专利名称：一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
肿瘤已经成为严重威胁人类生存健康的重大疾病之一，其发病率及死亡率均呈上升趋势。发现和研究肿瘤差异表达基因有助于阐明肿瘤发生的分子机制，有助于肿瘤的诊断，预后，并可以为肿瘤的治疗提供新的靶点，从而成为基因药物和基因治疗的基础。寻找差异表达基因的方法很多，近年来发展的高通量的筛选方法为这方面的研究注入了新的活力，近年来文献报道的疾病相关基因的研究成果，其中很大一部分是用高通量的方法筛选出来，并在后续的研究中得到验证的。高通量的方法主要有基因表达的系列分析(serialanalysis of gene expression，SAGE)，cDNA芯片(cDNA microarray)，寡核苷酸芯片(oligo-nucleotides microarray)，以及抑制性差减杂交(suppression subtractivehybrydization，SSH)，差异显示(differential display，DD)等。而且为了改善肺癌的治疗效果，目前很多研究致力于肺癌的早期诊断及分子分型所指导的靶向治疗。随着系统的基因组、转录组和蛋白质组的研究方法和技术平台的出现和发展，人们对肺癌等肿瘤发生发展的认识不断的推进，试图对肺癌等肿瘤进行精确的分子遗传学分型，寻找能够用于早期诊断的分子标志物，预测个体的放化疗敏感性，准确地判断并改善肺癌患者的预后及生存质量。
肺癌的分子生物学研究表明，肺癌的发生、发展是一个多阶段、多步骤、多基因参与的过程，涉及到大量相关基因结构和表达调控的改变。因此了解肺癌变过程中的精确分子机制，寻找和肺癌早期发现密切相关的分子标志物具有重要的意义和实现的可行性。在肺癌发生的诸多遗传学改变中，抑癌基因的失活发挥着重要作用。肺癌发生过程中最早出现的一种遗传学改变是染色体3p(short arm of chromosome 3)的功能或组成性缺失，30％存在3p异常的肺癌患者，其非恶变支气管上皮也已出现了同样改变。研究发现染色体3p包含着多个抑癌基因，如位于3p24的RAR(retinoic acid receptor beta)、位于3p21.3的RASSF1A(Ras association domain family I)、位于3p14.2的FHIT(fragile histidinetriad)，还有CACNA2D2、101F6、NPRL2、SEMA3B、SEMA3F、FUS1、DLEC1、RBSP3A、RBSP3B等等(Zaborovsky，2005)。此外，1p、1q、5q(APC/MCC cluster)、8p、9p21(p16INK4)、11p13(WT1)、11p15、13q14(RB)、17p13(p53)、22q等染色体区段在癌变过程中亦经常受累，其中也包含着若干具有抑癌功能的基因，它们通过缺失、突变、甲基化等方式失活，改变细胞生长分化特性，促进癌变的发生。
在过去，要对一个新基因开展研究是很困难的，而现在我们可以灵活利用生物信息学规律，从中尽量发掘信息，指导进一步的实验研究。DENN结构域(differentially expressedin neoplastic versus normal cells domain)存在于多种信号蛋白中，但是其功能之谜尚未完全解开。一些含有DENN结构域的蛋白，如例如大鼠的Rab3GDP/GTP交换蛋白，小鼠的Rab6IP1(Rab6 interacting protein 1)和Caenorhabditis elegans的AEX-3蛋白都可以和Rab家族的GTPases相互作用。一般来说DENN结构域周围常常伴随存在uDENN和dDENN结构域，它们可能对DENN的功能至关重要。除了核心的疏水氨基酸序列，DENN结构域中还有一些保守的氨基酸序列，可能与它的酶活性相关。DENN结构域出现在Rab3GEP这类蛋白中说明它有可能具有鸟苷酸交换的活性，但是目前这一推论还未证实。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肿瘤相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的肿瘤相关蛋白，来源于人，肿瘤相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤相关的由(a)衍生的蛋白质。
所述(a)的蛋白质名称为DENND2D-v2，由468个氨基酸残基组成，自序列4的氨基末端第47至145位氨基酸残基为uDENN结构域，自序列4的氨基末端第146至330位氨基酸残基为DENN结构域，自序列4的氨基末端第368至435位氨基酸残基为dDENN结构域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列4的上述三个结构域外进行的取代和/或缺失和/或添加。
所述(b)的蛋白质的氨基酸序列具体可为序列表中的序列3。该蛋白质名称为DENND2D-v1，由471个氨基酸残基组成，自序列3的氨基末端第5至148位氨基酸残基为uDENN结构域，自序列3的氨基末端第149至333位氨基酸残基为DENN结构域，自序列3的氨基末端第371至438位氨基酸残基为dDENN结构域。
上述肿瘤相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述肿瘤相关蛋白的cDNA基因，具体为如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或序列2；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述肿瘤相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
序列表中的序列1由2062个脱氧核糖核苷酸组成，其编码序列是自序列1的5′端第201至1616位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列3的DENND2D-v1。
序列表中的序列2由1905个脱氧核糖核苷酸组成，其编码序列是自序列2的5′端第57至1463位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列4的DENND2D-v2。
DENND2D-v1和DENND2D-v2的基因组基因染色体定位1p13.3，DENND2D-v1跨人类基因组约13.48kb，DENND2D-v2跨人类基因组约17.23kb，两者均含有12个外显子，共用第2-12外显子，第1外显子有差别。
上述肿瘤相关蛋白的编码基因可插入现有的原核或真核表达载体，适宜的载体包括细菌质粒，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒等。含有上述肿瘤相关蛋白编码基因的重组表达载体可以用来转化适当宿主细胞，如大肠杆菌，酵母菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞等，以使宿主表达此多肽。
含有上述肿瘤相关蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因宿主菌也属于本发明的保护范围。
上述肿瘤相关蛋白，或保守变异多肽或片段，或表达它们的细胞可以作为抗原用来生产抗体，在临床上用于肿瘤的临床诊断、治疗、疗效评价等。所述抗体可以是单克隆抗体，或多克隆抗体，还包括嵌和、单链和人源化的抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。可用现有的方法，如免疫动物、培养杂交瘤方法，制备上述肿瘤相关蛋白单克隆或多克隆抗体。该抗体可以用于检测上述肿瘤相关蛋白的存在或水平，或用于检测上述肿瘤相关蛋白基因。
