专利名称：：MiRNA芯片、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因芯片，尤其涉及一种miRNA芯片、其制备方法及应用。
背景技术：
：随着人类基因组草图与模式生物基因组序列的获得，人们已进入后基因组时代，如何识别出基因组(特别是人类基因组)中的各种基因并采用基因芯片等高通量生物技术来研究这些基因的功能己成为目前的研究热点。然而，在基因识别中，不仅包含编码蛋白质的基因识别，也包含非编码RNA基因(non-codingRNA，ncRNA)的识别。ncRNA包含小核仁脂A(sno認A)、小核RNA(snRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(miRNA)等不编码蛋白的RNA。由于ncRNA基因在基因剪接、RNA核苷酸修饰、蛋白质合成、蛋白质转运和基因表达调控等方面起着重要的作用，所以对ncRNA基因的研究具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是近几年在真核生物中发现的一类长度2125个核苷酸的内源性、非编码蛋白的单链小分子RNA家族，它主要参与基因转录后水平的调控，目前研究人员推测miRNA调节着人类30%-50%的基因(Conservedseedpairing,oftenflankedbyadenosines,indicatesthatthousandsofhumangenesaremicroRNAtargets.Lewis,B.P.，Burge，C.B.andBartel,D.P.Cell2005，120，15-20)，miRNA参与了包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生等一系列重要的生命进程(MicroRNAsinGeneRegulation:WhentheSmallestGovernsItAll.0uelletDL，PerronMP,GobeilLA，PlanteP，ProvostP.JBiomedBiotechnol.2006;2006:69616)。基因芯片(microarray)的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)—致，即样品与一组已知序列的核酸探针杂交，通过检测到的每个探针的杂交信号强度，获取样品的数量和序列信息。该方法能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。包括玻璃片点样或者原位合成形式的Microarray芯片，也包括了样品点在膜上的Macroarray，前者面积小密度高信息量大，需要特殊的芯片扫描仪。后者面积大、密度低、价格便宜，不需要芯片扫描仪用。在miRNA基因芯片的应用中，miRNA标记有直接标记和间接标记两种方法。直接标记主要采用化学反应或酶促方法用生物素或发光集团直接标记miRNA样品。商业化的试剂盒多采用此办法，如Ambion公司mirVana标记试剂盒，首先分离包含miRNA的小分子RNA，然后采用多聚腺苷酸聚合酶(PAP酶)催化miRNA的3，末端与氨基修饰的核苷酸连接，纯化去除多余的氨基修饰的核苷酸后，再将此氨基修饰的miRNA与NHS-Cy3/Cy5等发光基团耦合。挪威Kreatech公司miRacULS标记试剂盒，使用PE公司的CY3/5-ULS(universallinkagesystem)钼金复合物直接标记分离的miRNA。该复合物能够与N7的鸟苷特异结合，人类中miRNA有1-10个鸟苷，因此不同的miRNA标记效率不同，此标记反应无需酶的参与。RAKE(RNA-primerd,array-based，Klenowenzymeassay),它是先将待领[lmi腿与5，端固定于玻片上的寡核苷酸探针杂交，这些探针由5'spacer/oligo-dT/对应的反义miRNA3'组成。杂交后，在exonucleaseI作用下降解未杂交的单链DNA探针，洗涤后的片基在Klenow酶的催化下以玻片上的寡核苷酸探针为模板,杂交上的miRNA为引物，生物素标记的dATP为底物进行聚合反应，杂交产物通过荧光标记的链亲和素识别。这样,只有杂交上的小RNA才能被特异性标记,没有样品中其它RNA的干扰，大大提高了杂交特异性(Microarray-based，highthroughputgeneexpressionprofilingofmicroRNAs.Nelson,P.T.，Baldwin,D.A.