专利名称：Scirr69基因、调节bdnf转录及在生物医学研究、生物治疗药物研发中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域。特别涉及SCIRR69基因、调节BDNF转录及在生 物医学研究、生物治疗药物研发中的应用；具体涉及一种从大鼠分离的脊髓损伤 修复相关基因及其编码蛋白，脊髓损伤修复过程中起作用的转录因子及其编码序列。
背景技术：
脊髓损伤后的修复成为亟待解决的世界性难题。近年来，关于脊髓损伤修复 分子机理的研究已经取得了很大进展[1"，这些研究为重新认识脊髓损伤并提供有 针对性的干预手段奠定了基础。例如，人们通过认识Nogo分子w对神经再生的抑 制作用，根据其结构设计了相应的抗体，用以阻断Nogo对神经再生的抑制，使 动物损伤后的修复效果有了明显改善w。根据Nogo分子及其受体的结构，通过酵 母双杂交技术筛选出多种阻断Nogo信号转导途径的多肽[5—6]，用这些多肽消除 Nogo分子对脊髓损伤后再生的抑制作用，取得了瞩目的效果。由于脊髓损伤修复 过程涉及相当多的基因，它们之间的相互作用错综复杂，虽然目前对损伤修复分 子机理的认识有了较大进步，但脊髓损伤修复的分子机理还远远没有搞清楚[7—9]。 至于脊髓损伤修复过程中起作用的转录因子，了解的更少。
发明内窖
本发明的目的是提供一种SCIRR 69基因、调节BDNF转录及在生物医学研究、 生物治疗药物研发中的应用。其目的之一是提供在脊髓损伤修复过程中起作用的 转录因子及其编码序列。
本发明的另一目的是提供上述蛋白或各种剪切长度的蛋白在制备治疗神经 损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经退行性变疾患以及其他神经系统疾病治疗药 物或研究、诊断试剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述蛋白质作为抗原的应用以及利用所述抗原 制备的抗体。
本发明提供的转录因子是一种如下(a)或(b)所述的蛋白质-.
(a) 具有序列表中SEQ ID NO. 1(图4)所述的氨基酸序列，
(b) 在(a)限定的氨基酸序列中经过取代,缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生 的蛋白质，且与(a)的蛋白质具有相同的功能，所述功能是作为BDNF的转录调节 因子,所述BDNF属于神经营养因子家族成员。
脊髓损伤修复过程中，在基因水平上发生一系列复杂的变化[1"]。消减杂交技 术是分离组织或细胞间差异基因的有效方法。发明人采用基于PCR的消减杂交方 法，并在经典消减杂交的基础上进行了改进，引进了 Cap-finder、长距离PCR、 Biotin-dNTP、磁性分离系统和S印hacryl离心柱分离等技术。在建立的大鼠脊 髓全横断模型基础上，通过改良的消减杂交技术构建脊髓损伤后4.5天的cDNA 消减文库，然后随机挑取文库中的110个克隆进行酶切鉴定和测序，分析结果显 示这些克隆代表了 51个ESTs。进一步通过反向点杂交剔除11个假阳性克隆，最 终得到40个差异ESTs，其中32个代表已知基因，其余8个代表新基因。32个 已知基因中，包括Synuclein、 Clusterin 、 Gaa、 Vimentin、 Reticulon、 Neurofascirrn等与神经系统发育、退行性病变、神经细胞的存活及轴突延伸密 切相关的分子。其中EST-69长度为720bp (GenBank accession no. BU744264)， 它代表一个全新基因。在该EST片断预测的编码框内部包含一个bZIP结构，该 结构是转录因子与DNA序列特异性结合的保守结构域之一，提示EST-69代表的
新基因编码产物可能作为转录因子在脊髓损伤修复过程中起一定作用，发明人将 其命名为Scirr69。
首先通过5' -RACE和3' -RACE技术克隆到该基因的完整cDNA序列，长度 为3321bp,该基因定位于大鼠染色体4q22，由12个外显子和11个内含子组成。 我们将这一序列在Genbank进行了登陆，获得的登录号为AY546001。其预测的 编码区位于334 bp -1899 bp，编码521个氨基酸。半定量RT-PCR及原位杂交结 果均表明，Scirr69 mRNA在损伤5天脊髓中的表达水平明显高于对照组。
进一步对该蛋白的优势表位进行计算、分析。构建优势抗原表位原核表达载 体，在原核系统大量诱导表达抗原表位。经纯化后免疫动物，制备多克隆和单克隆抗体。ELISA检测结果显示制备的抗体效价均达到104以上；WB鉴定表明所述
抗体的特异性较好，而且WB检测到的蛋白水平的表达变化趋势与mRNA水平相一 致。
为研究该基因在胚胎发育过程中的表达情况，以地高辛标记的RNA探针通过 小鼠胚胎整体原位杂交，结果显示，mRNA的表达最早见于E10天的端脑与间脑的 腹侧，在E11-E12天时，在端脑、间脑和后脑表达量均比较高，说明该基因可能 在胚胎发育过程中参与了中枢神经系统发育的调节。RT-PCR结果显示，在所检测 的成年大鼠的心、肝、脾、肺、胃、肾、胰、胸腺、大肠、小肠、骨骼肌、睾丸、 脑干、大脑、小脑、脊髓这16种组织中均存在Scirr69 mRNA较高水平的表达。 此外，Scirr69mRNA在中枢神经系统的分布十分广泛，尤以神经元功能活动频繁 的大脑皮层、丘脑、下丘脑腹内侧核和弓状核、乳头体、海马、红核、脑桥灰质、 巨细胞网状核等部位为多，说明该基因对于维持各个组织的正常功能具有普遍意 义。
计算机分析结果显示，SCIRR69蛋白的296aa-357aa存在一个bZIP结构，379 aa-398 aa存在一个跨膜区。GFP共定位实验证明，完整的69号蛋白(laa-521aa) 定位于内质网，而跨膜区缺失突变体(laa-375aa)则定位于细胞核。据此推测， 69号蛋白在一定条件下在跨膜区发生切割，然后N端进入细胞核发挥转录激活作 用。为确定SCIRR69是否具有转录激活活性，我们将其与GAL4-DBD融合表达， 与pFR-Luc报告质粒共转染哺乳动物细胞，结果发现SCIRR69蛋白可显著激活报 告基因萤火虫荧光素酶的表达(约为阴性对照的20倍)。在此基础上，进一步构 建一系列N端、C端缺失体寻找其转录激活部位(transcriptional activation domain, TAD),并最终确定其TAD位于laa-60aa。