本发明的第三个目的是提供一种抗肿瘤药物。
本发明所提供的抗肿瘤药物，它的活性成分是含有上述肿瘤相关蛋白编码基因的重组哺乳动物基因表达载体。
用于构建所述重组表达载体的出发载体可为现有的哺乳动物基因表达载体。
所述哺乳动物基因表达载体包括质粒载体和病毒载体两大类。如不带真核复制起始序列的质粒型表达载体pTK2、pHyg和pRSVneo等，带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体、SV40衍生的表达载体pMSG、pSVT7和pMT2等，牛乳头瘤病毒(BPV)衍生载体，人疱疹病毒(EBV)衍生的表达载体，人腺病毒衍生的表达载体，反转录病毒衍生的表达载体。
该抗肿瘤药物可用于预防和/或治疗肺癌，食管癌或喉癌等上呼吸消化道肿瘤。
上述药物中还可含有佐剂DDA和/或MPL和/或Quil-A和/或RIBI佐剂和/或saline(生理盐水)或其它佐剂，如铝佐剂，福氏佐剂等。
本发明的药物可制成注射液、粉剂、膏剂、纳米制剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照基因药物/寡核苷酸药物领域的方法制备。
本发明的肿瘤相关蛋白在小鼠成纤维细胞内稳定高表达可以明显抑制该细胞的恶性转化；在mRNA水平检测其在细胞系中的表达结果表明，肺癌细胞系中的表达水平显著低于原代培养的正常支气管上皮细胞；在肺癌临床组织标本中检测其表达水平结果表明，肺癌组织的表达水平明显低于其周边的正常组织。本发明的肿瘤相关蛋白及其编码基因、本发明的肿瘤相关蛋白抗体和表达本发明的肿瘤相关蛋白适宜载体，可用于肿瘤的体外诊断、预后。含有上述肿瘤相关蛋白编码基因的重组真核表达载体在导入肺癌细胞系中后，能单独引起肺癌细胞系的生长变缓及致瘤性减弱。本发明为开创新的临床诊断、治疗、疗效评价及预后指标提供了一个新的基础。
图1a为pGEM-T Easy-DENND2D-v1载体的正向测序部分结果图1b为pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-DENND2D-v2载体的正向测序部分结果图2为真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B的物理图谱图3为DENND2D-v2基因在肺癌相关细胞系中的表达图4为RT-PCR分析DENND2D-v2基因在肺癌组织中的表达改变图5为DENND2D-v2抗体特异性和主要非特异性结合示意6为DENND2D-v2抑制NIH/3T3细胞形成集落图7为RT-PCR鉴定为稳定高表达DENND2D-v2的H1299单克隆细胞株图8为Western Blot鉴定稳定高表达DENND2D-v2的H1299单克隆细胞株图9为H1299稳定转染细胞MTT细胞增殖实验图10为H1299稳定转染细胞集落形成实验的代表11a为H1299稳定转染细胞软琼脂集落形成实验(裸眼观察)图11b为H1299稳定转染细胞软琼脂集落形成实验(光镜下观察)图12a为注射细胞后的裸鼠成瘤照片图12b为皮下注射细胞后3-6周内各组裸鼠肿瘤生长曲线示意13为pcDNA3.1/mycHis(-)B、pcDB3.1-DENND2D-v2、pcDB3.1-BAX转染H1299细胞36小时后的流式细胞仪检测细胞凋亡情况图14为DENND2D-v2基因对H1299细胞周期影响的流式细胞仪检测结果图15a为RT-PCR检测细胞周期相关调控因子的表达图15b为Western法检测细胞周期相关调控因子的表达图16为划痕实验检测DENND2D-v2基因对细胞迁移性的影响图17为DENND2D-v2基因对H1299细胞迁移性的影响图18为DENND2D-v2基因对H1299细胞侵袭性的影响具体实施方式
实施例1、DENND2D-v2和DENND2D-v1及其cDNA基因的克隆针对序列表中的序列1，2分别设计DENND2D-v1和DENND2D-v2基因全长阅读框架的特异引物序列如下DENND2D-v1上游引物5’CCAGAGATGGAAGGACAAGTG3’下游引物5’GTCATTCTTATTCACCACAGCTC3’DENND2D-v2上游引物5’CACTCCAGGGGCCATGGATG3’下游引物5’GTCATTCTTATTCACCACAGCTC3’用上述引物，以人正常肺组织cDNA文库(ClontechK1420-1)为模板进行PCR扩增反应，反应条件如下反应体积50μl，其中含有人正常肺组织cDNA模板5μl(5ng)引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μMdNTP终浓度各200μMTaq DNA聚合酶 2.5U10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5μl用双蒸水补足至50μl体积。
反应温度、时间94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分钟，扩增30个循环；最后在72℃下延伸10分钟。
扩增产物为3’带有碱基A的3’突出粘端片段，用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pGEM-T EASY载体(Promega，A1360)在16℃下连接8小时，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM 3700 DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，获得DENND2D-v1和DENND2D-v2基因的全长cDNA，长度分别为2062bp和1905bp(序列如序列1，2)，各自编码471和468个氨基酸，氨基酸序列如序列3，4所示。将含有序列1，2即DENND2D-v1和DENND2D-v2的cDNA基因的pGEM-T EASY载体分别命名为pGEM-T-DENND2D-v1和pGEM-T-DENND2D-v2。pGEM-T-DENND2D-v1载体的测序结果如图1a所示。
为了进一步检测DENND2D-v1和DENND2D-v2基因的功能，接着构建含有DENND2D-v1或DENND2D-v2cDNA的真核表达载体。采用真核表达载体pcDNA3.1/MycHis(-)B(Invitrogen，V85520，以下缩写为pcDB)与DENND2D-v1基因重组构建真核表达载体pcDNA3.1B-DENND2D-v1(以下缩写为pcDB-DENND2D-v1)。pcDB是设计用于重组蛋白在哺乳类动物细胞系中高表达的载体，它含有人巨细胞病毒CMV启动子，可在哺乳类动物细胞系中实现高表达。用EcoRI(Promega)将DENND2D-v1的cDNA基因片段从pGEM-T-DENND2D-v1载体上切下，同时用EcoRI酶切真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B(Invitrogen，V85520)(图2)，按照J.Sambrook等，分子克隆实验指南第三版第68至71页的方法，将酶切后的DENND2D-v1的cDNA基因片段与载体在16℃下连接8小时，转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选生长的菌落，提取质粒，用EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有插入2062bp片段的阳性克隆，通过序列测定(使用ABI PRISM 3700 DNA分析仪，同上)，选出正确的正向插入序列1的cDNA基因质粒，命名为pcDB-DENND2D-v1。而DENND2D-v2(1905bp)的cDNA基因片段是由PCR扩增得到的序列2，回收后直接正向连入pcDNA3.1/V5-His TOPO TA(Invitrogen，K4800)真核表达载体，经双向测序和酶切鉴定无误，得到正向插入序列2的cDNA基因质粒，命名为pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-DENND2D-v2，简称pcDB3.1-DENND2D-v2。pcDNA3.1/V5-His TOPOTA-DENND2D-v2载体的测序结果如图1b所示。
