专利名称：温郁金脱毒及快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种温郁金脱毒及快速繁殖方法。
技术背景植物是药物的天然宝库，人类利用药用植物来防病治病已有几千年历史。全世界约有75%的人口以植物作为治疗疾病的药物来源(刑建民，2001)。当今 的处方药有25%左右来自于药用植物(邱德有，2000)。随着经济和医疗保健事 业的飞速发展，中药资源的需求出现了空前的增长，从中药中提取有效成分应 用于化妆品、食品及工业原料的研究也越来越深入，这些原因在不同程度上加 大了中药资源的压力。加之长期以来，对开发利用中药资源的认识不足， 一些 地区不同程度上对中药资源进行了掠夺式的过度采收，致使很多中药资源蕴含 量下降，甚至枯竭， 一些种类濒临灭绝(黄璐琦,2001)。生物技术的蓬勃发展 为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法。植物组织和细胞培养 技术则是其中一个重要的手段。近年来，国内外在这方面已做了大量工作，己 成功离体培养获得试管植株的药用植物有200多种。温有B金(Cwcwm" we"yw力V7 Y.H.Chen et C丄ing)是姜禾斗Zingiberaceae姜黄属 Q#rMma多年生草本。温郁金入药早在7世纪的唐代编著的药典《新修本草》 中就有记载。浙江瑞安是该药材的道地产区，分布在瑞安飞云江畔的仙降、马 屿、陶山及永嘉一带，也是全国温郁金的唯一产区，被列为"浙八味"之一 (郑 坚，2004)。温郁金是全国郁金三个品种(广郁金、川郁金、温郁金)之一，温郁金同 株作物三种药材——郁金、莪术、姜黄(浙江植物志，1993)。郁金(块根)具 有行气祛淤，清心解郁，利胆退黄之功(李敏，2004);莪术(主根茎)有破淤、 行气、消积和止痛的功能(国家药典委员会，2005);姜黄(侧根茎)具有抗 炎、抗菌、抗肿瘤、降血脂、抗癌、抗早孕、抗凝血、降压、保肝、护肝等多 种功能(王琰，2001)。温郁金根茎和块根的主要活性物质为挥发油和姜黄素类成分。挥发油主要 成分为倍半萜类，已分离并鉴定出了20余个成分，其中莪术醇、莪术二酮、莪 术酮和榄香烯等为挥发油主要的抗癌和抗生育活性成分。姜黄素类主要包括姜 黄素(Curcumin)、去甲氧基姜黄素(Demethoxycurcumin)和双去甲氧基姜黄素 (Bidemethoxycurcumin)(黄可新，2000;李艳萍，2000;张炜，2006)。此外温
郁金中还有生物碱、树脂类、糖类、甾醇类、脂肪酸、多肽类等成分。近年来从温郁金的莪术油中分离出一种新型抗癌活性物质榄香烯，研制成 疗效好、副作用小的新型抗肿瘤药物，使得温郁金的发展有了新的契机(郑坚，2004)。由于温莪术挥发油含量较其他莪术高(林观样，2006)，因此，温莪术 成了各药厂的选购目标。随着莪术油制剂市场持续扩大,温郁金的种植和生产规 模也随之扩大，2006年温郁金种植面积达4000多亩。由于温郁金开花少，种子多不充实，所以生产上采用根茎繁殖，即用"种姜"。 这样造成耗种量大。加之长期进行营养繁殖，造成温郁金品种单一，病毒化严 重,品质下降，产量降低(李国栋，2002;李敏,2006)。因此培育出有效成分含 量高、高产、适应性强、抗病虫害、抗逆性强的优良品种势在必行。病毒病害是农业生产中愈来愈突出的问题。由于病毒对寄主植物细胞的绝 对寄生性和植物没有动物那样的免疫代谢系统，使得植物一旦被病毒侵染就终 生处于被病毒危害的状态。这使得植物病毒病的防治较其它植物病害的防治更 为困难，常给农业生产带来灾难性的损失。迄今，尚缺乏特异性较强的只对病毒而不对植株产生药害的药剂。自上个世纪50年代发现通过植物组织培养可以 去除病毒以来，在生产上已被广泛应用，并将其纳人常规良种无性繁殖的一个重要程序。植物组织培养是目前最有效的去除病毒的方法，几乎对所有病毒有效(还可 去除其他病原体，如细菌、真菌、类菌质体等)，周期短，效率高，与快速繁殖 相结合。此外由于不使用化学药剂，可以减少污染、防止公害，因而具有良好 的经济效益和社会效益。目前已在生产中得到大面积推广应用的如脱毒马铃薯、 甘薯、草莓、葡萄、甘蔗、菠萝、香蕉、生姜、大蒜以及林木、花卉、珍贵中 药材(贝母、番红花、半夏等)等，均取得了巨大的经济效益和社会效益。因 此将植物脱毒复壮技术用于药用植物的良种选育，不仅为其产业化发展及进一 步的开发利用奠定基础，而且对传统中药的现代化开发利用也是有益的启发和 探索。迄今为止，在国内外尚未见关于温郁金脱毒及快速繁殖的报道。我们通过 大量实验，终于摸索出一套成熟的方法，成功实现了温郁金的脱除病毒及离体 快繁，可以快速培育出大量种苗，为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。