SCIRR69蛋白属于CREB/ATF家族的转录因子。正常状态下该家族分子定位于 内质网膜上(N端朝向胞浆)，当内质网应激试剂th邻sigargin (Ca2+ATPase的抑 制剂)或timicamycin (N端糖基化的抑制剂)存在时，这些分子在跨膜区发生切 割，N端进入细胞核发挥转录激活作用。但在我们的研究中，当TG、 Tm存在时， SCIRR69蛋白并没有发生切割，提示SCIRR69可能是通过另外的途径被活化。用 原代培养大鼠神经元切割损伤模型，并通过SCIRR69单克隆抗体的免疫荧光标记
检测该蛋白的定位，结果发现在正常神经元中，免疫标记特异出现在细胞浆中，
而在损伤神经元中，胞浆和胞核均有标记，尤其是在损伤后lhr和12hr这一现 象最为明显，该结果表明在神经元损伤时，SCIRR69可以在跨膜区发生切割而进 入细胞核发挥转录激活作用。
原代神经元表达SCIRR 69基因和蛋白。划伤导致SCIRR 69编码蛋白由细胞 质进入细胞核。但细胞核SCIRR 69蛋白阳性的神经元与损伤线距离无正相关关 系。说明损伤不是引起SCIRR 69蛋白入核的直接因素，而可能是损伤因素导致 神经元内物质释放到细胞外，后者引起SCIRR 69蛋白进入细胞核。分析由神经 元释出的物质最大可能包括Glu， CaCL和KC1。接着的实验确定了 KC1是导致 SCIRR69蛋白入核的关键因素。Western blot实验也证明，KC1作用原代神经元 后导致SCIRR69蛋白发生切割，在50kD处出现一新的条带。进一步研究发现KC1 可使BDNF表达上调。说明这两者之间可能存在特异的链条环节。
通过染色质免疫沉淀及PCR方法(ChIP on PCR)证实SCIRR-69蛋白能直接 与BDNF启动子DNA相互作用。将构建有BDNF启动子载体及SCIRR 69全长和各 截短型载体共转染细胞，通过双荧光素酶实验也发现SCIRR-69蛋白截短型与 BDNF启动子相互作用能明显促进报告基因转录。再次确认了 SCIRR 69蛋白与BDNF 转录调节之间的关系——SCIRR 69截短型(1-378)具有强大的转录激活活性， 可以促进BDNF转录。通过RNAi沉默SCIRR 69基因的表达，观察到干扰SCIRR 69 基因后BDNF表达也出现相应下调。以上实验确认SCIRR 69蛋白作为BDNF转录 因子在BDNF转录调节中发挥作用。
将1-378插入pcDNA3. l表达质粒，然后转染PC12细胞，培养12小时制备 条件培养液。分离新生大鼠大脑，将之剪成lmm见方的组织快。然后用条件培养 液培养。以空载体转染PC12细胞的条件培养液以及BDNF作对照。发现转染SCIRR 69 1-378后制备的条件培养液具有明确的促进皮质组织块神经再生作用。
本发明的有益效果在于
本发明所提供的SCIRR69蛋白及其突变体为BDNF新的转录调节因子，确认
SCIRR 69蛋白作为BDNF转录因子在BDNF转录调节中发挥的作用。
BDNF属于神经营养因子家族成员。SCIRR69蛋白在神经元的生长、分化以及 轴突可塑性方面具有重要作用。SCIRR69蛋白在神经元的生长、分化以及轴突可 塑性方面具有重要作用；特异性的抗原和基于抗原制备特异性抗体；可能用于制 备促进BDNF转录，促进神经再生，治疗神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神 经退行性变疾患的药物；可用于制备修复脊髓损伤的药物和研究试剂。
本发明所提供的SCIRR69蛋白结构清楚，易于制备。同时可作为抗原制备特 异性抗体。
图1为5' -RACE-PCR (A)和3， -RACE-PCR(B)产物电泳图结果。 图2为Scirr69 mRNA序列。加粗字体代表编码区序列，无下划线代表短剪 切体序列。
图3为The cDNA sequence of SCIRR-69cDNA序列和在Gene Bank登录结果。 图4为SCIRR-69蛋白的氨基酸序列分析。
图5为(A) SCIRR-69蛋白与OASIS蛋白序列比较.(B)图显示SCIRR-69 蛋白与其它CREB/ATF家族的亮氨酸拉链序列比较。
图6为SCIRR-69蛋白与其它CREB/ATF家族的结构比较。
图7为(A)大鼠cDNA文库PCR扩增BCE 。 (B) pET-32a-BCE重组质粒测序结果。
图8为(A) SDS-PAGE检测BCE重组蛋白在原核系统中的表达。Lane 1代表 细菌未诱导；Lane 2代表细菌诱导后；Lane 3代表细菌超声后上清，表明重组 蛋白以可溶性形式存在；Lane 4代表细菌超声后沉淀；Lane 5纯化后重组蛋白. (B) BCE重组蛋白MALDI-TOF-MS结果。
图9为ELISA检验免疫动物得到的抗SCIRR 69蛋白优势表位血清效价结果。 图10为用Western Blot (A)和免疫荧光技术(B)检验抗SCIRR 69血清。 照片al-a4为空载体转染的C0S7细胞，可见仅荧光蛋白被显示(al)。而 pEGFP-Nl-SCIRR-69FL转染的C0S7细胞也被定位与细胞质(b2)，多克隆抗体标
记(红色)与载体荧光蛋白定位(绿色)(bl)重合。
图11为大鼠脊髓Western Blot分析显不在示80kD处有一单一条带(图A)。 用抗SCIRR 69单克隆抗体标记的原代神经元荧光标记物存在于细胞质。标尺 二100u m。
图12为整体原位杂交显示SCIRR-69mRNA在小鼠不同胚胎阶段的表达。Bars
二2 mm。
图13为RT-PCR展示SCIRR-69 mRNA在多种器官的分布。
图14A为原位杂交技术显不SCIRR-69 mRNA在成年大鼠大脑中的分布。
Bar=2mmc
图MB为原位杂交技术显示SCIRR-69 mRNA在成年大鼠脑干和小脑中的分 布。Bar=2mm。
图14C为原位杂交技术显示SCIRR-69 mRNA在成年大鼠脊髓不同节段中的分 布。
Bar=0. 5mm 。
图15为昆示SCIRR 69在大鼠大脑原代培养细胞中的表达。Bars=]00tim.