实施例2、RT-PCR检测DENND2D-v1和DENND2D-v2基因在肺癌相关细胞系及肺癌组织中的表达水平为了检测DENND2D-v1和DENND2D-v2基因在肿瘤和正常组织细胞间的表达差异，本实施例提取了肺癌相关的细胞系的总RNA，利用RT-PCR来检测其mRNA转录的变化。
1、DENND2D-v1和DENND2D-v2在肺癌相关细胞系中的表达水平检测如下肺癌相关细胞系PAa(人肺腺癌细胞系)，A549(人肺腺癌细胞系，ATCC，CCL-185)，GLC-82(人肺腺癌细胞系)，LTEP(人肺鳞癌细胞系)，H520(人肺鳞癌细胞系，ATCC，HTB-182)，H2170(人肺鳞癌细胞系，ATCC，CRL-5928)，PG(人肺大细胞癌细胞系)，H460(人肺大细胞癌细胞系，ATCC，HTB-177)，H1299(人肺大细胞癌细胞系，ATCC，CRL-5803)，Y-BE111(人永生化肺支气管上皮细胞系Y-BE111代)，M-BE37(人永生化肺支气管上皮细胞系M-BE 37代)，M-BE206(人永生化肺支气管上皮细胞系M-BE 206代)，以及15例原代培养的正常支气管上皮细胞。
(1)肺癌相关细胞系及细胞的体外培养以及总RNA的提取将各细胞系细胞按照1.5×106个细胞/皿铺于10cm平皿中，用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)培养PAa、A549、G12-82、LTEP、H520、H2170、pG、H460和H1299，用无血清条件培养基培养Yp111、Mp37、Mp206和15例原代培养的正常支气管上皮细胞。细胞生长至指数生长期，融合率约80-90％时，胰酶消化，血清终止。PBS洗细胞两次，1,000g离心5分钟，弃上清。每一平皿加入2ml TRIzol试剂，室温放置3-5分钟，吹打混匀，将悬液移入一7ml离心管中，室温孵育5分钟。每管加入400μl氯仿(1/5TRIzol体积)，颠倒混匀，瞬时离心，室温放置5分钟。12,000g，4℃离心15分钟，小心将上层无色的水相移至新的7ml离心管中(不要触及中层蛋白相)，每管加入1ml异丙醇(1/2TRIzol体积)，室温放置10分钟。12,000g，4℃离心10分钟。去上清，每管用2ml 75％乙醇(1倍TRIzol体积DEPC水配制)洗涤，7000g，4℃离心5分钟。重复一次。尽量去尽乙醇，超净台室温干燥15-20分钟，每管视RNA沉淀的多少加入适量去RNase和DNase的纯水。放置片刻充分溶解，-80℃保存或直接进入逆转录步骤。
(2)RNA定量用紫外分光光度计测定OD260及OD280的值，计算RNA的浓度；取1μg RNA，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，鉴定RNA质量。
(3)RT-PCR1)配制RNA/primer反应体系，冰上操作Oligo dT(12-18)(0.5μg/μl) 1μlRandom Primer(0.5μg/μl)0.5μl总RNA(根据浓度决定体积) 5μgNuclease Free H2O to 10μl
混匀，70℃水浴5分钟，立即放置于冰上2分钟，瞬时离心收集至管底；2)配制如下混和体系，冰上操作5×First Strand Buffer 4μl0.1M DTT2μldNTP mix(2.5mM each)1μlRNase inhibitor 1μlNuclease Free H2O 1μl将此混和反应体系加入RNA/primer样品混合体系中，轻轻混匀，瞬时离心收集至管底，25℃放置10分钟，42℃水浴2分钟。每管加入1μl SuperScript II逆转录酶，轻轻混匀，瞬时离心收集至管底，42℃水浴反应1个小时。70℃水浴15分钟终止反应。逆转录产物保存于-80℃，或直接进入PCR步骤。
3)PCR反应采用多重PCR，GAPDH作为PCR反应体系的内对照。
①引物及产物长度表1
②PCR反应体系ddH2O 13μl10×Ex Taq buffer 2μldNTP mix(2.5mM each)2μlDENND2D-v1或DENND2D-v2引物(10μM) 1μlGAPDH引物(10μM)0.5μlcDNA模板1μlEx Taq 0.5μl③PCR反应条件94℃5分钟；94℃30秒，57℃30秒，72℃40秒(35cycles)；72℃10分钟；4℃保存。
扩增结果显示除H2170外，8种肺癌细胞系H520、LTEP、A549、PAa、GLC-82、H1299、PG和H460中DENND2D-v2 mRNA的表达都是缺失(1/9 11.1％)，15例原代培养的正常支气管细胞(1N-15N)中DENND2D-v2 mRNA却都还保留(15/15 100％)，而且在代表肺癌癌前病变阶段的永生化支气管上皮细胞系M-BE37(早代)、M-BE206(晚代)、Y-BE111中DENND2D-v2 mRNA表达缺失(0/30％)，H1299-pcDB(按照实施例5的方法制备的转pcDNA3.1/mycHis(-)B的H1299细胞)为阴性对照，SC3-SC5(按照实施例5的方法制备的稳定过表达DENND2D-v2的转pcDB3.1-DENND2D-v2的H1299细胞株)为转染后的阳性对照，如图3所示。此结果说明DENND2D-v2基因在肺癌的正常起源组织中具有正常表达，但在肺癌发生的早期就发生了去表达现象。图3中，M37表示M-BE37，M206表示M-BE206，Y111表示Y-BE111，L表示LTEP，DENND2D表示DENND2D-v2。
而DENND2D-v1 mRNA无论是在正常支气管上皮细胞还是肺癌相关细胞系中均无表达，推测此现象可能为组织特异性表达决定，故在此后的实验中选择DENND2D-v2为研究对象。
2、DENND2D-v2在临床肺癌组织及配对正常组织中的表达水平(1)组织标本来源收取中国医学科学院肿瘤医院胸部肿瘤外科收治的27例肺鳞癌患者的组织样品，包括肿瘤组织及癌旁正常对照肺组织。所有的病人在取得标本时均没有接受过物理化学治疗。所有样品经鉴定肿瘤组织纯度均大于50％。全面收集患者临床资料，复阅全部组织病理切片，统一评价组织分化程度(分为高、中、低分化)，核实淋巴结转移记录，按照2002年第六版UICC的TNM分期标准进行临床分期(Sobin，2002)。患者中有26例男性，1例女性，年龄范围从44岁到76岁，中位年龄63岁，平均年龄59.7岁。
(2)提取组织总RNA取适量大小组织样品(约0.5mm3)，将其用铝箔纸包裹放入液氮中冷冻5分钟以上，敲击初步粉碎样品，将碎屑倒入去RNA酶处理好的研钵中。每份样品加入4ml TRIzol试剂，冰上继续研磨消化，约5分钟，将裂解物吸入新的10ml管中，室温反应5分钟。之后步骤同实施例2中细胞RNA提取部分。
(3)RNA定量及RT-PCR反应同前GAPDH作为内对照，引物序列及产物长度如下表2
(4)结果由27对配对组织的RT-PCR结果可知肺鳞癌组织中DENND2D-v2基因的mRNA表达与癌旁正常肺组织相比较，明显降低甚至完全缺失，发生率为48.1％(13/27)，其余14对组织中有8对表达无明显差异，占29.6％(8/27)；2对无表达，占7.4％(2/27)；还有4对出现了肿瘤组织中DENND2D-v2mRNA水平高于癌旁正常肺组织，占14.8％(4/27)。如图4所示，图中配对肿瘤与癌旁正常肺组织分别以T、N表示；DENND2D表示DENND2D-v2。