参考文献l.国家药典委员会.中华人民共和国药典2005版. 一部，2005:942. 黄可新,陶正明，张安将等.温莪术化学成分的研究.中国中药杂志,2000,25(3):163-1643. 黄璐琦,李慧，陈京荔.珍稀濒危中药资源保护的相关问题探讨.世界科学技术 ——中药现代化,2001,3(6):46-494. 李国栋,许付,沈爱军.莪术油的研究进展.中国药学杂志,2002，37(11):806-8095. 李敏,王琦,付福友.不同品种郁金的SRAP研究.中草药,2006，37(8):1255-12586. 李敏，唐远，付福友等.郁金的研究进展.世界科学技术一中医药现代化，综述， 2004，6(2):35陽397. 李艳萍.中药郁金的化学成分研究.西北大学学报(自然科学 版)，2000,30(5):411-4148. 林观样,蔡进章，潘晓军等.温莪术传统生产技术调查.中药 材,2006,29(9):887-8889. 邱德有.试论药用植物有效成分基因调控的研究进展.世界科学技术——中药 现代化，2OOO,2(3):30-3410. 王琰,王慕邹.姜黄属常用中药的研究进展.中国药学杂志,2001，36(2):80-8411. 邢建民，赵德修,叶和春等.水母雪莲细胞生物反应器悬浮培养.植物学 报,2000,42(1):98-10112. 张炜,刘雯,覃洁萍.中药莪术的研究概况.广西科学院学 报，2006，22(S):481-48613. 郑坚,陈秋夏,张旭乐等.温州山区主要中药材(植物药)生产现状与发展对策. 浙江林业科技,2004,24(3):63-6714. 浙江植物志编写组.浙江植物志(第七巻).杭州，浙江科学技术出版 社,1993,477-478文中所提及的縮写字母的以及见如下缩略词表MS Murashige and Skoog medium MS培养基BA 6- benzyladenine 6-节基腺嘌呤KT kinetin 激动素NAA a-naphthaleneacetic acid ot-柰乙酸AdS adenine sulphate 硫酸腺嘌呤
发明内容
本发明的H的是提供一种温郁金的组培快速繁殖方法。 温郁金的脱毒及快速繁殖方法包括如下步骤1) 将温郁金根状茎放在温度36 38 'C下4 5周，取出根状茎，用400 500倍百菌清浸泡30 40分钟后，置于底部打若干小洞的塑料周转箱中，以细 沙铺底和覆盖，浇透水，将周转箱置于23 27t:温室下催芽培养20 25天，定 期喷水，待培育的芽长至1 2公分时，选用顶芽及腋芽流水冲洗30 40分钟 后，置于75%酒精中处理20 30秒，然后用0.1XHgCl2灭菌处理6 10分钟后 用无菌水冲洗3 5次后用于茎尖的剥离与接种；2) 将灭菌后1 2公分顶芽或腋芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点， 带一个叶原基，切为0.1 0.2毫米见方的小块，接种于诱导培养基中进行诱导 培养，诱导培养基为MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/1、MS+BA2.0mg/l+NAA1.0mg/1、 MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/L+AdS30mg/1或 MS+KT2mg/l+NAA 1.0mg/1;3) 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒，反 应结果用连续波长生物测读仪于405 nm处读取OD值，烟草花叶病毒的阳性对照 采用确定含烟草花叶病毒的烟草新鲜叶，阴性对照采用健康烟草；黄瓜花叶病 毒的阳性对照采用确定含黄瓜花叶病毒的黄瓜新鲜叶组织，阴性对照采用健康 黄瓜叶片；样品OD4M值/阴性对照OD4Q5值明显2 2，判为阳性；样品OD4Q5值/ 阴性对照004()5值明显<2，判为阴性，样品的OD^值用SPSS数据处理系统进行 分析；4) 将生长于诱导培养基上经过病毒检测确定为无病毒的植株转接于增殖培 养基上，增殖培养基为MS+BAlmg/1、 MS+BA2mg/1、MS+BA1 mg/l+NAA0.2mg/1 。5) 在增殖培养基上植株一步成苗，移栽到珍珠岩灭菌菜园土草炭土为l: 1 2: 0.5 l的混合基质上。所述的诱导培养基中的pH值为5.8 6.0，培养温度25 27 °C，每天光照 时间为16h，光照强度为35 40^imol.m'2.s.1。所述的将鉴定为无病毒的生长在诱导培养基上的植株转接于增殖培养基上 进行增殖培养培养15 20天，可见植株基部出现4 10个新芽，将长的新芽 在无菌条件下取出，直接放在增殖培养基上或将芽纵切为4份，每一份接种在 增殖培养基上，在15 20天内，各培养容器内的芽可再生出4 10个芽。所述的在增殖培养基上植株一步成苗，移栽到珍珠岩灭菌菜园土草炭
