细胞形态特征革兰氏染色阳性，菌体呈短杆状，周生鞭毛，能运动，好氧，培养1天以上产生芽孢，芽孢次末端生长，不膨大，细胞大小3.0-6.0μm(长)×0.8-1.2μm(宽)，大多数菌体呈分散状，少数呈八字形排列。
地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2 CGMCC No.1565的生理生化特征专性嗜热，生长温度40-70℃，最适60-65摄氏度，生长pH范围4-9，NaCl耐受性0-2％。触酶，H2S实验，七叶灵水解，淀粉水解，纤维素水解，MR实验均为阳性，苯丙氨酸脱氨，脲酶实验，氧化酶，溶菌酶抗性实验，酪氨酸降解，吲哚实验，明胶液化，酪蛋白水解，V-P实验皆为阴性，能够利用甘露醇，甘油产酸，不能利用阿拉伯糖，半乳糖，木糖，肌糖，乳糖，鼠李糖，蔗糖和柠檬酸盐。降解烷烃和原油，产生生物乳化剂。
地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2 CGMCC No.1565的16S rRNA基因序列特征CGMCC No.1565接种于LB培养基，60℃摇床培养(130rpm)10小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送北京三博公司进行测序。PCR条件为94℃，10min；94℃，45s，55℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃10min，4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1552bp，在GenBank中的登录号为DQ309593，与Geobacillus.stearothermophilus BGSC W9A25的16S rDNA(登录号为AY608931)序列相似性为99％。其16S rDNA的序列如序列表所示。
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rDNA基因序列在GenBank中的搜索结果，经多项分类鉴定DM-2为一新菌，属于地芽孢杆菌属(Geobacillus sp.DM-2)。
地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2CGMCC No.1565可以在营养培养基，如普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以烷烃或原油为碳源生长。菌株在50～70℃之间的一适宜温度下兼性厌氧生长。
该菌具有很高的降解石油烃的能力，可降解C12～C36的正构烷烃和原油。用DM-2生长细胞进行降解实验结果表明，该菌在50℃-70℃温度条件下，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入的10％的烷烃或5g/L的原油，其基础培养基组成为g/LKH2PO40.3，Na2HPO4·12H2O 1.5，NH4Cl2，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.36，酵母提取物0.1～1，蔗糖0.5～2，pH 6～8。往复摇床130rpm转速培养72h，降解率均可达70％以上，对不同碳数的烷烃降解率都在60％以上，如图2所示。该菌作用40％的原油，能降低原油粘度1.82～50％，降低凝固点1～5.2℃。
本发明的优点和积极效果本发明提供的CGMCC No.1565菌在50～70℃最适温度条件下，能够以烃为碳源和能源生长，能够利用12碳～36碳的正构烷烃，对原油(5g/L)的降解率可达70％以上；该菌株及其发酵液在高温条件下能很好的乳化烷烃或原油，进而对烷烃和原油进行降解，降低烷烃或原油的粘度和凝固点，最高可降粘度50％，最高可降凝固点5.2℃，该菌株及其发酵液应用于微生物采油试验，产油有效期可达90天以上，共增产原油400余吨，因此可用于提高石油采收率。
图1是Geobacillus sp.DM-2CGMCC No.1565菌对各链长单烷烃的降解效果；图2是Geobacillus sp.DM-2CGMCC No.1565菌对原油降解的气相色谱图；a为作用前，b为作用后；图3是Geobacillus sp.DM-2CGMCC No.1565菌在生长不同时期的乳化性能和油水界面张力变化曲线；图4是在以蔗糖为碳源生长的Geobacillus sp.DM-2CGMCC No.1565菌发酵液对柴油和原油的乳化效果；图5是在不同链长单烷烃中生长的Geobacillus sp.DM-2CGMCC No.1565菌发酵液对柴油和原油的乳化指数EI-24；图6是Geobacillus sp.DM-2CGMCC No.1565菌发酵液用于某试验油田油井采油的油产量变化曲线。