实施例3、为了检测DENND2D-v2蛋白的表达，制备Anti-DENND2D-v2抗体委托中科院北京基因组研究所GPA项目组制备与纯化DENND2D-v2多克隆兔抗，所用抗原为纯化的GST-DENND2D融合蛋白。抗体的特异性鉴定采用Western Blot方法完成。具体操作过程如下1、DENND2D-v2蛋白的表达用引物Sense5’CCGGAATTCATGGATGGGCTCGGCCGCC3’和Antisense5’CCGCTCGAGCGGTTATTCACCACAGCTCTTA3’以pcDB3.1-DENND2D-v2为模板PCR扩增得到含有序列2的片段，分别以EcoRI，XhoI(Promega)酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-1(Amersham)，回收酶切产物，连接得到含有DENND2D-v2基因的pGEX-DENND2D-v2融合蛋白表达载体(DENND2D-v2蛋白的N端融合有GST尾巴)，载体序列经测序验证正确。具体酶切，回收，连接过程同实施例1。将获得的质粒转化大肠杆菌菌株BL21，37℃，220rpm培养，用IPTG(Takara)0.5mM诱导表达3.5小时，裂解细菌，蛋白用GST纯化柱(Amersham)纯化，获得纯化的融合蛋白大于1mg，以其作为抗原。
2、DENND2D-v2兔源多克隆抗体的制备免疫动物选用成年雄性新西兰兔，初次免疫用200ug抗原(0.1ml)与等体积弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化后，于背部皮下多点注射。初次免疫后21、42、63天，用弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加强免疫1次，用量同前。每次免疫后7-10天，以步骤1表达的DENND2D-v2为抗原，ELISA方法检测血清效价，达到1×10-4时，放血分离血清。Western blot鉴定抗体特异性结果表明，得到DENND2D-v2的多克隆抗体特异性较差，如图5所示，但可用于Western blot实验中。图5中，H1299-空载表示转染pcDNA3.1/mycHis(-)B的H1299细胞总蛋白，H1299-DENND2D-v2表示转染pcDB3.1-DENND2D-v2的H1299细胞总蛋白。H1299-DENND2D-v1表示转染pcDB-DENND2D-v1的H1299细胞总蛋白。
实施例4、DENND2D-v2抑制NIH/3T3细胞自发转化的体外实验NIH/3T3细胞(ATCC，CRL-1658)是处于转化的边缘的小鼠胚胎成纤维细胞系，对外界刺激比较敏感，是研究基因促进或抑制转化功能的理想细胞模型。故本实施例用它来证明DENND2D-v2基因能抑制其自发恶性转化的能力。
(1)、建立DENND2D-v2稳定转染的NIH/3T3细胞系NIH/3T3细胞系按照ATCC培养要求进行培养。转染前一天铺2×105个细胞/孔到6孔板，第二天分别转染空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B和pcDB3.1-DENND2D-v2，转染按照LipfectaminTM2000说明书进行。转染后24小时，消化细胞，按照1比5将细胞传代，每组细胞2个孔，2ml培养基混匀培养；18小时后更换新鲜培养基，加入Geneticin至终浓度800μg/ml；每三天更换新鲜培养基，维持Geneticin浓度，直至选择集落长出，约3周；结晶紫染色取出培养板，弃去培养基，用PBS洗两遍，冰冷的甲醇于-20℃固定30分钟；吸去甲醇，加入0.5％的结晶紫(用25％的甲醇溶液配制，盖住培养皿底即可)，室温放置30分钟，回收结晶紫，去离子水小心漂洗，直至颜色不再改变，室温晾干。经过三周的抗生素筛选，对照的空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B转染细胞形成了明显的转化集落，pcDB3.1-DENND2D-v2转染的细胞则无明显集落形成，说明此基因具有抑制转化集落形成的作用。结果如图6所示，NIH3T3-VECTOR表示pcDNA3.1/mycHis(-)B转染细胞，NIH3T3-DENND2D表示pcDB3.1-DENND2D-v2转染细胞。
实施例5、DENND2D-v2基因对肺癌细胞系生长抑制能力体外实验
(1)、采用有限稀释法获得稳定过表达DENND2D-v2的H1299细胞株将细胞按照4×104/孔，传入24孔细胞培养板，共5孔。转染前一个小时更换新鲜培养液，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书分别转入以下质粒空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B，pcDB3.1-DENND2D-v2，剩下一孔为未转染细胞对照。48小时后消化细胞，每组细胞按照梯度2、5、10个细胞/孔传入96孔板中的四列。加Geneticin至筛选浓度800μg/ml；开始时，每天观察细胞死亡情况，每三天更换新鲜培养基，维持筛选压力，约7-10天时可见到筛选克隆长出，将单克隆的孔做上记号，约3-4周时(细胞接近长满孔)，消化传出细胞，维持筛选压力。
(2)、H1299-DENND2D稳定细胞株的鉴定1)RT-PCR提取转pcDNA3.1/mycHis(-)B对照细胞和转pcDB3.1-DENND2D-v2候选克隆细胞的总RNA，根据浓度定量，RT-PCR法检测DENND2D-v2的表达情况，引物序列见实施例2中表1，结果如图7所示，H1299-vector代表空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B转染的阴性对照，DENND2D-1、-2、-3代表选择的三个稳定高表达DENND2D-v2mRNA的单克隆细胞株，DENND2D表示DENND2D-v2。
2)Western Blot提取转pcDNA3.1/mycHis(-)B对照细胞和候选克隆细胞的总蛋白，将以上蛋白定量，按照60μg/样进行Western blot分析，未纯化的DENND2D-v2多克隆兔抗体按照1∶500加入。结果如图8所示，DENND2D表示DENND2D-v2，H1299-vector代表空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B转染的阴性对照，DENND2D-1、2、3、4、5、6、7、8代表八个稳定高表达DENND2D-v2的H1299单克隆细胞株，选择三个进行进一步的实验，命名为H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2和H1299-DENND2D-3。
(3)、MTT细胞增殖实验采用转染pcDNA3.1/mycHis(-)B的H1299细胞(称为H1299-vector细胞)，筛选得到的稳定表达DENND2D-v2的H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3三个单克隆细胞株进行实验。MTT操作方法按照CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assa y kit(Promega，G4000)进行。结果如图9所示，稳定高表达DENND2D-v2的H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3单克隆细胞株生长速度明显比空载体转染细胞慢。图中各点为复孔平均数。