土为h 1 2: 0.5 l的混合基质上将生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置5 7天，然后打开瓶盖，放置1 2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩灭菌菜园土草炭土为l: 2: 1的混合基质培养20 35天，开始10 14天，保持温度为23 25 。C，相对湿度为70 80%。本发明的优点(1)温郁金的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵染和农药残留的影响，严格控制温郁金药材的质量。(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积 少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。(3)先对材料进行脱毒处理，经 双抗体夹心酶联(DAS-ELISA)反应鉴定植株的脱毒效果。应用脱毒苗进行快 速繁殖，提高温郁金的品质，有效解决温郁金品质不稳定，外观和有效成分不 匀的问题，为生产道地药材和产后加工销售提供保障条件。(4)该技术方法解 决了温郁金快速繁殖和稳定生根的重要技术环节，达到技术稳定，繁殖系数高 的要求，可应用于工业化生产的目的。(5)使用本发明提供的脱毒快繁技术得 到的温郁金幼苗进行人工栽培，可以得到个体差异小，品质均一的温郁金成品(郁金、莪术、姜黄)，可以为生产莪术油等提供品质稳定的原材料。
具体实施方式
温郁金的脱毒快繁技术，包括外植体的选取与处理，诱导培养，再生植株 叶片的病毒检测，增殖与生根培养，移栽等步骤。具体地操作中，可优选温郁 金的顶芽、腋芽为培养材料。将温郁金根状茎放在温度36 38'C下4 5周，取 出根状茎，用400 500倍百菌清浸泡30 40分钟后，置于大的塑料周转箱中(底 部打若干小洞)，以细沙铺底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(23 27 °C )下催芽培养20 25天(定期喷水)。待培育的芽长至1 2公分时，直接 选用顶芽和腋芽进行表面灭菌处理或将带有萌发芽的根状茎置于35 37X:的光 照培养箱中放置20 24h后再进行表面灭菌处理流水冲洗30 40分钟，75%酒 精处理20 30秒，0.1%HgCl2 (内力卩2 3滴吐温T-20)灭菌处理6 10分钟， 无菌水冲洗3 5次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后1 2公分顶芽或腋芽， 在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)切为0.1 0,2毫米见方的 小块，接种于MS+BA2.0mg/1+NAA0.5 1.0mg/1 、MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/L+AdS30mg/l或MS+KT2.0mg/l+NAA1.0mg/L的诱导 培养基中进行诱导培养。在温度为25 27'C，每天光照16h，光强35 40 limol.m—ls"的温室中培养15 20天。然后将每瓶中的有芽抽出，有叶形成的植 株分株培养并编号，以便于进行病毒的检测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附 (DAS-ELISA)法进行检测。将检测的无毒苗的芽切开，置于MS+BAl 2mg/L或 BAlmg/l+NAA0.2mg/L培养基中进行增殖培养。培养条件同上述诱导培养基。 30 40天后，每个培养瓶中可以得到4 10株绿色健壮、生根很好的植株。将装 有生根植株的培养容器取出，于自然环境下放置5 7天后打开瓶盖，在培养基 表面浇少量水，再放置1 2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩灭菌菜园土草炭土 (h 1 2: 0.5 1)的混合基质上。开始10天保持环境温度23 25"C，相对湿度在70% 80%，随后即可逐渐过渡到自然 的环境条件。炼苗一个月后移栽到大田，可达到90%的存活率。上述技术中诱导及增殖步骤的pH值均为5.8，培养温度25 27"C，每天光照 16小时，光照强度35 40iiimol.m-2.s"。使用本发明将温郁金的芽接种后，30 40天可诱导形成丛生芽，诱导率达 到100%，并且根系生长健壮。