，etal.Nat.Meth.2004，1:155—161)。miRNA间接标记主要有两种方式cDNA合成过程中间接标记和cDNA的PCR扩增间接标记。cDNA合成过程中间接标记即cDNA合成阶段中使用生物素标记的随机八聚体实现miRNA标记(Anoligonucleotidemicrochipforgenome-widemicroRNAprofilinginhumanandmousetissure.Liu，C.G.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004，101，9740-9744),也可在随机引物反转录合成cDNA后碱性水解模板RNA，单链cDNA3'末端标记(Developmentofamicro-arraytodetecthumanandmousemicroRNAsandcharacterizationofexpressioninhumanorgans.Sun，Y.，Koo,S.etalNucleicAcidsRes2004，32，e188)。另一种是在cDNA的PCR扩增阶段引入标记物，miRNA的5，和3'加接头引物，PCR扩增cDNA，直接使用标记的接头引物或使用标记的聚合反应底物即可实现间接标记，PCR产物变性后可直接用于杂交(MicroarrayanalysisofmicroRNAexpressioninthedevelopingmammalianbrain.MiskaEA，Alvarez-SaavedraE，TownsendM，YoshiiA，SestanN，RakicP，Constantine—PatonM,HorvitzHR.GenomeBiol.2004,5(9):R68)。还有一禾中是PCR3'接头引物中引入T7RNA聚合酶启动子，在T7RNA聚合酶作用下使用标记的核糖核酸，生成cRNA用于杂交(MicroRNAexpressiondetectedbyoligonucleotidemicroarrays:systemestablishmentandexpressionprofilinginhumantissue.Barad，0.etal.GenomeRes.2004,14,2486-2494)。由于miRNA只有约22nt小分子RNA，不同的miRNA,长度、GC含量、以及结构不同，Tm值大致在45-74之间，而且很多miRNA只有一至几个碱基的差异，所以miRNA探针设计十分重要。目前miRNA芯片探针设计主要有四种一、把所有的miRNA成熟序列都设计在探针中，考虑到探针在芯片表面的空间伸展，在探针上加上一段无关序列使探针长度扩展到40nt(—种检测microRNA表达的微阵列芯片的研制及应用。杨阳，朱疆，肖明，董中华，邓橙，黄国亮，程京。生物化学与生物物理进展2007.34(1)31-41);二、在寡核苷酸探针中引入LNA分子,可以确保杂交条件的一致性，从而提高检测miRNA表达的精石角性(AsensitivearrayformicroRNAexpressionprofiling(miChip)basedonLockedNucleicAcids(LNA).M.Castoldi，S.Schmidt,V.Benes，M.Noerholm，A.E.Kulozik，M.W.Hentze，andM.U.Muckenthaler.RNA2006,12:1-8);三、agilent公司发明的一种探针设计方法，调整成熟MicroRNA的长度，使其Tm值大致相同，然后在5'端引入一个G与c-cy3标记的样品互补增强特异性。(DirectandsensitivemiRNAprofilingfromlow-inputtotalRNAHuiWang,RobertA.AchandBoCurry,RNA(2007)，13:151-159);四、调整成熟MicroRNA的长度，使其Tm值大致相同，然后将同一调整的序列两个串联来增强信号与特异性。(RationalProbeOptimizationandEnhancedDetectionStrategyforMicroRNAsUsingMicroarrays.LoyalA.GoffMaochengYangJessicaBowersRobertC.GettsRichardW.PadgettRonaldP.Hart,RNABiology2:3,93-100，2005)。然而，上述四种方法设计的miRNA探针在特异性和灵敏性方面仍存有不足。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种miRNA芯片，具有更高的特异性和灵敏性且能用于检测经RAKE标记法标记的miRNA样品。