(4)、细胞集落形成实验采用空载体H1299-vector细胞，筛选得到的稳定表达DENND2D的H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3三个单克隆细胞株进行实验。常规培养细胞至对数生长期，消化细胞，按照每孔500个细胞种入60mm细胞培养皿，每组实验重复三皿；每周换液两次，观察集落形成情况。10-14天以后，弃去培养基，用PBS洗两遍，冰冷的甲醇于-20℃固定30分钟；弃去甲醇，加入0.5％结晶紫常温染色30分钟，洗去染液常温晾干。计数标准集落直径大于1mm。结果如图10和表3所示，稳定高表达DENND2D-v2的H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3所形成的集落数目及单个集落大小均明显比空载体转染细胞小。图10为一次代表性实验图片，表3为三组平行实验结果数目比较示意图。
表3.细胞集落形成数目
图10中，Vector表示H1299-vector细胞，DENND2D-1、DENND2D-2、DENND2D-3分别表示H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3。
(5)、软琼脂集落形成实验采用空载体H1299-vector细胞，筛选得到的稳定表达DENND2D-v2的H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3三个单克隆细胞株进行实验。实验用六孔板进行，每孔先加入1.5毫升含10％胎牛血清、0.5％琼脂的DMEM培养基，室温冷却后，将建成的稳定转染细胞系，各5000个细胞加到含10％胎牛血清、0.35％琼脂糖的DMEM培养基中，混合后加到上述底层培养基上，培养2-3周，每皿加入0.5ml0.2％P-iodonitrontetrazilium chiloride染色1小时以上；镜下观察照相，计数大于200微米的克隆。每组重复三个孔。裸眼及光镜下观察代表图如图11a、11b所示，三组平行实验集落形成结果数目比较如表4所示，表明转入DENND2D-v2后的细胞在软琼脂中独立生长的能力明显减弱。图11b中，Vector表示H1299-vector细胞，DENND2D-1、DENND2D-2、DENND2D-3分别表示H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3。
表4.大于200微米的克隆
实施例6、DENND2D-v2抑制H1299细胞致瘤性的体内实验将Parental细胞(未经转染的H1299细胞)及建成的稳定转染细胞系H1299-vector、H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3(代表三个稳定单克隆)分别按照5×105个细胞/只鼠，稀释于200微升1×PBS，注射于四周龄，Balb/c雌性裸鼠背部皮下。Parental组8只，vector组(注射H1299-vector)8只，H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3组各6只。每三天观察一次动物，约三周时开始均有小的肿瘤长出。用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度。21天后引颈法处死动物，小心剥离包膜取出肿瘤，量取肿瘤重量，瘤块用10％福尔马林固定后石蜡包埋，切片，HE染色，进行病理分析为大细胞肺癌。肿瘤体积以公式计算V＝(π/6)×((长度+宽度)/2)3。结果如图12a，图12b所示，DENND2D-v2基因具有抑制H1299细胞在裸鼠皮下形成肿瘤的能力，主要的区别在于肿瘤发生率，空载体细胞组(vector组)的8只裸鼠均在细胞注射处长出了肿瘤，致瘤率达到100％(8/8)，而三个单克隆细胞组只有部分裸鼠有肿瘤长出，其中H1299-DENND2D-1 83.3％(5/6)、H1299-DENND2D-2 0％(0/6)、H1299-DENND2D-3 33.3％(2/6)。此外DENND2D-v2基因还减小了肿瘤的体积，处死裸鼠后剥离肿瘤称重发现，空载体细胞组所形成的肿瘤平均重量为0.49g，而三个单克隆细胞组则分别为0.25g、0g、0.02g。图12b为皮下注射3-6周内各组裸鼠的成瘤情况，每隔3天作为一个观测时间点，每个时间点显示的是每组裸鼠多个肿瘤体积的平均值。
实施例7、DENND2D-v2对肺癌细胞系H1299生长抑制作用的机制研究1、细胞凋亡的观察与检测(1)阳性对照质粒pcDB3.1-BAX质粒的构建pcDB3.1-BAX为凋亡实验的阳性对照，按照下述方法构建以人正常肺组织cDNA文库(ClontechK1420-1)为模板，利用Taq酶进行PCR反应扩增BAX的全长cDNA基因(GenbankNo.NM_138761)。琼脂糖电泳回收PCR产物，连接到pGEM-T-easy载体中进行测序，将测序正确的片段用限制性内切酶EcoRI(Promega)从pGEM-T-Bax载体上切下，同时用EcoRI酶切真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B(Invitrogen，V85520)，将酶切后的Bax的cDNA基因片段与载体在16℃下连接8小时，转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选生长的菌落，提取质粒，用EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有插入片段的阳性克隆，通过测序(使用ABI PRISM 3700 DNA分析仪)，选出正确的正向插入Bax的cDNA基因质粒，命名为pcDB3.1-BAX。pcDB3.1-BAX不带有c-myc和his标签。
(2)瞬时转染H1299细胞将H1299细胞以1×105传入六孔板中，24小时待细胞贴壁生长后，按照Lipofectamine 2000说明书提供的操作方法，将pcDNA3.1/mycHis(-)B，pcDB3.1-DENND2D-v2，pcDB3.1-BAX质粒分别转染入各孔细胞，所用质粒DNA及转染试剂的量为推荐量的1/2以降低细胞毒性。转染后4小时更换培养基，待转染后36小时收取细胞。按照Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit(CALBIOCHEM，PF032)说明进行AnnexinV FITC和PI双染，流式细胞仪检测。结果如图13和表5所示，表明DENND2D-v2基因仅具有轻度的诱导H1299细胞凋亡的能力。
表5.凋亡细胞和正常细胞百分比
2、细胞周期的观察与检测PI流式细胞法进行细胞周期检测将空载体H1299-vector细胞，稳定高表达DENND2D-v2的H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3单克隆细胞以2×105个传入60mm细胞培养皿中，37℃5％CO2培养至融合率达到80％左右。消化收取细胞，80％乙醇(用PBS配制)-20℃固定过夜(大于8小时)。经PI染色后，上机检测。结果如图14和表6所示，DENND2D-v2的外源性高表达能将H1299阻滞在G1/S期。
表6.各期细胞百分比
以上实施例说明，DENND2D-v2基因可轻度诱导凋亡，在细胞周期G1/S期具有明确的细胞周期阻滞能力，这可能是其抑制细胞生长增殖能力的主要原因。