具体实施方式实施例1本发明提供的Geobacillus sp.DM-2菌株的筛选和育种。
取某试验油田采出水水样，振荡均匀后用移液管取10ml，无菌接种至100ml无机盐基础培养基中(培养基组成KH2PO4，0.3g；Na2HPO4·12H2O，1.25g；NH4Cl，2.0g；MgSO4·7H2O，0.2g；CaCl2·2H2O，0.01g；FeSO4·7H2O，0.36g；酵母提取物，0.5g；蔗糖，1.0g；液蜡，20ml；蒸馏水，1000ml；pH7.2；121℃灭菌30min)，60℃摇床往复振荡培养5天。将富集培养液充分混匀，取100ul涂布在1.5％营养肉汤琼脂平板上，60℃恒温培养箱中培养2～3天，观察生长出的菌落。同时，直接取100ul采出水，涂布在1.5％营养肉汤琼脂平板上，60℃恒温培养箱中培养2～3天，观察生长出的菌落。挑取单菌落并用显微镜检验其纯度。将高温下生长的各个菌落，接种至营养肉汤培养基中，培养至OD630为0.8左右，作为种子液以10％(v/v)比例接入100ml无机盐液蜡培养基中，60℃摇床往复振荡培养5天。然后以此发酵液作为种子液，接种至新鲜的无机盐液蜡培养基，反复该步骤3～4次。最后通过紫外线诱变10秒，避光静置30秒，重复5次，并通过测量乳化指数(EI-24)来筛选对液蜡乳化能力强的菌株，最终得到一株乳化液蜡和原油效果最好的菌株Geobacillus sp.DM-2。
无机盐液蜡培养基组成g/LK2HPO4·3H2O，4.8；KH2PO4，1.5；(NH4)2SO4，1；柠檬酸三钠，0.5；MgSO4·7H2O，0.2；葡萄糖，2；酵母提取物，0.1；CaCl2·2H2O，0.002；MnCl2·4H2O，0.0004；NiCl2·6H2O，0.0004；ZnSO4·7H2O，0.0004；FeCl3·6H2O，0.0002；NaMoO4·2H2O，0.0002；液蜡20ml，蒸馏水，1000ml，pH 7.2，121℃灭菌30min。在60℃条件下，培养2天。
乳化指数的测定方法如下取4个刻度试管，分别及加入柴油、原油、二甲苯和甲苯各3ml，每个试管中再加入7ml的发酵液，剧烈振荡1分钟，室温静置24小时后测量，以乳化层的高度除以有机相的总高度，再乘100％，即EI-24，如果EI-24＞50％，则认为该乳状液是稳定的。
实施例2本发明提供的Geobacillus sp.DM-2菌株的形态特征和生理生化特征。
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》(Vol.VIII)的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，生长pH范围，NaCl耐受性。触酶，H2S实验，七叶灵水解，淀粉水解，纤维素水解，MR实验，苯丙氨酸脱氨，脲酶实验，氧化酶，溶菌酶抗性实验，酪氨酸降解，吲哚实验，明胶液化，酪蛋白水解，V-P实验，以及利用甘露醇，甘油产酸，阿拉伯糖，半乳糖，木糖，肌糖，乳糖，鼠李糖，蔗糖和柠檬酸盐实验。
结果表明，该菌株革兰氏染色阳性，菌体呈短杆状，周生鞭毛，能运动，好氧，培养1天以上产生芽孢，芽孢次末端生长，不膨大，细胞大小3.0～6.0μm(长)×0.8～1.2μm(宽)，大多数菌体呈分散状，少数呈八字形排列。生长温度40～70℃，最适60～65摄氏度，生长pH范围4～9，NaCl耐受性0-2％。触酶，H2S实验，七叶灵水解，淀粉水解，纤维素水解，MR实验均为阳性，苯丙氨酸脱氨，脲酶实验，氧化酶，溶菌酶抗性实验，酪氨酸降解，吲哚实验，明胶液化，酪蛋白水解，V-P实验皆为阴性，能够利用甘露醇，甘油产酸，不能利用阿拉伯糖，半乳糖，木糖，肌糖，乳糖，鼠李糖，蔗糖和柠檬酸盐。
实施例3本发明提供的Geobacillus sp.DM-2菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定。
将该菌株接种于LB培养基，60℃摇床培养(130rpm)10小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送北京三博公司进行测序。PCR条件为94℃，10min；94℃，45s，55℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃10min，4℃保存。16S rRNA基因序列长度为1552bp，在GenBank中的登录号为DQ309593，与Geobacillus stearothermophilus BGSC W9A25的16S rDNA(登录号为AY608931)序列相似性为99％。其16S rRNA基因的序列如序列表所示。
