专利名称：一种基因芯片及其在检测基因分型和突变中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因芯片，以及使用这种芯片检测基因分型和突变的应用。
背景技术：
自1973年首次报道强直性脊柱炎(AS)以来，人类对其认识和研究越来越多，据流行病学资料显示，AS在我国的患病率为0.3％，估计患病人数在400万左右，且有逐年上升的趋势。
目前临床上因缺乏对AS高危人群的早期筛查，导致发病率不断上升。联合分析AS的易感基因，可以筛选AS的高危人群，以及早预防并为流行病防控部门提供参考。综上所述，对与AS相关的HLA-B27、IL-1RN、TNF-α等易感基因进行联合检测是非常必要的。
发明内容
为了解决AS高危人群的筛查问题，本发明提供一种基因芯片，以及使用这种芯片的基因分型和突变的检测方法。
本发明的技术方案如下本发明提供一种基因芯片，其检测位点包含如下核酸序列的探针SEQ ID No.1所示核酸序列，SEQ ID No.2所示核酸序列，SEQ ID No.3所示核酸序列，SEQ ID No.4所示核酸序列，SEQ ID No.5所示核酸序列，SEQ ID No.6所示核酸序列，
SEQ ID No.7所示核酸序列，SEQ ID No.8所示核酸序列，SEQ ID No.9所示核酸序列，SEQ ID No.10所示核酸序列，SEQ ID No.11所示核酸序列，SEQ ID No.12所示核酸序列。
作为优化，本发明所提供的基因芯片，各探针的检测位点排列如下
标志(信号)列是由点在芯片上的标志探针与预先加在杂交缓冲液中的标志物(Biotin标记的寡核苷酸)杂交显色产生的信号。该质控点是为了说明芯片点样的质量；杂交、显色试剂的有效性；杂交显色操作的正确性。
阳性对照(行)是由点在芯片上的阳性探针与阳性扩增产物(带Biotin标记)杂交产生的信号。该质控点是为了说明样品抽提与扩增操作的正确性和试剂的有效性。
阴性对照(行)是由点在芯片上的阴性探针与阴性扩增产物(带Biotin标记)杂交产生的信号。该质控点是为了说明样品抽提与扩增操作是否被污染以及扩增试剂的特异性。
标志探针、阳性探针、阴性探针、阳性扩增产物、阴性扩增产物均为试剂盒专配(上海百傲公司批号A11706)本发明提供的上述基因芯片由上海百傲公司制备。
本发明还提供使用上述基因芯片的基因分型和突变的检测方法，步骤如下(1)提取待检样品DNA；
(2)分别以SEQ ID No.13/SEQ ID No.14、SEQ ID No.15/SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17/SEQ ID No.18、SEQ ID No.19/SEQ ID No.20、SEQ IDNo.21/SEQ ID No.22所示序列为引物，步骤(1)所提取待检样品DNA为模板，进行PCR，得到PCR产物；(3)取步骤(2)制备的PCR产物混合，与本发明提供的的基因芯片进行杂交显色反应，对显色结果进行检测。
具体的讲，PCR的步骤如下扩增体系
扩增步骤95℃，4min；然后按94℃ 25sec，56℃ 25sec，72℃ 25sec做40个循环，最后72℃ 5min。
本发明所提供基因芯片和检测突变的方法效果如下本发明所提供基因芯片和基因分型和基因突变检测方法，具有测试稳定、简便、快捷和经济等特点，且对实验室要求不高，能够达到对AS疾病作出早期诊断和疗效评估。
具体实施例方式
以下实施例仅在于对本发明的优选实现方式进行说明，不用于对本发明的限定。
本发明检测产品是在基因芯片技术的基础之上，主要对HLA-B27两个亚型(HLA-B2704、HLA-B2705)的分型和检测分析IL-1RN-30735、IL-1RN-31017、TNF-α-857、TNF-α-308位点多态性。该产品技术的合成主要涉及三种基因和位点的选择与设计、探针的设计、点样模式的设计及检测方案的优化。
表1.三种基因和位点选择设计表
表2.探针设计表
表3.引物设计表
表4.点样模式及点样排列设计表
本发明的基因芯片的制备和使用方法，包括如下步骤1.基因芯片的合成设计SEQ ID No.1-12所述探针，常规方法制备基因芯片。
2.基因芯片的检测按照上海百傲科技有限公司生产的基因型检测芯片试剂盒(批号A11706)说明书进行操作。
3.结果将显色载玻片面朝下，扣在BaiO_BE-2.0生物芯片识读仪(Cat# BSE 01011)的片槽上检测，具体操作见仪器使用说明。检测图像经Array Doctor 2.0软件(由上海百傲科技有限公司提供)分析可自动输出检测结果。
芯片检测结果分析根据基因芯片的设计方案，该芯片杂交结果的判读依据如下B27的四条探针CL_4-AG，PAN2B27，CL-4/5-C，CL_5-GA中，CL_4-AG，PAN2B27，CL-4/5-C同时出信号表示B2704检测阳性；CL_5-GA，PAN2B27，CL-4/5-C同时出信号表示B2705检测阳性；其余情况则判为非B2704，非B2705型(阴性)。其余位点根据信号判断其基因型。
本发明的理论依据在于结合强直性脊柱炎的遗传和免疫学的生物特性，对其与疾病主要相关的基因位点进行分析，在上述三个主要的基因位点中HLA-B27强直性脊柱炎是一种高度遗传性疾病，且与HLA-B27密切相关，有研究表明HLA-R27是直接参与了AS的发病，其中HLA-R2704和HLA-B2705两种亚型在中国等亚州人群中比较常见。本发明就针对HLA-B27的两种经典亚型，设计探针与引物，从而进一步分析HLA-B27的分型情况.