图16为抗SCIRR 69蛋白，抗KDEL和GFP三标记技术展示SCIRR-69蛋白全 长及跨膜区缺失突变体的细胞内定位。Bar二50um.
图17为用RT-PCR (A)和Western Blot (B)技术分别展示SCIRR 69mRNA 和蛋白表达与脊髓损伤、修复的关系。
图]8为SCIRR 69基因全长和各种缺失突变体PCR扩增。
图19A为TG和TM对SCIRR 69激活情况。Bar二50 u m。
图19B为显示原代神经元损伤应激前(al-a3)、后不同时间(bl-c3) ， SCIRR 69蛋白进入细胞核Bars二50nm。
图20为分别展示大鼠脊髓(A)和原代神经元，(B)损伤应激致SCIRR 69切 割入核后导致蛋白分子发生切割变化，表现在电泳图上除了 80kD条带外，50kD 处也出现一条带
图21为染色质免疫沉淀技术发现SCIRR 69直接与BDNF启动子结合。 图22.双荧光素酶实验证实SCIRR-69蛋白截短型与BDNF启动子相互作用。 图23为沉默PC 12细胞SCIRR 69基因的表达，发现BDNF表达也出现相应下调。
图21为SCIRR69-378截短型质粒转染细胞收集上清能显著促进胎鼠皮层组 织块突起生长。CI:空载转染细胞收集上清；C2: PC12细胞培养液；C3:皮层组 织块常规培养液；C4: BDNF (终浓度12. 5ng/ml); C5: SCIRR69-378截短型质粒 转染细胞收集上清。
具体实施例方式
本发明提供一种SCIRR 69基因、调节BDNF转录及在生物医学研究、生物治 疗药物研发中的应用。在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发 明的范围。
SCIRR 69基因全长序列的获得及分析
(1) 用Race技术获得SCIRR 69号基因cDNA全长。(见图1)
(2) 基因测序及拼接5' -RACE-PCR在1.2kb处有单一条带，该条带测序 结果能够与EST-69拼接到一起，所以我们成功获得了SCIRR-69的5'端序列； 3' -RACE-PCR主要有两条扩增带，分别为1.5kb和1.95kb (图1A)。测序结果 表明，1. 95Kb条带的序列包含了 1.5Kb条带的序列，两者都能与EST-69拼接到 一起，而且这两条序列都具有polyA结构，说明SCIRR-69存在长度不同的两个 mRNA剪接体。
将5， -RACE-PCR和3， -RACE-PCR扩增产物测序结果跟已知EST-69序列 拼接，得到该基因的完整cDNA序列。为确证该基因的存在，根据拼接序列设计 引物，从损伤大鼠脊髓中成功扩增到该基因的完整cDNA序列(见图2)。
(3) SCIRR-69 mRNA序列及分析；将EST-69代表的新基因命名为SCIRR-69 (spinal gord jjijury regeneration ^elated gene no. 塑)，并将其mRNA序 列在Genbank进行登陆(GenBank accession no. AY546001)，详细登陆信息见 附录3。 SCIRR-69 mRNA较长的剪接体为3321bp (Fig. 1.2)，与之相比，较短的
剪接体在3，端polyA结构前缺少459bp (underlined)。利用ORF finder软件 (http:〃丽.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)预测该基因的编码产物，显 示SCIRR-69基因可信度最高的编码框位于334bp-1899bp (bold type),编码 521aa，起始密码子AUG附近的核苷酸序列符合Kodak规律(A/GNNAUGG)。SCIRR-69 基因定位于大鼠染色体4q22，由12个外显子和11个内含子组成。(见图3) SCIRR-的蛋白的特性
对SCIRR-69蛋白序列进行蛋白质家族和功能结构域分析。在297aa-357aa 存在一个bZIP结构(斜体代表碱性区，方框部分代表Leu Zipper)，其下游 379aa-398aa存在一个跨膜区结构(下划线部分)，C端存在一个Sl蛋白酶识别 位点(阴影部分)(图.4)。根据这些线索，我们推测SCIRR-69蛋白是一个跨膜的 转录因子。对蛋白数据库进行BLAST比对，搜索到两条与SCIRR-69蛋白高度同 源的序列，它们分别是人的CREB3L2和小鼠的CREB3L2，这两者与SCIRR-69蛋白 的同源性分别高达90%, 97%。据此推测，SCIRR-69蛋白可能相当于大鼠的 CREB3L2。 SCIRR-69蛋白的氨基酸序列与CREB/ATF转录因子家族成员OASIS m 具有46.56%的同源性(图5 A) 。 SCIRR-69蛋白bZIP结构域的氨基酸组成与该 家族多个成员都有很高的相似性，如0ASIS、 CREB-H、 CREB3和CREB4 (图5B)。 此外，SCIRR-69蛋白的整体结构特点与CREB/ATF家族分子相同(图6)，它是 该家族的一个新成员。
SCIRR-69蛋白作为抗原的应用
1. 1抗原表位的计算
为提高针对SCIRR-69抗体的特异性，避免跟其它bZIP家族分子之间的交叉 反应，我们采用优势抗原表位免疫动物制备抗体的方法。在进行抗原表位预测时， 综合考虑亲水性、抗原性、挠性、可及性、极性、外露表面、拐角等方面的因素， 分析发现，SCIRR-69蛋白N端特异性较高、抗原表位分布集中，最终确定对 14aa-160aa进行表达，将这一片段命名为BCE (B Cell Epitope)。
1.2. BCE编码片断的扩增及重组表达质粒鉴定