实施例4本发明提供的Geobacillus sp.DM-2菌株对烷烃和某试验油田原油的降解将菌株在LB平板上进行活化，取单菌落接入5ml LB液体培养基中过夜培养，以1％接种量接种至100LB液体培养基中，60℃振荡培养8h至对数生长期，以10％接种量接种至装有100ml含有不同烷烃或原油为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)的三角瓶中，60℃厌氧培养3天，用气相色谱法分析，该菌株对不同碳数烷烃的降解率，用红外测油仪测定原油的降解率并用高压气相色谱法进行残留原油的气相色谱分析，结果如图1，图2和图3所示。该菌株在11h乳化活性达到最高值，24h能使油水界面张力降到最低，对C12～C36烷烃的降解率均在60％以上，对原油(5g/L)的降解率可达71.86％。
检测原油降解率的方法如下将菌落接种至液蜡培养基培养3天左右，作为种子以10％(v/v)比例接入液接入到100mL 0.5％的原油培养基中，60℃震荡培养5d后测定原油降解率。油类测定方法采用红外法，即发酵液用100ml四氯化碳萃取，用红外测油仪测定剩余原油的量，降解率(％)＝(1-剩余原油的量)/加入原油的量×100％。并采用高压气相色谱方法检测原油的降解情况。
实施例5本发明提供的Geobacillus sp.DM-2菌株发酵液在60℃条件下对柴油和原油的乳化。
Geobacillus sp.DM-2菌株在以蔗糖和不同烷烃为碳源的培养基中(同实施例3)生长，60℃振荡培养3天，用其发酵液对柴油和原油进行乳化活性分析，如图4所示，以蔗糖为碳源生长，该菌发酵液能很好的乳化柴油和液蜡。如图5所示，该菌在以不同单烷烃为碳源的培养基中生长，该菌都会产生乳化剂对柴油和原油进行乳化，其中以二十二烷培养的菌株发酵液乳化柴油指数最高，EI-24为100％；以十八烷培养的菌株发酵液乳化原油指数最高，EI-24为80％。
实施例6本发明提供的Geobacillus sp.DM-2菌株发酵液在50℃条件下对柴油和原油的乳化。
Geobacillus sp.DM-2菌株在以蔗糖和不同烷烃为碳源的培养基中(同实施例3)生长，50℃振荡培养3天，用其发酵液对柴油和原油进行乳化活性分析，以蔗糖为碳源生长，该菌发酵液能很好的乳化柴油和液蜡。该菌在以不同单烷烃为碳源的培养基中生长，该菌都会产生乳化剂对柴油和原油进行乳化，其中以二十二烷培养的菌株发酵液乳化柴油指数最高，EI-24为100％；以十八烷培养的菌株发酵液乳化原油指数最高，EI-24为75％。
实施例7本发明提供的Geobacillus sp.DM-2菌株发酵液在70℃条件下对柴油和原油的乳化。
Geobacillus sp.DM-2菌株在以蔗糖和不同烷烃为碳源的培养基中(同实施例3)生长，70℃振荡培养3天，用其发酵液对柴油和原油进行乳化活性分析，以蔗糖为碳源生长，该菌发酵液能很好的乳化柴油和液蜡。该菌在以不同单烷烃为碳源的培养基中生长，该菌都会产生乳化剂对柴油和原油进行乳化，其中以二十二烷培养的菌株发酵液乳化柴油指数最高，EI-24为100％；以十八烷培养的菌株发酵液乳化原油指数最高，EI-24为78％。
实施例8本发明提供的Geobacillus sp.DM-2发酵液在50～70℃条件下能很好的乳化烷烃或原油，并能很好地降低烷烃或原油的粘度和凝固点。
以基础培养基培养该菌并加入40％的原油，经过50～70℃振荡培养24h，将原油6000r/min离心分离后在50℃用Brookfield CAP2000粘度计检测该菌作用前后的原油粘度，用水浴降温，当试管倾斜原油刚不留动时读温度计上刻度的方法检测原油凝固点，结果(见表1)表明作用不同的原油，能降低粘度1.82～50％，降低凝固点1～5.2℃。
表1不同温度培养的Geobacillus sp.DM-2发酵液作用不同原油的降粘降凝效果
实施例9本发明提供的Geobacillus sp.DM-2在某试验油田采油技术中的应用。
通过菌体细胞或其发酵液能提高石油采收率，具体过程为以液蜡为碳源培养菌体→将菌体或发酵液的量加入注入井中→关井(吞吐井)或注水(驱油井)数天→提高采出井油产量。发酵培养菌体的条件为在60℃温度条件下培养3天，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入2％的液蜡作为碳源，其基础培养基组成为g/LKH2PO40.3，Na2HPO4·12H2O 1.5，NH4Cl 2，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.36，酵母提取物0.5，蔗糖1，pH 6～8。将微生物注入油井后油产量变化曲线见图6，由图可知该井日均增产4吨以上，有效期102天，共增产原油419吨。
实施例10本发明提供的Geobacillus sp.DM-2在某试验油田采油技术中的应用。