3、RT-PCR及Western Blot检测细胞周期阻滞等重要功能相关基因的表达针对与细胞周期和转移等重要功能相关的基因设计引物或购买抗体，进行了RT-PCR或WesternBlot实验检测其表达情况。提取细胞周期检测同期培养细胞的总RNA及蛋白，分别进行RT-PCR及Western Blot检测。RNA定量，以5μg总RNA为模板进行反转录，然后利用不同引物进行PCR(引物序列见表7)；蛋白定量，按照20μg/样进行Western blot分析，方法如前。p15、CyclinD1鼠单克隆抗体(Santa Cruz)按照1∶200用5％牛奶稀释加入，β-actin(上样量内对照)鼠单克隆抗体(Santa Cruz)按照1∶5000用5％牛奶稀释加入。RT-PCR及Westernblot结果显示INK4家族的p15，p16，CIP/KIP家族的p21，p27在mRNA水平上均有一定程度的表达下调，而p19、p57的表达则无明显变化。此外p15和cyclineD1在蛋白水平则分别表现为表达升高和降低，如图15a、15b所示。图15b中，DENND2D-1、DENND2D-2、DENND2D-3分别表示H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3。
表7
实施例8、DENND2D-v2对肺癌细胞系H1299运动侵袭能力的影响(1)划痕愈合实验将空载体H1299-vector细胞，稳定高表达DENND2D的H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3单克隆细胞以1×106个/皿传入60mm细胞培养皿，培养细胞融合率达到100％；在平皿底部划出均一的划痕，更换新的培养基，继续常规培养；每隔24小时换液并拍照记录。结果如图16所示，表明稳定表达DENND2D-v2基因的H1299细胞的划痕愈合能力减弱，说明此基因影响了H1299细胞的生长和转移潜能。图16中，DENND2D-1、DENND2D-2、DENND2D-3分别表示H1299-DENND2D-1、H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3，vector表示H1299-vector。
(2)Transwell实验A、细胞迁移性实验(Migration Assay)将空载体H1299-vector细胞，随机挑选稳定高表达DENND2D-v2基因的两株单克隆细胞H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3以2×105/孔，按照TranswellPermeable Supports(Corning)说明书传入Transwell小室中。37℃5％CO2孵育培养24小时后将每个小室膜上层细胞用棉签仔细擦净，冰甲醇固定5分钟后，0.5％结晶紫染色5分钟，清水洗净，裸眼和显微镜下观察结果如图17所示，表明DENND2D-v2基因可显著降低穿过含有直径8μm小孔的聚碳酸酯膜的H1299细胞数量，说明此基因可明显抑制肿瘤细胞的迁移运动能力。图17中，DENND2D-2、DENND2D-3分别表示H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3，vector表示H1299-vector。
B、细胞侵袭性实验(Invasion Assay)将Matrigel TM Basement Membrane Matrix(BDBiosciences)，按照说明书平铺入细胞迁移性实验中所采用的TranswellPermeableSupports(Corning)小室中。为了检测DENND2D-v2基因对肺癌细胞系H1299细胞侵袭性的影响，每一小室中按照50μl/cm2加入Matrix Gel使其形成0.5mm厚均匀的一层，37℃孵育30分钟后完全凝固。将空载体H1299-vector细胞，随机挑选稳定高表达DENND2D-v2基因的两株单克隆细胞H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3以4×105个/孔轻柔滴入。37℃5％CO2孵育培养24小时后将小室膜上层的Matrix Gel和细胞用棉签仔细擦净，冰甲醇固定5分钟后，0.5％结晶紫染色5分钟，清水洗净，裸眼和显微镜下观察结果如图18所示，DENND2D-v2基因可显著降低H1299细胞降解Matrix Gel并穿过含有直径8μm小孔的聚碳酸酯膜的能力，说明此基因可明显抑制肿瘤细胞的侵袭能力。图18中，DENND2D-2、DENND2D-3分别表示H1299-DENND2D-2、H1299-DENND2D-3，vector表示H1299-vector。
序列表<160>4<210>1<211>2062<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>1cctgggtccc gtcacatcct tcttgctcaa ccactgggtg cacaggatgg aaacttctat 60tccctctctg gaagacagcg cgtggcttgg cttcacagag ttgtggctgg agaccgaagc120agcccctttc tcaggcttac tgtcaccagt ctgtctgtgt taggggagag gggagtccgc180tctgtcctga aggcccagag atggaaggac aagtggtagg ccgggtgttc aggctcttcc240aacgccgact gcttcaactc cgagcaggac caccccagga caattcaggg gaagctttaa300aggaaccaga aagggcccag gagcactctt tgcccaactt tgctgggggg cagcacttct360ttgaatacct tcttgtggtt tctctcaaaa agaagcgttc agaggatgat tacgagccta420taatcaccta ccaatttccc aagcgggaga acctgcttcg gggtcagcag gaggaggagg480agcggctgct caaagctatc cccttgttct gcttcccaga tgggaatgag tgggcatcac540tcaccgagta tcccagggag accttctcct tcgttctgac caatgtggat gggagcagaa600agattggata ctgcaggcgc ctcttgcctg ccggccctgg ccctcgcctt cccaaagtgt660actgcatcat cagctgcatc ggctgcttcg gcttgttctc caagatcctg gatgaagtgg720agaagagaca tcagatctcc atggctgtca tctacccgtt catgcagggc ctccgagagg780cagccttccc tgctcctggg aagactgtca ctctcaagag cttcatcccc gactcaggca840ctgagttcat ttcactgaca cggcccctgg actcccacct agaacatgtg gattttagtt900ctctattgca ctgtctcagt tttgaacaga tacttcagat ctttgcctct gccgtgctgg960agagaaaaat catcttcctg gcggaaggtc tcagcacctt gtctcagtgc atccatgctg 1020ctgccgcact gctctacccc ttcagctggg cgcacaccta catccctgtt gtccctgaga 1080gccttctggc caccgtctgc tgccccaccc ccttcatggt tggagtacaa atgcgcttcc 1140agcaggaggt catggacagc cctatggaag aggtcctgct ggtcaatctt tgtgaaggaa 1200ccttcttaat gtcggttggt