采用高保真PCR从大鼠脊髓cDNA文库中扩增到BCE蛋白片段对应的编码序 列，电泳检测扩增产物大小与预期一致(图7A)。将该片段按常规分子克隆技术 插入到编码His tag的pET-32a质粒建立重组表达载体pET-32a-BCE。重组克隆 测序结果表明，质粒构建完全正确(图7B)，可用于下一步表达实验。 1. 3构建原核重组表达载体
1) 将BCE编码片段与pET-32a质粒同时进行BamH I +Xhol I双酶切；
2) 双酶切的产物进行胶回收，方法同前；
3) 双酶切回收的BCE片段与双酶切的pET-32a载体在T4 DNA Ligase作用 下连接；
4) 连接产物按常规方法转化新鲜制备的BL21感受态细菌；
5) 挑克隆以菌落PCR或BamH I +Xhol I双酶切鉴定；
6) 鉴定插入片段大小正确的重组子进行测序验证，插入序列完全正确的克 隆用于下一步诱导表达实验。
1.4重组蛋白的诱导表达
1 )取pET-32a-BCE菌种接种于5ml LB液体(Amp+)中，37。C振荡培养12-16hr;
2) 次日将过夜培养的饱和菌液按h IOO扩大至LB液体(Amp+)中；
3) 培养至0D-0.4 0.6(大约2 3h)时，力B IPTG (终浓度为lmM)进行诱 导表达；
4) 37。C诱导表达5hr后离心收集菌体(7700g， 4。C离心30min);
5) 将菌体进行超声破碎，离心后同时收集沉淀和上清以备作电泳分析；
6) SDS-PAGE检测诱导表达产物的存在形式及丰度。 1.5重组蛋白纯化
1) 诱导后收集的菌体称湿重、重悬于Lysis buffer (2 5ml/g);
2) 加入溶菌酶(终浓度lmg/ml)，冰浴30min;
3) 超声破碎菌体，lOOOOg离心30min,收集上清用于后续的分离纯化；
4) 以5V Lysis buffer平衡填有Ni-NTA agarose的纯化柱，流速小于 2ml/min;
5) 超声上淸过滤后上柱，流速控制在0.5 lml/min，收集上样流出液做SDS
一PAGE电泳分析；
6) 以5 10V Wash buffer清洗纯化柱，以除去吸附和非特异性结合的蛋白， 收集流出液以备做SDS—PAGE电泳分析；
7) 以5V Elution buffer洗脱目的蛋白，分步收集洗脱产物，目的蛋白一 般在2V 3V时洗脱下来，洗脱得到的目的蛋白测浓度后分装存于-7(TC备用；
8) SDS—PAGE电泳检测每个收集管中的蛋白。
1. 6重组蛋白在原核系统中的大量诱导表达与纯化
挑选测序正确的重组子，在37。C， lmM IPTG条件下进行诱导表达。诱导5h 后，融合蛋白呈现高表达(图8A lane 2)，且以可溶性形式存在于超声后上清 中(图8Alane3)， SDS-PAGE电泳检测到的融合蛋白分子量在42kDa左右(图8A lane 5)，而这一蛋白的理论分子量为34kDa。由于在原核表达系统中不存在翻译 后修饰，为确认纯化得到的蛋白是我们表达的BCE目的蛋白，将其进行了 MALDI-TOF-MS鉴定，结果表明这一条带能够与BCE目的蛋白序列匹配(图8B)， 证明这就是表达的BCE重组蛋白。
BCE重组蛋白带有His tag，通过填有Ni-NTA agarose的纯化柱将其分离纯 化。纯化后的目的蛋白纯度达90%以上(图8A lane5)，可以用于下一步实验。
1. 7融合蛋白的Thrombin酶切及目的片段的回收
以上表达、纯化的重组蛋白包含了pET-32a载体自身表达的His tag端片段 和BCE目的片段，以该重组蛋白免疫动物可能会对His tag端片段产生免疫应答 从而产生针对BCE目的蛋白的抗体。为了在ELISA实验中检测针对BCE目的蛋白 的抗血清效价，我们对表达的重组蛋白进行了 thrombin酶切以去除His tag端 片段，然后将BCE目的片段以Ni-NTA agarose回收用于后续ELISA实验。酶切 后His tag端片段由129aa组成，理论分子量为14. 2kD， BCE目的片段端由181aa 组成，理论分子量为19. 9kD， SDS-PAGE检测到的酶切产物各片段大小与预期一 致。
动物免瘇及抗钵制备免疫动物
l)初次兔疫纯化的重组蛋白与等体积弗式完全佐剂充分混匀，日本大耳白
兔背部注射簡U g蛋白/只，Balb/c小鼠腹股沟注射100 ix g蛋白/只；
2) 首次加强免疫初次免疫后4wks进行首次加强免疫，每只日本大耳白兔 注射500 u g重组蛋白，每只Balb/c小鼠注射50 u g重组蛋白；
3) 第二次加强免疫首次加强,疫后4wks进行第二次加强免疫，剂量同上；
4) 第三次免疫后7-10d取血(兔从耳缘静脉取血，鼠从尾静脉取血)进行 ELISA实验，检测抗体的特异性及效价；
5) ELISA检测兔抗血清效价理想时，从颈动脉采血，采集的血液室温斜置 30min，然后移至4'C待血清析出，收集血清后1000rpm离心10min，分装-70。C 保存；
6) ELISA检测小鼠抗血清特异性及效价理想时，再进行一次加强免疫准备进
行单克隆抗体制备。
Thrombin酶切重组表达蛋白
1) 按Thrombin说明书，每毫克重组蛋白采用5ml反应体系，室温酶切16h;
2) 将酶切产物过Ni-NTA agarose纯化柱，则BCE目的片段存在于流出液中， 载体自身携带的His tag端片段与Ni-NTA agarose结合；
3) 用洗脱液将His tag端片段洗脱下来；
4) SDS-PAGE检测BCE目的片段与His tag端片段。
5) BCE目的蛋白定量后分装冻存备用。 ELISA法榼铡扰血情效价
1) 稀释抗原用CB将酶切得到的目的蛋白稀释至所需浓度2-15l!g/ml;
2) 包被抗原于96孔板中每孔加100ul稀释的目的蛋白，4。C包被过夜；
3) 倾尽孔中液体，PBST洗漆5minX3';