通过菌体细胞或其发酵液能提高石油采收率，具体过程为以液蜡为碳源培养菌体→将菌体或发酵液的量加入注入井中→关井(吞吐井)或注水(驱油井)数天→提高采出井油产量。发酵培养菌体的条件为在60℃温度条件下培养3天，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入2％的液蜡作为碳源，其基础培养基组成为g/LKH2PO40.3，Na2HPO4·12H2O 1.5，NH4Cl 2，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.36，酵母提取物1，蔗糖0.5，pH 6。同样可使该井日均增产4吨以上，有效期92天，共增产原油395吨。
实施例11本发明提供的Geobacillus sp.DM-2在某试验油田采油技术中的应用。
通过菌体细胞或其发酵液能提高石油采收率，具体过程为以液蜡为碳源培养菌体→将菌体或发酵液的量加入注入井中→关井(吞吐井)或注水(驱油井)数天→提高采出井油产量。发酵培养菌体的条件为在60℃温度条件下培养3天，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入2％的液蜡作为碳源，其基础培养基组成为g/LKH2PO40.3，Na2HPO4·12H2O 1.5，NH4Cl 2，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.36，酵母提取物0.1，蔗糖2，pH 8。同样可使该井日均增产4吨以上，有效期106天，共增产原油462吨。
序列表<110>南开大学<120>一种嗜热解烃的地芽孢杆菌DM-2及其用途<160>1<170>Patentin Version 2.1<210>1<211>1552<212>DNA<213>地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)<400>1gagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60cggaccgaac gagggcttgc tcttgtttgg tcagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg 120caacctgccc gcaagaccgg gataactccg ggaaaccgga gctaataccg gataacaccg 180aagaccgcat ggtcttcggt tgaaaggcgg cctttgggct gtcacttgcg gatgggcccg 240cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccggcct 300gagagggtga ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360gtagggaatc ttccgcaatg ggcgaaagcc tgacggagcg acgccgcgtg agcgaagaag 420gccttcgggt cgtaaagctc tgttgtgagg gacgaaggag cgccgttcga agagggcggc 480gcggtgacgg tacctcacga gaaagccccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 540cgtagggggc gagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtctctta 600agtctgatgt ggaagcccac ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg ggggacttga 660gggcaggaga ggagagcgga actccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 720acaccagtgg cgaaggcggc tctctggcct gcacctgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg 780gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta 840gaggggtcac accctttagt gctgcagcta acgcgataag cactccgcct ggggagtacg 900gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 960tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcccctga caacccaaga 1020gattgggcgt tcccccttcg