在此基础上进行继代培养，丛生芽大量繁殖，大 约20 30天继代一次，平均增殖倍数为8.1倍。采用上述措施的本发明，掌握了温郁金脱毒快繁过程中无毒苗的诱导及病毒检 测、丛生芽的诱导、增殖和生根同步进行等关键技术问题，使温郁金这一经济 植物在传统的栽种模式中由于病毒病导致的品质衰退和产量下降等问题得到了有效的解决。本发明的优点体现在提供的温郁金脱毒和快速繁殖技术， 一个外植体一 年就可繁殖出数万株无毒苗，为该药用植物的商品化生产提供了 一套切实可行 的生产技术路线，可以应用于温郁金的大规模工业化生产。本发明采用下述非限定性实施例作进一步的说明。 实施例l取采自温州瑞安的温郁金根状茎放在36"C温度下5周，取出根状茎，用400 倍百菌清浸泡30分钟后，置于大的塑料周转箱中(底部打若干小洞)，以细沙铺 底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(27°C )下催芽培养20天(定期 喷水)。待培育的芽长至1 2公分时，选用顶芽及腋芽进行表面灭菌处理流水 冲洗40分钟后，置于75%酒精中处理20秒，然后用0.1^HgCb (内加2滴吐温 T-20)灭菌处理6分钟后用无菌水冲洗3次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后 1 2公分芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)，切为0.1 0.2毫米见方的小块，接种于MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/L培养基上，培养室的温 度为25"C，培养20天，可见每个外植体上有2-3个新芽出现，将长出芽的外植体 在无菌条件下取出，分单株培养并编号，进行病毒的检测。结果黄瓜花叶病毒
的脱毒率达到70%;烟草花叶病毒的脱毒率达到80%。将未检测到病毒的植株上 部的叶子切除，保留基部0.5公分茎段(含腋芽)，将此茎段放置于MS+BAlmg/1 上培养基上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，扩繁系数达到4。培养20天 后，又可以重复上述操作。如果要移栽炼苗，则需在增殖培养基上再生长10 20天。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置5天后打开瓶盖，在培养 基表面浇少量水，再放置1天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩灭菌菜园土草炭土 (h 2: 0.5)混合基质上。保持环境湿度在70%。 一个月后移栽到大田中，可达到90%的存活率。实施例2取采自温州瑞安的温郁金根状茎放在38t:温度下4周，取出根状茎，用500 倍百菌清浸泡40分钟后，置于大的塑料周转箱中(底部打若干小洞)，以细沙铺 底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(23 °C )下催芽培养27天(定期 喷水)。待培育的芽长至1 2公分时，将根状茎及其萌动的芽转入37t:的光照培 养箱中培养24小时，使病毒弱化，然后选用顶芽及腋芽进行表面灭菌处理流 水冲洗30分钟后，置于75%酒精中处理30秒，然后用0.1^HgCl2 (内力口3滴吐温 T-20)灭菌处理10分钟后用无菌水冲洗5次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后 1 2公分芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)切为0.1 0.2毫米见方的小块，接种于MS+BA2.0mg/l+NAA1.0mg/L培养基上，培养室的温 度为27'C，培养15天，可见每个外植体上有2 3个新芽出现，将长出芽的外植 体在无菌条件下取出，分单株培养并编号，进行病毒的检测。结果黄瓜花叶病 毒的脱毒率达到82%;烟草花叶病毒的脱毒率达到88%。将未检测到病毒的植株 上部的叶子切除，保留基部0.5 1公分茎段(含顶芽)，将此茎段纵切为4，每一部 分接入增殖培养基MS+BA2mg/l上进行连续培养，以达到快速增殖的目的。此种 方法增殖系数达到9.3。培养20天后，又可以重复上述操作。如果要移栽炼苗， 则需在增殖培养基上再生长10 20天。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环 境下放置7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出， 将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩灭菌菜园土草炭土 (1: 2: 1) 混合基质上。保持环境湿度在80%。 一个月后移栽到大田中，可达到90%的存活率。实施例3取采自温州瑞安的温郁金根状茎放在温度37"C下4周，取出根状茎，用400 倍百菌清浸泡30分钟后，置于大的塑料周转箱中(底部打若干小洞)，以细沙铺