gatgaaaaag acatcctgcc accgaagctt caggatgaca 1260tcttagactc tcttggtcag gggatcaatg agttaaagac tgcagaacaa atcaacgagc 1320atgtttcagg cccctttgtg cagttctttg tcaagattgt gggccattat gcttcctata 1380tcaagcggga ggcaaatggg caaggccact tccaagaaag atccttctgt aaggctctga 1440cctccaagac caaccgccga tttgtgaaga agtttgtgaa gacacagctc ttctcacttt 1500tcatccagga agccgagaag agcaagaatc ctcctgcagg ctatttccaa cagaaaatac 1560ttgaatatga ggaacagaag aaacagaaga aaccaaggga aaaaactgtg aaataagagc 1620tgtggtgaat aagaatgact agagctacac accatttctg gacttcagcc cctgccagtg 1680tggcaggatc agcaaaactg tcagctccca aaatccatat cctcactctg agtcttggta 1740tccaggtatt gcttcaaact ggtgtctgag atttggatcc ctggtattga tttctcagga 1800
ctttggaggg ctctgacacc atgctcacag aactgggctc agagctccat tttttgcaga1860ggtgacacag gtaggaaaca gtagtacatg tgttgtagac acttggttag aagctgctgc1920aactgccctc tcccatcatt ataacatctt caacacagaa cacactttgt ggtcgaaagg1980ctcagcctct ctacatgaag tctgtggaca tgtaaggacg agagtaaaga ggaaaatctt2040ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2062<210>2<211>1905<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>2ataggggggc ggggccagcg cggagctggg agcgggagcc gggcactcca ggggccatgg 60atgggctcgg ccgccgcctt cgagccagcc tgagactgaa gcgcggccat gggggaccac120cccaggacaa ttcaggggaa gctttaaagg aaccagaaag ggcccaggag cactctttgc180ccaactttgc tggggggcag cacttctttg aataccttct tgtggtttct ctcaaaaaga240agcgttcaga ggatgattac gagcctataa tcacctacca atttcccaag cgggagaacc300tgcttcgggg tcagcaggag gaggaggagc ggctgctcaa agctatcccc ttgttctgct360tcccagatgg gaatgagtgg gcatcactca ccgagtatcc cagggagacc ttctccttcg420ttctgaccaa tgtggatggg agcagaaaga ttggatactg caggcgcctc ttgcctgccg480gccctggccc tcgccttccc aaagtgtact gcatcatcag ctgcatcggc tgcttcggct540tgttctccaa gatcctggat gaagtggaga agagacatca gatctccatg gctgtcatcc600acccgttcat gcagggcctc cgagaggcag ccttccctgc tcctgggaag actgtcactc660tcaagagctt catccccgac tcaggcactg agttcatttc actgacacgg cccctggact720cccacctaga acatgtggat tttagttctc tattgcactg tctcagtttt gaacagatac780ttcagatctt tgcctctgcc gtgctggaga gaaaaatcat cttcctggcg gaaggtctca840gcaccttgtc tcagtgcatc catgctgctg ccgcactgct ctaccccttc agctgggcgc900acacctacat ccctgttgtc cctgagagcc ttctggccac cgtctgctgc cccaccccct960tcatggttgg agtacaaatg cgcttccagc aggaggtcat ggacagccct atggaagagg 1020tcctgctggt caatctttgt gaaggaacct tcttaatgtc ggttggtgat gaaaaagaca 1080tcctgccacc gaagcttcag gatgacatct tagactctct tggtcagggg atcaatgagt 1140taaagactgc agaacaaatc aacgagcatg tttcaggccc ctttgtgcag ttctttgtca 1200agattgtggg ccattatgct tcctatatca agcgggaggc aaatgggcaa ggccacttcc 1260aagaaagatc cttctgtaag gctctgacct ccaagaccaa ccgccgattt gtgaagaagt 1320ttgtgaagac acagctcttc tcacttttca tccaggaagc cgagaagagc aagaatcctc 1380ctgcaggcta tttccaacag aaaatacttg aatatgagga acagaagaaa cagaagaaac 1440caagggaaaa aactgtgaaa taagagctgt ggtgaataag aatgactaga gctacacacc 1500atttctggac ttcagcccct gccagtgtgg caggatcagc aaaactgtca gctcccaaaa 1560tccatatcct cactctgagt cttggtatcc aggtattgct tcaaactggt gtctgagatt 1620