本发明要解决的技术问题之二是提供一种上述miRNA芯片的制备方法。本发明要解决的技术问题之三是提供一种应用上述miRNA芯片进行检测的方法。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种miRNA芯片，包括固相载体和miRNA探针，该miRNA探针主要由两条相同的核苷酸序列经串联组成，其每条核苷酸序列与待测miRNA的核苷酸序列和/或其互补序列杂交，所述两条相同的核苷酸序列通过n个聚合的T组成串联，且该n》1。本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。优选的，本发明所述固相载体包括玻璃片、醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、钢片、陶瓷片、塑料片中的一种或它们的任意组合。本发明miRNA芯片还包括至少一种对照探针,所述对照探针选自阴性对照探针、内源阳性对照探针、错配探针、互补探针、外源标记及杂交对照探针。所述探针序列可包含110个错配碱基，较佳地，可包含15个错配碱基，更佳地，可包含12个错配碱基。所述探针可用多种方法固定于载体上，如点样法(USAPatentNo.5288514，USAPatentNo.5556752)、光介导法(USAPatentNo.5143854，5384261和5561071)、磁珠法(USAPatentNo.5541061)等。所述探针可以通过化学或物理的方法，固定于载体上，如通过离子键、共价化合或其它已知的力吸附在载体上，如可用紫外交联仪将所述探针固定于载体上。所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5'-朋2修饰、5'-SH修饰、5，-(A、C或G)修饰、5，-生物素修饰、3，-NH2修饰、3，-SH修饰、3，-(A、C或G)修饰和3'-生物素修饰等。所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记选自荧光素标记、酶标记、放射性元素标记、发光标记、化学标记和荧光共振能量转移标记。在本发明的另一方面，提供了一种上述miRNA芯片的制备方法，包括如下步骤(1)合成本发明的miRNA探针；(2)将步骤(1)合成的miRNA探针配成溶液；(3)把niiRNA探针溶液点在固相载体上；(4)将miRNA探针固定于固相载体上。在该制备方法的步骤(4)后，还包括用封闭液对miRNA芯片进行封闭的步骤，完成封闭的miRNA芯片用于杂交。在本发明的另一方面，提供了一种应用上述miRNA芯片进行检测的方法，包括如下步骤(1)选取本发明的mi脂A芯片；(2)标记待测miRNA或总RNA样品；(3)在适于与所选miRNA芯片进行杂交的条件下，加入经标记的待测miRNA或总RNA样品，并使其反应足够时间；(4)清洗后检测杂交反应的结果。在所述步骤(2)中，待测miRNA或总RNA样品先由多聚腺苷酸聚合酶(PAP酶)催化在其3'末端加氨修饰的polyA尾，再将该加尾的待测miRNA或总RNA样品与发光基团耦合以完成标记。所述发光基团包括NHS-Cy3/Cy5。在本发明的另一方面，还提供了一种应用上述miRNA芯片进行检测的方法，包括如下步骤(1)选取本发明的miRNA芯片；(2)在适于与所选miRNA芯片进行杂交的条件下，加入待测miRNA或总RNA样品，并使其反应足够时间；(3)用核酸外切酶I降解未杂交的单链miRNA探针；(4)洗涤后加入DNA聚合酶和标记的dATP，该DNA聚合酶催化以所述芯片上的n个聚合的T为模板，以杂交上的待测miRNA或总RNA为引物，以标记的dATP为底物进行聚合反应；(5)加入能与步骤(4)中dATP的标记物进行亲和反应的底物；(6)清洗后检测杂交反应的结果。所述步骤(4)中的DNA聚合酶优选包含Klenow酶。本发明检测方法的杂交可以在任何杂交液中进行，如含有SSPE和表面活性剂的杂交液。杂交液可以含有任何浓度的SSPE，例如110XSSPE。也可以使用任何适当的表面活性剂，如Triton-lOO，SDS，SLS(十二垸基肌氨酸钠)，CTAB(六烷基三甲基溴化铵)等。杂交液中也可有任何浓度的表面活性剂，如0.011%(w/w)。所述的杂交可在任何适当的温度下进行，如25'C65'C，所述杂交时间为5分钟18小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。