gggggacagg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1080cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgcct ctagttgcca 1140gcacgaaggt gggcactcta gagggactgc cggcgacaag tcggaggaag gtggggatga 1200cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg ggcggtacaa 1260agggctgcga acccgcgagg gggagcgaat cccaaaaagc cgctctcagt tcggattgca 1320ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1380tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagct tgcaacaccc 1440gaagtcggtg aggtaacccg caagggagcc agccgccgaa ggtggggcaa gtgattgggg 1500tgaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa ggtgcggctg gatcacctcc tt 155权利要求
1.一种嗜热地芽孢杆菌，名称为Geobacillus sp.DM-2，已于2005年12月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.1565。
2.如权利要求1所述的嗜热地芽孢杆菌DM-2CGMCC No.1565菌株，其特征在于，所述的菌株从极端嗜热油井水样中分离并经过紫外诱变和驯化过程以增强其乳化、降解原油的性质。
3.如权利要求1所述的嗜热地芽孢杆菌DM-2CGMCC No.1565菌株，其特征在于，其16SrDNA的核苷酸序列如序列表所示。
4.如权利要求1所述的嗜热地芽孢杆菌DM-2 CGMCC No.1565菌株，其特征在于，菌落在LB平板上培养一天的菌落大小直径3～5mm，菌落呈圆形，菌落边缘整齐，表面湿润，乳白色；菌体细胞革兰氏染色呈阳性，呈短杆状，周生鞭毛，能运动，好氧，培养1天以上产生芽孢，芽孢次末端不膨大，细胞大小长3.0-6.0μm×宽0.8-1.2μm，大多数菌体呈分散状，少数呈八字形排列；生理生化特征，专性嗜热，生长温度50-70℃，生长pH范围4-9，NaCl耐受性0-2％；触酶，H2S实验，七叶灵水解，淀粉水解，纤维素水解，MR实验均为阳性，苯丙氨酸脱氨，脲酶实验，氧化酶，溶菌酶抗性实验，酪氨酸降解，吲哚实验，明胶液化，酪蛋白水解，V-P实验皆为阴性，能够利用甘露醇，甘油产酸，不能利用阿拉伯糖，半乳糖，木糖，肌糖，乳糖，鼠李糖，蔗糖和柠檬酸盐。
5.一种权利要求1所述的嗜热地芽孢杆菌DM-2 CGMCC No.1565的应用，其特征在于，该菌株及其发酵液在50℃-70℃条件下能很好的乳化烷烃或原油，进而对烷烃和原油进行降解，降低烷烃或原油的粘度和凝固点，以及提高石油采收率中的应用。
6.如权利要求5所述的嗜热地芽孢杆菌DM-2 CGMCC No.1565的应用，其特征在于，通过菌体细胞或其发酵液能提高石油采收率，具体过程为以液蜡为碳源培养菌体→将菌体或发酵液的量加入注入井中→关闭吞吐井或向驱油井注水数天→提高采出井油产量；培养菌体的条件是60℃以2％的液蜡作为碳源培养3天，基础培养基组成为g/LKH2PO40.3，Na2HPO4·12H2O1.5，NH4Cl2，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.36，酵母提取物0.1～1，蔗糖0.5～2，pH 6～8。
全文摘要
一种嗜热解烃的地芽孢杆菌DM－2及其用途。本发明涉及的地芽孢杆菌(Geobacillussp.)DM－2，其保藏号为CGMCC No.1565。该菌株从极端嗜热油井水样中分离并经过紫外诱变和驯化过程以增强其乳化、降解原油的性质。该菌株在50℃～70℃条件下能够以烃为碳源和能源生长，能够利用12碳～36碳的正构烷烃，对原油(5g/L)的降解率可达70％以上；该菌株及其发酵液能很好的乳化烷烃或原油，作用含40％原油的无机盐培养基，最高可降低原油粘度50％，最高可降低凝固点5.2℃；进而对烷烃和原油进行降解，降低烷烃或原油的粘度和凝固点，因此能在微生物提高石油采收率中应用。
文档编号C12R1/07GK101041811SQ20071005675
公开日2007年9月26日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者马挺, 王君, 刘如林, 刘静, 刘清坤, 梁凤来 申请人:南开大学