专利名称：血清替代剂及无血清虹鳟胚胎细胞系培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种血清替代剂及无血清胚胎细胞系培养基。
技术背景体外培养细胞所使用的合成培养基需要添加一些天然成分，其中主要添加 的天然成分是血清，尤其是牛血清。但在培养基中使用血清存在以下缺陷1.血清成本高500mL牛血清价格为3000 4000元；2.活体采集不人道；3.血 清质量不稳定，各批次间存在差异，影响实验数据的稳定性；4.血清所含成 分复杂，其中某些物质对某些细胞的生长有抑制作用，影响细胞生长和细胞某 些功能的表达，对某些细胞的体外培养有去分化作用；5.血清中大量、复杂 的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难； 6.后期各种细胞产物提纯和鉴定过程复杂；7.可能引起异种血清的过敏反应。而且目前没有适合于虹鳟的无血清胚胎细胞系培养基。发明内容本发明的目的是为了解决培养基中使用血清成本高，不人道，质量不稳定， 某些物质影响细胞生长和细胞某些功能的表达，细胞产品分离纯化难度大，后 期各种细胞产物提纯和鉴定过程复杂，可能引起异种血清的过敏反应及目前没 有适合虹鳟的无血清胚胎细胞系培养基的问题，而提供的一种血清替代剂及无 血清虹鳟胚胎细胞系培养基。血清替代剂由0.3g重组人胰岛素样生长因子-1、 0.5g重组人碱性成纤维细 胞生长因子、0.65g血小板源性生长因子B、 1.5g牛血清白蛋白、5g牛转铁蛋 白、34gJ3-巯基乙醇、0.294g谷氨酸、0.110g丙酮酸钠和2 3g非必需氨基酸组 成。用上述血清替代剂配制的无血清虹鳟胚胎细胞系培养基由RPMI-1640培 养基和上述血清替代剂组成；每lOOOmL无血清虹鳟胚胎细胞系培养基中含有 上述血清替代剂44.354~45.354g，余量为RPMI-1640培养基。本发明血清替代剂的价格低廉，仅为牛血清的60%。本发明血清替代剂成
分少而确定，使用安全性高，质量稳定、产品个批次间无差异，不影响试验数 据的准确性。本发明血清替代剂对细胞的生长无毒、无抑制作用，不影响细胞 的生长和功能的表达。因为本发明血清替代剂成分确定，便于后期各种细胞产 物提纯和鉴定。本发明血清替代剂无动物源性，可避免细胞过敏反应。本发明无血清虹鳟胚胎细胞系培养基培养虹鳟胚胎细胞系具有增殖速度 快，凋亡率低，安全稳定，传代时间长的优点。
图i是具体实施方式
三中第29代虹鳟胚胎细胞在400x相差显微镜下的观 察图，图2是具体实施方式
三中第6代虹鳟胚胎细胞染色体中期分裂相观察图， 图3是具体实施方式
三中第6代虹鳟胚胎细胞染色体组型图，图4是具体实施 方式三中第29代虹鳟胚胎细胞染色体中期分裂相观察图，图5是具体实施方 式三中第29代虹鳟胚胎细胞中期染色体组型图。
具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式血清替代剂由0.3g重组人胰岛素样生长因 子-1 (rhIGF-l)、 0.5g重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)、 0.65g血小 板源性生长因子B(PDGF-B) 、 1.5g牛血清白蛋白(BSA)、 5g牛转铁蛋白、34g卩-巯基乙醇、0.294g谷氨酸、0.110g丙酮酸钠和2 3g非必需氨基酸组成。本实施方式血清替代剂适用范围广，可用于鱼类动物细胞无血清培养。本 实施方式中的非必需氨基酸购自于上海微科生化试剂有限公司，其中不含有谷 氨酸。本实施方式血清替代剂中不含有胆固醇。
具体实施方式
二本实施方式无血清虹鳟胚胎细胞系培养基由RPMI-1640 培养基和具体实施方式
一所述血清替代剂组成；每lOOOmL无血清虹鳟胚胎细胞系培养基中含有具体实施方式
所述血清替代剂44.354~45.354g，余量为 RPMI-1640培养基。
具体实施方式
三本实施方式虹鳟胚胎细胞系培养方法一、 虹鳟胚胎的收集本实施方式虹鳟鱼胚胎取自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海 冷水性鱼实验站的优质虹鳟受精卵。二、 胚胎(囊胚-原肠后期)细胞分离