所述杂交结果在检测前的洗涤可使用任何适当的洗涤液，该洗涤液可含有03%(w/w)的表面活性剂，洗涤可持续适当的时间，如130分钟。可以用室温的洗涤液进行洗涤，或预热后洗涤，如42t。可用不同的洗涤液先后进行洗涤。所述探针和待测miRNA或总RNA样品之间的杂交可以采用任何己知的方法进行检测。根据标记的不同，可以选用合适的检测方法，例如荧光标记的探针或待测miRNA或总RNA样品可以用激光扫描仪或荧光仪检测，放射性元素标记的探针或待测miRNA或总RNA样品可以用放射自显影检测。本发明的miRNA芯片，不仅适用于直接标记和间接标记的样品检测，而且适用于RAKE检测方法。应用本发明的miRNA芯片检测经RAKE标记法或PAP酶与NHS-Cy3/Cy5后标记法标记的miRNA样品，具有更高的灵敏性和特异性。图1是本发明miRNA芯片的探针示意图2是应用本发明的miRNA芯片检测经PAP酶和NHS-Cy3/Cy5标记的miRNA样品的示意图3是应用本发明的miRNA芯片检测经RAKE标记法标记的miRNA样品的示意图；图4是本发明实施例2的芯片杂交结果图；图5是本发明实施例3的芯片杂交结果图。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例lMiRNA芯片的制备1.miRNA探针的设计与合成1)miRNA探针设计的预实验体外合成hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7f四条RNA序列，该四条序列之间只相差一个碱基，同时，针对该四条序列设计六种miRNA探针，该六种miRNA探针的设计方案分别如下S:(sequence)cl5;TS:t5(sequence)cl5;TDS:t5(sequence)(sequence);seq:(sequence)(sequence);seq-t5:(sequence)t5(sequence);seq-dt5:t5(sequence)t5(sequence)。其中，S代表(sequence)c15，即该探针由待测miRNA互补核苷酸序列加上15个C(胞嘧啶)组成；TS代表t5(sequence)c15，即该探针是由待测miRNA互补核苷酸序列在一端加上5个T(胸腺嘧啶)及另一端加上15个C(胞嘧啶)组成；TDS代表t5(sequence)(sequence),即该探针是由两段待测miRNA互补核苷酸序列串联以后在一端添加5个T组成；seq代表(sequence)(sequence)，即该探针是由两段待测miRNA互补核苷酸序列组成；seq-t5代表(sequence)t5(sequence),即该探针是由两段待测miRNA互补核苷酸序列之间通过5个聚合的T串联组成；seq-dt5代表t5(sequence)t5(sequence),即该探针是由seq-t5的一端添加5个T组成。为了验证这六种miRNA探针的特异性，标记合成的hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7f四条RNA序列，分别与miRNA芯片进行杂交，杂交后荧光信号统计结果如表1所示。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从表l可以看出，miRNA探针seq-t5-hsa-let-7a(SEQIDN0:1)与hsa-let-7a的RNA序列的杂交信号为100%，而与hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7f的杂交数分别为41%、25%、19%，因此seq-t5-hsa-let-7a的miRNA探针具有较好的灵敏性和特异性。同理，miRNA探针seq-15-hsa-let-7b(SEQIDN0:2)、seq-t5-hsa-let-7c(SEQIDN0:3)、seq-t5-hsa-let-7f(SEQIDN0:4)也具有良好的特异性。虽然seq-dt5的miRNA探针比seq-t5探针更加特异，但是3eq-dt5探针的信号强度不高，因此，兼顾特异性和信号强度，选择seq-t5的探针设计原则。2)miRNA探针设计方法及合成本发明的miRNA芯片采用独特的芯片探针设计方法，即根据Tm值、1722bp对调整成熟MicroRNA的长度，调整后的序列通过blast比较确保探针的特异性。调整后的同一序列两个用T5串联起来，探针长度在3944bp(见图1)。该探针设计方法同样适用于小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、小干扰RNA(siRNA)等不编码蛋白的RNA。