IL-1RN(interleukin-1 receptor antagonist)gene白介素1受体拮抗基因，通过对白介素1家族基因定位的鉴定，其中IL-1RN基因的多态性位点-30735和-31017的改变与AS的发病密切相关，同时IL-1RN位点多态性的变化对个体药物治疗效果的差异性具有重要的价值。
TNF-α(tumor necrosis factor-α)gene肿瘤坏死因子-α基因与HLA-B基因在染色体上的距离相对比较近，与HLA紧密连锁。TNF-α是一种前炎性细胞因子，具有介导炎症破坏等重要作用。研究发现，对AS患者的骶髂关节组织活检，发现有大量的TNF-α的表达.更重要的是，30年来人类对AS的认识的飞跃，正是从TNF-α的研究开始的，并且其启动子-308和-857位点的多态性与AS密切相关。
临床检测与应用1.观察时间在本发明技术方案未曾披露的情况下，选择了2004年12月到2006年12月的2年的时间内进行观察。
2.观察对象选择了100例AS病例男85例，女15例；平均中位年龄为31.2岁，同时也选择了100例健康对照男80例，女20例；平均中位年龄为30.4岁.
3.使用方法抽取观察对象的静脉血0.5ml，EDTA抗凝，提取DNA，PCR扩增后的产物用于进行杂交显色.通过软件分析结果。
4.检测结果
注计算公式检出率＝基因被检出例数/被检测的总例数结合以上的临床检测的数据及未阐明的理论依据，可见其有显著的检测效果，提示本发明制成的检测产品，可以发现中国和亚州人群中的HLA-B27的表达，同时也能进行亚型分型，更重要的是本发明产品也能对易感基因IL-1RN和TNF-α多态性进行分析，为早期治疗患者提供一个可靠的观察指标。该产品具有测试稳定、简便、快捷和经济等特点，且对实验室要求不高(设备简单)，能够达到对AS疾病作出早期诊断和疗效评估，本发明成本低廉，值得推广使用。
序列表<110>苏，卓娃<120>一种基因芯片及其在检测基因分型和突变中的应用<130>07001<160>22<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>32<212>DNA<213>Unknown<220>
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<223>primer<400>22aaaaaagcgg gcgcaaaagc ccaaaagaaa tggaggcaat a 4权利要求
1.一种基因芯片，其检测位点包含如下核酸序列的探针SEQ ID No.1所示核酸序列，SEQ ID No.2所示核酸序列，SEQ ID No.3所示核酸序列，SEQ ID No.4所示核酸序列，SEQ ID No.5所示核酸序列，SEQ ID No.6所示核酸序列，SEQ ID No.7所示核酸序列，SEQ ID No.8所示核酸序列，SEQ ID No.9所示核酸序列，SEQ ID No.10所示核酸序列，SEQ ID No.11所示核酸序列，SEQ ID No.12所示核酸序列。
2.权利要求1所述基因芯片，其特征在于，各探针的检测位点排列如下表所示
3.一种基因分型和突变检测方法，步骤如下(1)提取待检样品DNA；(2)分别以SEQ ID No.13/SEQ ID No.14、SEQ ID No.15/SEQID No.16、SEQ ID No.17/SEQ ID No.18、SEQ ID No.19/SEQ ID No.20、SEQ ID No.21/SEQ ID No.22所示序列为引物，步骤(1)所提取待检样品DNA为模板，进行PCR，得到PCR产物；(3)取步骤(2)制备的PCR产物混合，与权利要求1或2所述的基因芯片进行杂交显色反应，对显色结果进行检测。
4.根据权利要求3所述基因分型和突变检测的方法，其特征在于，所述PCR的步骤如下95℃，4min；然后按94℃25sec，56℃25sec，72℃25sec做40个循环，最后72℃5min。
全文摘要
本发明涉及一种基因芯片，以及使用这种芯片检测基因分型和突变的应用。本发明提供一种基因芯片，其检测位点包含SEQ ID No.1－12所示核酸序列的探针本发明还提供利用上述基因芯片进行基因分型和突变检测的方法。利用本发明提供的基因芯片和检测方法，可以解决AS高危人群的筛查问题。
文档编号C12Q1/68GK101016569SQ200710073069
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月1日 优先权日2007年2月1日
发明者苏卓娃 申请人:苏卓娃