收集到的虹鳟胚胎镜检合格后在18'C条件下培养至囊胚后期或原肠后期， 然后将虹鳟胚胎放在1 XPBS溶液中反复浸洗3~4次，再用浓度为70%酒精浸 泡消毒灭菌，之后用pH值为7.4的1 XPBS溶液清洗三次，再放到RPMI-1640 完全培养基中用尖头镊子剥除卵膜分离出细胞团，并用RPMI-1640完全培养 基重悬分离出的胚胎细胞。本实施方式RPMI-1640完全培养基购自于美国Gibco公司。三、 虹鳟胚胎细胞的原代和传代培养将胚胎细胞接种到24孔组织培养板中培养，每孔加入RPMI-1640完全培 养基1.0mL，置于18"C培养箱中培养2 3天，然后更换培养基待细胞长满培 养孔按1 : 2的比例进行传代，每2 3天更换一次培养基。四、 虹鳟胚胎细胞系培养形成稳定的胚胎细胞系后用具体实施方式
二的无血清虹鳟胚胎细胞系培 养基在18"C条件下继续传代培养。五、 鉴定(1) 形态学鉴定在400x的相差显微镜下观察第29代虹鳟胚胎细胞的外形和细胞大小(如 图1所示)。胚胎细胞多为梭形、长条形、多角形、多边形或不规则形，胞质 近中央处有椭圆形细胞核，细胞之间排列疏松，细胞的直径约为26~42pm，呈 典型成纤维细胞样，未见异常。(2) 生长和增殖特性鉴定虹鳟胚胎细胞经29次无血清培养，仍保持快速的生长和增殖特性，2 3 天传代一次，细胞倍增时间为24 30小时。(3) 倍性检测虹鳟胚胎细胞生长至对数期加入秋水仙素，使秋水仙素终浓度为 0.5^ig/mL， 4小时后收集细胞，并用浓度为75mmol/L的KC1溶液低渗处理25 分钟，再用体积比为3 : 1的甲醇、冰醋酸混合液固定细胞3次，每次15分钟， 冷滴片，空气干燥，再用5^的Giemsa染色M分钟，在显微镜下观察染色体 形态，统计二倍体细胞的比率。生长对数期的虹鳟胚胎细胞正常二倍体细胞所 占比例高于67%。(4)染色体组型分析依据中华人民共和国国家标准GB/T 18654.12-2002 (养殖鱼类种质检验第 12部分染色体组型分析)进行检测。无血清虹鳟胚胎细胞系培养基培养的第6 代虹鳟胚胎细胞染色体中期分裂相观察图如图2所示，染色体组型图如图3 所示；无血清虹鳟胚胎细胞系培养基培养的第29代虹鳟胚胎细胞染色体中期 分裂相观察图如图4所示，染色体组型图如图5所示。细胞染色体数211=60， 中部着丝粒染色体和亚中部着丝粒染色体(m组和sm组)22对，亚端部和端 部着丝粒染色体(st组和t组)8对，染色体臂比(NF) 104。依据中华人民共 和国水产行业标准SC 1036-2000 (虹鳟Rainbow trout)， 6代细胞和29代细胞 染色体形态正常。以上实验结果表明无血清虹鳟胚胎细胞系培养基培养虹鳟胚胎细胞系具 有增殖速度快，凋亡率低，遗传稳定，安全性高，传代时间长的优点。从而证 明具体实施方式
一血清替代剂对细胞的生长无毒、无抑制作用，不影响细胞的 生长和功能的表达，具有安全稳定的优点。
权利要求
1、血清替代剂，其特征在于血清替代剂由0.3g重组人胰岛素样生长因子-1、0.5g重组人碱性成纤维细胞生长因子、0.65g血小板源性生长因子B、1.5g牛血清白蛋白、5g牛转铁蛋白、34gβ-巯基乙醇、0.294g谷氨酸、0.110g丙酮酸钠和2～3g非必需氨基酸组成。
2、 用权利要求1血清替代剂配制的无血清虹鳟胚胎细胞系培养基，其特 征在于无血清虹鳟胚胎细胞系培养基由RPMI-1640培养基和权利要求1所述 血清替代剂组成；每lOOOmL无血清虹鳟胚胎细胞系培养基中含有权利要求1 所述血清替代剂44.354~45.354g，余量为RPMI-1'640培养基。
全文摘要
血清替代剂及无血清虹鳟胚胎细胞系培养基，它涉及一种血清替代剂及无血清胚胎细胞系培养基。它解决了培养基中使用血清成本高，质量不稳定及目前没有适合虹鳟的无血清胚胎细胞系培养基的问题。血清替代剂由0.3grhIGF-1、0.5grh-bFGF、0.65g PDGF-B、1.5g牛血清白蛋白、5g牛转铁蛋白、34gβ-巯基乙醇、0.294g谷氨酸、0.110g丙酮酸钠和2～3g非必需氨基酸组成。培养基由RPMI-1640培养基和上述血清替代剂组成。本发明血清替代剂的价格低廉，仅为牛血清的60％，质量稳定。本发明无血清虹鳟胚胎细胞系培养基培养虹鳟胚胎细胞系具有增殖速度快，传代时间长的优点。
文档编号C12N5/073GK101126077SQ20071007272
公开日2008年2月20日 申请日期2007年8月31日 优先权日2007年8月31日
发明者尹洪滨, 薛淑群 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所