4) 封闭:加封闭液200ul/孔；37。C封闭lh，然后PBST洗5minX3，；
5) —抗反应加入倍比稀释的抗-SCIRR69兔血清，100ul/孔，37。C孵育lh;
6) 倾尽孔中液体，PBST洗涤5minX4';
7) 二抗反应每孔加100ul以PBST稀释的HRP-IgG (1: 5000)， 37。C孵育
lh;
8) 倾尽孔中液体，PBST洗涤5minX4';
9) 显色每孔加100ul底物反应液，于暗处室温显色1-5min;
10) 终止显色合适时，每孔加50ul 2M H2S04终止反应，测0.D450。
10)结果第三次免疫10d后，分别从日本大耳白兔和小鼠取少量血分离抗 血清，通过ELISA方法检测抗体的效价及特异性。包被的抗原为切去His tag的 BCE目的片段。以免疫前抽取正常动物的血清作为对照，抗原包被量为5-15 ug/ml 。经检验，兔及小鼠抗血清效价均在104以上(图9)。
多克隆抗血清鉴定
提取脊髓组织总蛋白进行WB，检测BCE重组蛋白免疫的兔多克隆抗血清的特 异性。结果显示，在80kD左右有一条带，此外在60kD左右也有两条清晰的带(图 10A)。 SCI-69蛋白的理论分子量是57kD， 60kD左右的条带基本与之吻合。文献 报道，与SCI-69蛋白具有相同结构特点的OASIS蛋白(519aa)、ATF6蛋白(670aa) 都存在N端糖基化修饰，以它们各自特异性抗体进行WB时，免疫印迹条带分别 出现在80kD和90kD。据此分析，以多克隆抗血清检测到的80kD左右条带可能 SCI-69蛋白的糖基化形式。
为了检测兔多克隆抗血清用于免疫标记的效果，我们将构建的GFP融合表达 载体pEGFP-N1-SCI-69转染C0S7细胞，以多克隆抗血清对转染SCI-69与GFP融 合蛋白的细胞进行免疫标记。结果显示，转染空载质粒pEGFP-Nl的对照组细胞 未见免疫标记(图10Bal-a4);在转染重组质粒组，未被转染的细胞没有标记， 只有表达SCI-69蛋白的细胞才能被多克隆抗血清标记，而且标记信号与GFP分 布完全重叠(图10Bbl-b4)，证明多克隆抗血清用于免疫标记时具有较高的特异 性。
单克睹抗体制备及鉴定
为深入研究SCIRR69的功能，我们进一步制备了单克隆抗体。单克隆抗体的 特异性及效价检测，以脊髓组织总蛋白进行WB检测，免疫印迹结果显示，在80kD 处有单一条带(图11A)。这与上面多克隆抗血清鉴定结果中出现的80kD左右条 带相吻合，也说明该抗体具有良好的特异性。进一步以单克隆抗体对原代培养的大鼠皮层神经元进行免疫标记，SCIRR-69 蛋白的标记信号特异的出现在神经元的胞浆和突起中，细胞核未见标记，说明 SCI服-69蛋白定位于神经元的胞浆中(图11B)。
单克隆抗体制备步骤
1) 在融合前两周复苏骨髓瘤细胞，保证融合时骨髓瘤细胞处于对数生长期；
2) 融合前一天制备饲养细胞(小鼠腹腔巨噬细胞) ，
3) 最后一次加强免疫3d后，无菌条件下取出脾脏，用不完全培养液洗一次， 置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液；
4) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0， 1000rpm离心5min，弃上清，用不完全 培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次；
5) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次；
6) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 : 5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内 用不完全培养液洗1次，1500rpm离心5min;
7) 弃上清，用滴管吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动；
8) 细胞融合:lmin内加入预热的lml銜EG (含5%画)，边加边搅拌；
9) 加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2min分别加入lml， 2ml， 3ml， 4ml， 5ml和10ml;
10) 离心，800rpm， 7min，弃上清;用6ml含20%小牛血清的RPMI1640重
悬；
11) 根据所用96孔板的数量，补加完全培养液，10ml/96孔板，将融合后细
12) 悬液加入到含有饲养细胞的96孔板中，100ixl/孔，37°C、 5%0)2孵箱 培养；融合24h后，加HAT选择培养液维持培养两周；
13) 通过有限稀释法将杂交瘤细胞克隆化；
14) 待克隆长出后，通过ELISA方法筛选出所需要的杂交瘤细胞。 Western blot—检澜单克隆抗体的特异性
l)配制蛋白裂解液(20mM HEPES(PH7.2), l%Triton X-100， 1%去氧胆酸钠， 10ug/ml Leup印tin, 10ug/ml Aprotinin, ImM PMSF);
2) 取正常大鼠脊髓，剪碎、称重后放入裂解液中(lml/200mg组织)，冰上匀
浆；
3) 13000g， 4"C离心30min，总蛋白存在于离心上清中，定量后分装存于-70
。C;
4) 取上述提取的总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离；电泳结束后将凝胶放入电 转缓冲液中平衡10min;
5) 依凝胶大小，裁剪大小相同的滤纸和NC膜，电转缓冲液中平衡5min;