底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(25 °C )下催芽培养25天(定期 喷水)。待培育的芽长至1 2公分时，将根状茎及其萌动的芽转入37'C的光照培 养箱中培养24小时，使病毒弱化，然后选用顶芽及腋芽进行表面灭菌处理流 水冲洗30分钟后，置于75%酒精中处理30秒，然后用0.1WHgCl2 (内加2滴吐、温 T-20)灭菌处理8分钟后用无菌水冲洗4次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后l 2公分芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)切为0.1 0.2 毫米见方的小块，接种于MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/L+AdS30mg/l培养基上，培 养室的温度为25。C，培养20天，可见每个外植体上有4 6个新芽出现，将长出 芽的外植体在无菌条件下取出，分单株培养并编号，进行病毒的检测。将未检 测到病毒的植株上部的叶子切除，保留基部0.5 1公分茎段(含顶芽)，将此茎段 纵切为4，每一部分接入增殖培养基MS+BAlmg/l+NAA0.2mg/l上进行连续培养， 以达到快速增殖的目的。此方法繁殖系数能达到10.7。培养20天后，又可以重复 上述操作。如果要移栽炼苗，则需在增殖培养基上再生长10 20天。将已生根 植株的培养瓶取出，于自然环境下放置7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水， 再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩灭菌菜园土草炭土 (1: 1: 1)混合基质上。保持环境湿度在70%。 一个月后移栽到大田中，可达到90%的存活率。 实施例4取采自温州瑞安的温郁金根状茎放在36"C温度下5周，取出根状茎，用500 倍百菌清浸泡40分钟后，置于大的塑料周转箱中(底部打若干小洞)，以细沙铺 底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(25 °C )下催芽培养25天(定期 喷水)。待培育的芽长至1 2公分时，将根状茎及其萌动的芽转入37'C的光照培 养箱中培养24小时，使病毒弱化，然后选用顶芽及腋芽进行表面灭菌处理流 水冲洗30分钟后，置于75%酒精中处理30秒，然后用0.1XHgCl2 (内加2滴吐温 T-20)灭菌处理10分钟后用无菌水冲洗4次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后 1 2公分芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)切为0.1 0.2毫米见方的小块，接种于MS+KT2.0mg/l+NAA1.0mg/L培养基上，培养室的温 度为26。C，培养20天，可见外植体上先出现根的分化，每个外植体上出现4 6 条根，继续生长14 20天，才出现芽的分化。将长出芽的外植体在无菌条件下 取出，分单株培养并编号，进行病毒的检测。将未检测到病毒的植株上部的叶 子切除，保留基部0.5 1公分茎段，将此茎段纵切为4，每一部分接入增殖培养 基MS+BAlmg/l+NAA0.2mg/l上进行连续培养，以达到快速增殖的目的。此种方 法增殖系数达到8.3。培养20天后，又可以重复上述操作。如果要移栽炼苗，则 需在增殖培养基上再生长10 20天。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境 下放置7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出， 将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩灭菌菜园土..草炭土 (1: 2: 1) 混合基质上。保持环境湿度在80%。 一个月后移栽到大田中，可达到90%的存活率。
权利要求