探针采用PAGE纯化，保证片断大小和芯片低背景。2.miRNA芯片的制备1)将第一步合成的niiRNA探针(oligoDNA)溶解于一定的缓冲液体系中，优选含1.5%。SDS的磷酸盐缓冲液，oligoDNA浓度约为2.5微克/微升；2)将溶解的oligoDNA溶液转入96孔板或384孔板中，每孔大约10微升，轻轻振荡，使溶液覆盖96孔板或384孔板的底部；3)使用点样器进行点样，固相载体可以是表面带有活化基团的玻璃片、醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、钢片、陶瓷片、塑料片中的一种或一种以上的结合物，点样阵列可以根据需要，在每张片子上点多个重复区域，每个区域对应筛选过程中的一组miRNA探针，一次可制备多张miRNA芯片；4)点样完成的miRNA芯片水化过夜，紫外交联；5)使用封闭液对miRNA芯片进行封闭，封闭液为含1XBSA的磷酸盐缓冲液，封闭完成的miRNA芯片用于杂交。实施例2应用本发明的miRNA芯片检测经PAP酶和NHS-Cy3/Cy5标记的miRNA样品(见图2)(1)取0.55PgmiRNA或520PgtotalRNA在PAP酶作用下3，末端加氨修饰的polyA尾，反应体系如下3PimiRNA1W无核酸酶水10W2XPoly(A)聚合酶反应缓冲液(PolymeraseReactionBuffer)2W25mMMnC122W10XAmine-NTPMix2WPoly(A)聚合酶37°C温浴2小时。(2)过纯化柱除游离的核苷酸，抽干样品。(3)荧光后标记已加尾的miRNA，加入9W耦合缓冲液(CouplingBuffer)7)4胺修饰的miRNA(amine-modifiedmiRNA)4W预先制备的含Cy3或Cy5的DMSO溶液避光，室温放置l小时后，加4.5144M羟胺(Hydroxylamine)避光，室温放置15分钟。(4)过纯化柱除游离的荧光，定量。(5)miRNA芯片杂交a)2X杂交buffer和标记的miRNA等比混合，共50ul，将杂交液滴加在芯片的一端，将盖玻片一端与杂交液接触，另一端用镊子夹住，缓慢盖上盖玻片，要保证盖玻片完全覆盖住芯片的有效点样区域，避免产生气泡。b)将上述杂交芯片水平放入加有PBS的杂交盒或者湿盒，置42。C杂交箱中避光杂交1618小时。(6)miRNA芯片清洗a)杂交结束后，用镊子取出片子，浸入洗液I((6xSSPE，0.005%N-Lauroylsarcosine)中，室温下洗涤lmin。b)从洗液I中取出片子浸入洗液II(O.6xSSPE,0.005%N-Lauroylsarcosine)中，室温下洗涤lmin。c)镊子小心将片子取出，迅速转入干净的50ml空离心管中，芯片离心机lmin或2000rpm离心2min，快速干片，防止形成水渍而增加背景值。d)最后将芯片取出放入芯片盒，避光保存于干燥器中，待扫描分析。e)扫描杂交后的芯片，得到的杂交结果如图4所示。实施例3应用本发明的miRNA芯片检测经RAKE标记法标记的miRNA样品(见图3)(1)miRNA芯片清洗a)把miRNA芯片浸入洗液I(2XSSC/O.2%SDS)中，洗涤lmin。b)从洗液I中取出片子浸入25。C洗液II(5XSSC/10%formamide)中，室温下洗涤5min。c)从洗液II中取出片子浸入25。C洗液III(2XSSC)中，于室温下洗涤30s，3次。(2)取0.55PgmiRNA或520PgtotalRNA与芯片25。C杂交箱中杂交16-18小时。(3)2XSSC37。C洗涤lmin，3次。(4)核酸外切酶I(ExonucleaseI)(NEB;freshbufferatpH7.5;4U/u1)27。C温育3hr。(5)2XSSC27。C洗涤lmin，3次，2XSSC/0.05%SDS27。C洗涤10min，2XSSC37°C洗涤lmin，3次。(6)Exo-Klenow酶(Promega;0.15U/Vl)，生物素-7-dATP(Invitrogen;4uM)27。C温育lhr。(7)2XSSC25。C洗涤lmin，2次。(8)链霉菌抗生物素蛋白连接的Alexa-fluor-547(streptavidin-conjugatedAlexa-fluor-547，Molecularprobes;15ng/ul)25。C温育30min。(9)2XSSC25。C洗涤lmin，3次。(10)镊子小心将片子取出，浸入装有ddH20的50ml离心管中，洗漆l2min，迅速转入干净的50ml空离心管中，2000rpm离心2min，以保证快速干片，去除残留的水滴，防止形成水渍而增加背景值。