6) 在半干式电转仪的正极极板上依次放置4层厚滤纸、NC膜、凝胶和4层厚 滤纸，赶走气泡，压上负极极板，15v转移60min;
7) 电转结束后，将膜置于丽春红染液中染色，检验转膜的效果；
8) 封闭将膜放入适量封闭液中，室温封闭2h-3h或4'C过夜；
9) 一抗反应:按照0. lml/cm2的比例加入以封闭液稀释的自制的anti-SCI-69 单克隆抗体，室温孵育lh;用TBS-T洗涤10minX3，；
10) 二抗反应:按照O. lml/cm2的比例加入以封闭液稀释的HRP标记的二抗， 室温孵育lh;用TBS-T洗涤:10minX3，;
11) 取等体积ECL试剂A液、B液混合，将ECL混合液加到NC膜上；
12) 用保鲜膜覆盖NC膜，在暗室压X光片，冲片观察结果。 体外培养的皮层原代神经元免疫荧光染色一检测制备的单克隆抗体
(1) 将培养皿中的神经元以0.01M KPBS快速冲洗一次；
(2) 立刻加入4W多聚甲醛室温固定30min，.0.01M KPBS漂洗10minX3，;
(3) 0.3%Triton X-100作用30min;
(4) 加入以抗体稀释液稀释至工作浓度的SCI-69单克隆抗体，4'C孵育过
夜；
(5) 0.01M KPBS中漂洗，10minX3'，除去吸附和非特异性结合的一抗；
(6) 加入以0.01M KPBS (1: 50)稀释的FITC-IgG，室温孵育lh，
(7) O.OIMKPBS漂洗10minX3，;
(8) 复染细胞核Hoechst33258室温孵育15min; O.OIMKPBS漂洗:10min X3 ，；
干燥后以Moviol封片，激光共聚焦显微镜下纪录标记结果。
(9) 将培养皿中的神经元以0.01M KPBS快速冲洗一次；
(10) 立刻加入4l多聚甲醛室温固定30min,0.01MKPBS漂洗10minX3，；
(11) 0. 3%Triton X-100作用30min;
(12) 加入以抗体稀释液稀释至工作浓度的SCI-69单克隆抗体，fC孵育
过夜；
(13) O.OIMKPBS中漂洗，10minX3，，除去吸附和非特异性结合的一抗；
(14) 加入以0.01M KPBS (1: 50)稀释的FITC-IgG，室温孵育lh，
(15) 0.01M KPBS漂洗10minX3，；
(16) 复染细胞核Hoechst33258室温孵育15min;0. OlMKPBS漂洗lOmin X3 ，；
干燥后以Moviol封片，激光共聚焦显微镜下纪录标记结果。 SCIRR-飽irilNA在胚胎发育早期的表达
采用地髙辛标记的RNA探针通过小鼠胚胎整体原位杂交技术检测SCIRR-69 mRNA在不同胎齢的小鼠胚胎中的表达分布情况(图12)。实验组使用antisense probe (与mRNA序列反向互补)，对照组使用sense probe (与mRNA序列一致)。 在E9和E9. 5时，未见标记信号。SCIRR-69 mRNA的表达最早见于E10. 5天，在 前脑泡存在较浅的标记(箭头)。在E11.5天，标记范围扩大，在前脑泡(中空 箭头)、中脑泡(黑箭头)和后脑泡(三角形)都有明显的标记，其中后脑泡标 记最深。在E12天，标记范围进一步扩大，在前脑泡(中空箭头)、中脑泡(黑 箭头)和后脑泡(三角形)部位都有很深的标记，此时标记范围最广，信号最强。 在E13天，标记强度明显降低，仅在前脑(中空箭头)、中脑(黑箭头)和后脑 (三角形)的小范围内出现较弱的标记。
SC1RR-6经基因在正常大鼠体内的组织分布
分别以来源于成年大鼠的大脑、小脑、脑干、脊髓、心、肝、脾、肾、肺、 胸腺、骨骼肌、胰、胃、小肠、大肠、睾丸组织的总RNA为模板，利用SCIRR-69
基因特异性引物进行半定量RT-PCR，检测SCIRR-69 mRNA在大鼠各种组织中的表 达情况，同时扩增GAPDH作为内参。PCR扩增产物电泳检测结果显示，SCIRR-69 基因在检测的16种组织中都存在较高水平的表达(图13)，同时扩增的内参G3PDH 在各组织中的表达水平基本一致。(可以去掉此段落) SCIRR"69 mRM在成年大鼠中枢神经系统的表达
前面的研究结果表明，SCIRR-69 mRNA在成年大鼠具有十分广泛的组织分布。 本研究重点关注它在中枢神经系统中的表达分布情况。本节利用地高辛标记的 RNA探针通过组织冰冻切片原位杂交研究SCIRR-69 mRNA在成年大鼠脑组织及脊 髓组织不同层面的表达模式。结果见图14 A，B，C。
SCIRR-柳蛋白在原代神经细胞中的表达分布
对混合培养的神经细胞进行免疫荧光双标记，即同时采用抗SCIRR-69蛋白 的抗体和神经元/星形胶质细胞/少突胶质细胞特异性抗体进行标记，检测 SCIRR-69蛋白在各种细胞中的表达情况。激光共聚焦显微镜下观察，在神经元的 胞浆和突起都有较强的SCIRR-69蛋白的免疫标记信号，细胞核未见标记(图15 al-a4)。在少突胶质细胞中，也有SCIRR-69蛋白的表达(图15bl-b4)。少数星 形胶质细胞中可见SCIRR-69蛋白的弱标记信号(图15cl-c4)，大多数星形胶质 细胞中未见SCIRR"69蛋白标记信号(图15 d1-d4)。
SCIRR-输蛋白全长及跨膜区缺失体在细胞内定位
将SCIRR-69全长蛋白及跨膜区缺失突变体与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达， 然后转染哺乳动物细胞，通过WB检测融合蛋白在细胞内的表达情况。观察GFP 融合蛋白在细胞内的分布，确定SCIRR-69蛋白及跨膜区缺失突变体的细胞内定 位。由于SCIRR-69蛋白的结构与CREB/ATF转录因子家族非常相似，而该家族的 多个分子定位于内质网(ER)，我们采用anti-KDEL抗体(识别定位于ER的 Grp78(Bip)分子)对转染细胞进行免疫标记，探讨SCIRR-69蛋白是否也定位于 ER。