1.一种温郁金的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于包括如下步骤1)将温郁金根状茎放在温度36～38℃下4～5周，取出根状茎，用400～500倍百菌清浸泡30～40分钟后，置于底部打若干小洞的塑料周转箱中，以细沙铺底和覆盖，浇透水，将周转箱置于23～27℃温室下催芽培养20～25天，定期喷水，待培育的芽长至1～2公分时，选用顶芽及腋芽流水冲洗30～40分钟后，置于75％酒精中处理20～30秒，然后用0.1％HgCl2灭菌处理6～10分钟后用无菌水冲洗3～5次后用于茎尖的剥离与接种；2)将灭菌后1～2公分顶芽或腋芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点，带一个叶原基，切为0.1～0.2毫米见方的小块，接种于诱导培养基中进行诱导培养，诱导培养基为MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/l、MS+BA2.0mg/l+NAA1.0mg/l、MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/L+AdS30mg/l或MS+KT2.0mg/l+NAA 1.0mg/L；3)采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒，反应结果用连续波长生物测读仪于405nm处读取OD值，烟草花叶病毒的阳性对照采用确定含烟草花叶病毒的烟草新鲜叶，阴性对照采用健康烟草；黄瓜花叶病毒的阳性对照采用确定含黄瓜花叶病毒的黄瓜新鲜叶组织，阴性对照采用健康黄瓜叶片；样品OD405值/阴性对照OD405值明显≥2，判为阳性；样品OD405值/阴性对照OD405值明显＜2，判为阴性，样品的OD405值用SPSS数据处理系统进行分析；4)将生长于诱导培养基上经过病毒检测确定为无病毒的植株转接于增殖培养基上，增殖培养基为MS+BA1mg/l、MS+BA2mg/l、MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l。5)在增殖培养基上植株一步成苗，移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土为1∶1～2∶0.5～1的混合基质上。
2. 根据权利要求1所述的一种温郁金的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于 所述的诱导培养基中的pH值为5.8 6.0,培养温度25 27 °C，每天光照时间 为16h，光照强度为35 40^imol.mf2.s"。
3. 根据权利要求1所述的一种温郁金的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于 将鉴定为无病毒的生长在诱导培养基上的植株转接于增殖培养基上进行增殖培 养培养15 20天，可见植株基部出现4 10个新芽，将长的新芽在无菌条件 下取出，直接放在增殖培养基上或将芽纵切为4份，每一份接种在增殖培养基 上，在15 20天内，各培养容器内的芽可再生出4 10个芽。
4.根据权利要求1所述的一种温郁金的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于 所述的在增殖培养基上植株一步成苗，移栽到珍珠岩灭菌菜园土草炭土为1: 1 2: 0.5 l的混合基质上将生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置5 7天，然后打开瓶盖，放置1 2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩灭菌菜园土草炭土为h 2: 1的混合基质培养20 35天，开始10 14天，保持温度为23 25。C，相对湿度为70 80%。
全文摘要
本发明公开了一种温郁金的脱毒及组培快速繁殖方法。包括外植体的选取与处理，诱导培养、再生植株的病毒鉴定、增殖培养、移栽等步骤。本发明以MS培养基为基础，加入植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤、激动素、α-柰乙酸、硫酸腺嘌呤等用于温郁金顶端分生组织的诱导培养及丛生芽的增殖和生根两个关键阶段。采用本发明所提供的成套技术方法对温郁金进行组织培养和快繁，解决了温郁金因营养繁殖所造成的病毒积累，品质下降，产量降低的难题，达到了繁殖系数高，技术稳定的要求。可以为温郁金的工厂化生产提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的育苗方法。
文档编号C12N5/04GK101103701SQ20071007070
公开日2008年1月16日 申请日期2007年8月6日 优先权日2007年8月6日
发明者傅承新, 姜维梅, 沈瑛瑛 申请人:浙江大学