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210 215 220Ser His Leu Glu His Val Asp Phe Ser Ser Leu Leu His Cys Leu Ser225 230 235 240Phe Glu Gln Ile Leu Gln Ile Phe Ala Ser Ala Val Leu Glu Arg Lys245 250 255Ile Ile Phe Leu Ala Glu Gly Leu Ser Thr Leu Ser Gln Cys Ile His260 265 270Ala Ala Ala Ala Leu Leu Tyr Pro Phe Ser Trp Ala His Thr Tyr Ile275 280 285Pro Val Val Pro Glu Ser Leu Leu Ala Thr Val Cys Cys Pro Thr Pro290 295 300Phe Met Val Gly Val Gln Met Arg Phe Gln Gln Glu Val Met Asp Ser305 310 315 320Pro Met Glu Glu Val Leu Leu Val Asn Leu Cys Glu Gly Thr Phe Leu325 330 335Met Ser Val Gly Asp Glu Lys Asp Ile Leu Pro Pro Lys Leu Gln Asp340 345 350Asp Ile Leu Asp Ser Leu Gly Gln Gly Ile Asn Glu Leu Lys Thr Ala355 360 365Glu Gln Ile Asn Glu His Val Ser Gly Pro Phe Val Gln Phe Phe Val370 375 380Lys Ile Val Gly His Tyr Ala Ser Tyr Ile Lys Arg Glu Ala Asn Gly385 390 395 400Gln Gly His Phe Gln Glu Arg Ser Phe Cys Lys Ala Leu Thr Ser Lys405 410 415Thr Asn Arg Arg Phe Val Lys Lys Phe Val Lys Thr Gln Leu Phe Ser420 425 430Leu Phe Ile Gln Glu Ala Glu Lys Ser Lys Asn Pro Pro Ala Gly Tyr435 440 445Phe Gln Gln Lys Ile Leu Glu Tyr Glu Glu Gln Lys Lys Gln Lys Lys450 455 460Pro Arg Glu Lys Thr Val Lys465 470<210>4<211>468<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)
<400>4Met Asp Gly Leu Gly Arg Arg Leu Arg Ala Ser Leu Arg Leu Lys Arg1 5 10 15Gly His Gly Gly Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Glu Ala Leu Lys Glu20 25 30Pro Glu Arg Ala Gln Glu His Ser Leu Pro Asn Phe Ala Gly Gly Gln35 40 45His Phe Phe Glu Tyr Leu Leu Val Val Ser Leu Lys Lys Lys Arg Ser50 55 60Glu Asp Asp Tyr Glu Pro Ile Ile Thr Tyr Gln Phe Pro Lys Arg Glu65 70 75 80Asn Leu Leu Arg Gly Gln Gln Glu Glu Glu Glu Arg Leu Leu Lys Ala85 90 95Ile Pro Leu Phe Cys Phe Pro Asp Gly Asn Glu Trp Ala Ser Leu Thr100 105 110Glu Tyr Pro Arg Glu Thr Phe Ser Phe Val Leu Thr Asn Val Asp Gly115 120 125Ser Arg Lys Ile Gly Tyr Cys Arg Arg Leu Leu Pro Ala Gly Pro Gly130 135 140Pro Arg Leu Pro Lys Val Tyr Cys Ile Ile Ser Cys Ile Gly Cys Phe145 150 155 160Gly Leu Phe Ser Lys Ile Leu Asp Glu Val Glu Lys Arg His Gln Ile165 170 175Ser Met Ala Val Ile His Pro Phe Met Gln Gly Leu Arg Glu Ala Ala180 185 190Phe Pro Ala Pro Gly Lys Thr Val Thr Leu Lys Ser Phe Ile Pro Asp195 200 205Ser Gly Thr Glu Phe Ile Ser Leu Thr Arg Pro Leu Asp Ser His Leu210 215 220Glu His Val Asp Phe Ser Ser Leu Leu His Cys Leu Ser Phe Glu Gln225 230 235 240Ile Leu Gln Ile Phe Ala Ser Ala Val Leu Glu Arg Lys Ile Ile Phe245 250 255Leu Ala Glu Gly Leu Ser Thr Leu Ser Gln Cys Ile His Ala Ala Ala260 265 270Ala Leu Leu Tyr Pro Phe Ser Trp Ala His Thr Tyr Ile Pro Val Val275 280 285Pro Glu Ser Leu Leu Ala Thr Val Cys Cys Pro Thr Pro Phe Met Val290 295 300
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1.肿瘤相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的肿瘤相关蛋白，其特征在于所述(b)的蛋白质的氨基酸序列是序列表中的序列3。
3.权利要求1或2所述的肿瘤相关蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述肿瘤相关蛋白的cDNA基因，为如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或序列2；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述肿瘤相关蛋白的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述的肿瘤相关蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因宿主菌。
6.以权利要求1所述的肿瘤相关蛋白为抗原制备的多克隆抗体或单克隆抗体。
7.一种抗肿瘤药物，它的活性成分是含有权利要求3或4所述的肿瘤相关蛋白编码基因的重组哺乳动物基因表达载体。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于所述肿瘤为肺癌，食管癌或喉癌。
9.权利要求1所述的肿瘤相关蛋白及其编码基因在制备预防和/或治疗肿瘤及与肿瘤转移性相关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述肿瘤为肺癌，食管癌或喉癌。
全文摘要
本发明公开了一种肿瘤相关蛋白及其编码基因。该肿瘤相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤相关的由(a)衍生的蛋白质。含有上述肿瘤相关蛋白编码基因的重组哺乳动物基因表达载体可作为抗肿瘤药物，用于预防和/或治疗肺癌，食管癌或喉癌。
文档编号C12N15/63GK101054413SQ20071006418
公开日2007年10月17日 申请日期2007年3月5日 优先权日2007年3月5日
发明者郑宏伟, 马大龙, 程书钧, 高燕宁, 袁劲松, 付国斌, 石太平 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所, 北京大学