SCIRR-6錢蛋白全长及跨胰区缺失突变体的细胞内定位
将融合表达载体pEGFP-69FL和pEGFP-69delTM转染C0S7细胞，荧光显微镜
下观察SCIRR-69蛋白全长及跨膜区缺失体与GFP融合蛋白在细胞内的定位情况。 结果表明，SCIRR-69全长与GFP融合蛋白定位于细胞浆，而跨膜区缺失体与GFP 融合蛋白主要定位于细胞核(图16)。转染pEGFP-Nl空载质粒的对照组，GFP在 细胞浆和细胞核呈现均匀分布(图片未显示)。为了确定SCIRR-69蛋白全长是否 同OASIS等分子一样定位于ER，对转染细胞进行了 anti-KDEL抗体的免疫标记， 该抗体特异识别内质网分子伴侣Grp78(Bip)。激光共聚焦显微镜观察结果显示， SCIRR-69全长与GFP融合表达蛋白的分布能够与anti-KDEL抗体标记信号完全重 叠，说明SCIRR-69蛋白全长在i细胞内定位于ER (图16)。 SCIRR-S9在脊 搨伤后不同时间点的表达
提取正常及损伤2h、 ld、 5d、 7d的成年大鼠脊髓组织的总RNA,通过RT-PCR 检测SCIRR"69 mRNA在各个时间点的表达水平。SCIRR-69 mRNA在正常脊髓组织 中有一定量的表达，损伤后2h明显低于对照组，损伤后ld恢复到略高于正常组 的水平，损伤后5d表达量达到最高，7d时又下降至略低于正常组的水平(图17A)。
然后分别提取正常及损伤2h、 ld、 5d、 7d的大鼠脊髓组织的总蛋白，以 anti-SCIRR"69单克隆抗体进行WB研究SCIRR-69蛋白在不同时间的表达。结果 表明，SCIRR-69蛋白的表达变化趋势基本与SCIRR-69 mRNA的变化趋势相一致(图 17B)。
SCIRR,蜜白活性的检测及转录激活部位的确定 系列缺失突变钵扩增
通过高保真PO 从前期构建的pEGFP-69FL重组质粒中扩增SCIRR-69全长蛋 白及各缺失体对应的编码序列，电泳检测扩增产物大小均与预期相符(图18)。 将各片段按常规方法克隆入pM质粒建立不同长度的SCIRR-69蛋白与GAL4融合 表达的重组表达载体。
在喻乳动物细廳中检測SCIRR~69蛋白的转录撖活活性
SCIRR-69蛋白全长FL1-521定位于内质网，并不是作为转录因子起作用的活 性形式，而跨膜区缺失突变体却能定位于细胞核，很可能是它的活性形式，所以 我们重点关注跨膜区缺失突变体的转录激活活性。实验中我们构建了两个跨膜区
缺失体，分别为1-375aa和1-357aa。分别将SCIRR-69蛋白全长FL1-521或跨膜 区缺失突变体1-375和1-357插入pM载体，建立表达GAL4融合蛋白的重组质粒。 将重组质粒与pFR-luc、 pRL-TK共转染C0S7细胞，pM空载质粒作为阴性对照， pM3-VP16 (存在于单纯疱疹病毒中的转录激活因子)作为阳性对照，转染24h后 检测相对荧光素酶活性，以相对荧光素酶活性的高低衡量SCIRR-69蛋白及其缺 失体的转录激活活性。为保证实验结果的可靠性，进行三次独立的实验，取三次 结果的均值士方差作为最终数值。荧光素酶活性检测结果显示，FL1-521具有较 高的转录激活活性(空载体的20倍)，1-375跨膜区缺失体无转录激活活性，1-357 跨膜区缺失体具有较低的转录激活活性(空载体的2.6倍)。此外，我们将上述 质粒按同样的方法转染人293细胞及大鼠B104细胞，结果与在C0S7中得到的细 胞一致，说明SCIRR-69蛋白在哺乳动物细胞中普遍具有转录激活活性。 SCIRR-69蛋白转录激活结构域的确定
构建了系列C端和N端缺失突变体，6个C端缺失体根据缺失片段长度的不 同分别命名为CDEL1-375 、 CDEL1-357 、 CDEL1-318 、 CDEL1-250 、 CDEL1-150 、 CDEL1-60 ， 2个N端缺失体分别命名为NDEL 51-521 、 NDEL 101-521。将各缺 失体对应的编码序列分别插入pM载体构建GAL4融合表达重组质粒，然后与 pFR-luc和pRL-TK共转染C0S7细胞，24h后检测相对荧光素酶活性。pM空载质 粒作为阴性对照，pM3-VP16作为阳性对照。结果发现，Leucine Zi卯er缺失后 (1-318)，转录激活活性有了很大幅度的提高，说明Leucine Zipper区的空间 结构可能抑制了融合蛋白的活性。当缺失到仅剩N端60aa时，还具有相当高的 转录激活活性；但当N端50aa缺失时，只有很低的转录激活活性；当N端100aa 缺失时，已经完全丧失了转录激活活性，说明SCIRR-69蛋白的转录激活区位于 laa-60aa的片段内。
细胞处于内质网应激状态时SCIRR-69蛋白的定位
在大鼠皮层原代神经元培养液中加入引起内质网应激的试剂[5]: luMTG (ER Ca" ATPase抑制剂)或3 u g/ml Tm(N-端糖基化抑制剂)作用2h后，以
anti-SCIRR-69单克隆抗体进行免疫荧光标记检测SCIRR-69蛋白的定位。结果显 示，在TG或Tm处理组，SCIRR-69蛋白的免疫标记信号与对照组神经元一样，仅 出现于细胞浆(图19A)，细胞核未见明确标记，说明与OASIS、 ATF6等CREB/ATF 家族分予不同，SCIRR-69蛋白不能在内质网应激状态下发生切割，它可能通过别 的途径被激活。
神经元损伤时SCIRR-69蛋白的定位
将大鼠皮层原代神经元划伤后，以anU-SCIRR-69单克隆抗体进行免疫荧光 标记检测SCIRR-69蛋白在损伤神经元中的表达定位。在正常神经元中，SCIRR-69 蛋白的免疫标记信号仅出现于细胞浆(图19B)，而当神经元发生损伤后，有些细 胞的胞浆和胞核都能被anti-SCIRR-69抗体标记，而且细胞核中的标记信号强度 同胞浆基本一致，说明在这些细胞中，SCIRR-69蛋白能够以某种形式进入细胞核， 这--现象在损伤后lh (图19B bl-b3)和12h (图19B. cl-c3)尤为明显。观察 还发现，细胞浆和细胞核均被anti-SCIRR-69抗体标记的神经元在整个培养皿中 呈均匀分布，与细胞距离损伤线的远近无关。
损伤应激致SCIRR 69切割入核导致蛋白分子发生切割变化
提取正常及损伤后不同时间的大鼠脊髓组织总蛋白，以anti-SCIRR-69单克 隆抗体通过WB检测在脊髓组织发生损伤时SCIRR-69蛋白免疫印迹条带的分布。在 正常脊髓蛋白中，仅出现一条分子量约为80kD的条带，而在损伤4h、 12h、 ld、 3d和5d的脊髓蛋白中，除80kD条带外，还有一条较弱的50kD条带(图20A)，这一 条带可能是SCIRR-69蛋白在损伤应激条件下切割产生的N端活性形式。
同样地，以正常大鼠皮层原代神经元细胞总蛋白进行WB时，仅在80 kD处 出现条带，而当原代神经元损伤lh、 12h后，除80kD条带还有一条微弱的50kD 条带(图2()B)。可能由于通过剪切产生的活性蛋白的丰度很低，所以通过WB只 能检测到条带很弱的缘故。
多种技术发现SCIRR69直接调节BDNF转录
通过染色质免疫沉淀及PCR方法证实SCIRR-69蛋白能与BDNF启动子DNA相
互作用(图21)。将构建有BDNF启动子载体及SCIRR 69全长和各截短型载体共 转染细胞，通过双荧光素酶实验也发现SCIRR-69蛋白截短型与BDNF启动子相互 作用能明显促进报告基因转录(图22)。为再次确认SCIRR 69蛋白与BDNF转录 调节之间的关系，通过RNAi沉默SCIRR 69基因的表达，观察到干扰SCIRR 69 基因后BDNF表达也出现相应下调(图23)。以上实验确认SCIRR 69蛋白作为BDNF 转录因子在BDNF转录调节中发挥作用。用该基因378截短型构建真核表达载体 转染PC12细胞，收集细胞培养上清进行胎鼠皮层组织块培养，发现378截短型 表达质粒转染细胞后收集上清能显著促进胎鼠皮层组织突起生长，突起生长密度 及长度明显优于BDNF处理组(图24)。
通过上述实施例，本发明可能用于制备促进BDNF转录，促进神经再生，治 疗神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经退行性变疾患的药物；可用于制备修 复脊髓损伤的药物和研究试剂。
权利要求
1.一种SCIRR 69号基因和编码蛋白为如下(a)或(b)所述的蛋白质(a)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的氨基酸序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质且与(a)的蛋白质具有相同的功能，所述功能是作为BDNF的转录调节因子。
2. —种基于SCIRR 69号基因和蛋白序列新命名的基因和蛋白，它编码如权 利要求l所述蛋白质。
3. 按照权利要求1或2所述的SCIRR 69基因，具有各种突变形式。
4. 按照权利要求1所述SCIRR 69号基因编码蛋白作为抗原的应用，具有特异抗原及基于抗原制备的特异性抗体。
5. 按照权利要求4所述SCIRR 69号基因编码蛋白的特异抗原磷酸化位点及 基于磷酸化位点制备的特异性抗体。
6. 按照权利要求1所述SCIRR 69号基因编码蛋白的功能；包括直接和/或间 接调节BDNF转录，促进损伤的神经再生，以及尚待发现的其他功能。
7. 按照权利要求1或2所述的SCIRR 69基因、编码蛋白或各种剪切长度的 蛋白在制备治疗神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经退行性变疾患治疗药物 中的应用。
8. 按照权利要求1或2所述的SCIRR 69基因、编码蛋白或各种剪切长度的 蛋白在制备治疗神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经退行性变疾患以及其他 相关疾病研究、诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了属于基因工程领域的涉及SCIRR 69基因、调节BDNF转录及在生物医学研究、生物治疗药物研发中的应用。具体涉及从大鼠分离的脊髓损伤修复相关(SCIRR 69)基因及其编码蛋白，特异性抗原表位，以及该基因在脊髓损伤修复过程中起作用的转录因子及其编码序列。调节BDNF转录的作用及尚待发现其它功能；SCIRR69蛋白在神经元的生长、分化以及轴突可塑性方面具有重要作用；特异性的抗原和基于抗原制备特异性抗体；可能用于制备促进BDNF转录，促进神经再生，治疗神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经退行性变疾患的药物；可用于制备修复脊髓损伤的药物；可用于开发相关研究和诊断试剂。所提供的SCIRR69蛋白结构清楚，易于制备。同时可作为抗原制备特异性抗体。
文档编号C12N15/12GK101173279SQ200710063848
公开日2008年5月7日 申请日期2007年2月13日 优先权日2007年2月13日
发明者倪艳丽, 勇 刘, 涛 刘, 刘少君, 超 常, 时小燕, 景书谦, 欣 李, 阙海萍, 马振莲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所