(11)最后将芯片取出放入芯片盒，避光保存于干燥器中，待扫描分析。(12)扫描杂交后的芯片，得到的杂交结果如图5所示。序歹ll表<110>上海生物芯片有限公司〈120〉MiRNA芯片、其制备方法及应用〈130〉NP-07-11486<160>4〈170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉45〈212〉薩〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature<222〉(1)..(45)<400>1aactatacaacctactaccttttttaactatacaacctactacct45<210>2〈211〉41〈212>薩〈213>人工序列<220>〈221〉misc一feature〈222〉(1)..(41)〈400〉2aaccacacaacctactactttttaaccacacaacctactac41〈210〉3〈211〉43<212>腿<213>人工序列〈220〉〈221〉misc—feature<222〉(1)..(43)〈400>3aaccatacaacctactacctttttaaccatacaacctactacc43<210>4〈211〉47<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc—feature〈222〉(1)..(47)<400>4aactatacaatctactacctctttttaactatacaatctactacctc4权利要求1.一种miRNA芯片，包括固相载体和miRNA探针，该miRNA探针主要由两条相同的核苷酸序列经串联组成，其每条核苷酸序列与待测miRNA的核苷酸序列和/或其互补序列杂交，其特征在于，所述两条相同的核苷酸序列通过n个聚合的T组成串联，且该n≥1。2.如权利要求1所述的raiRNA芯片，其特征在于，所述固相载体包括玻璃片、醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、钢片、陶瓷片、塑料片中的一种或它们的任意组合。3.—种权利要求l所述miRNA芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)合成权利要求1所述的miRNA探针；(2)将步骤(1)合成的miRNA探针配成溶液；(3)把miRNA探针溶液点在固相载体上；(4)将miRNA探针固定于固相载体上。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)后，还包括用封闭液对miRNA芯片进行封闭的步骤。5.—种应用权利要求1所述niiRNA芯片进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)选取权利要求l所述的miRNA芯片；(2)标记待测miRNA或总RNA样品；(3)在适于与所选miRNA芯片进行杂交的条件下，加入经标记的待测miRNA或总RNA样品，并使其反应足够时间；(4)清洗后检测杂交反应的结果。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，待测miRNA或总RNA样品先由多聚腺苷酸聚合酶催化在其3'末端加氨修饰的polyA尾，再将该加尾的待测miRNA或总RNA样品与发光基团耦合以完成标记。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发光基团包括NHS-Cy3/Cy5。8.—种应用权利要求l所述miRNA芯片进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤(l)选取权利要求1所述的miRNA芯片；(2)在适于与所选miRNA芯片进行杂交的条件下，加入待测miRNA或总RNA样品，并使其反应足够时间；(3)用核酸外切酶I降解未杂交的单链miRNA探针；(4)洗涤后加入DNA聚合酶和标记的dATP，该DNA聚合酶催化以所述芯片上的n个聚合的T为模板，以杂交上的待测miRNA或总RNA为引物，以标记的dATP为底物进行聚合反应；(5)加入能与步骤(4)中dATP的标记物进行亲和反应的底物；(6)清洗后检测杂交反应的结果。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的DNA聚合酶包含Klenow酶。全文摘要本发明公开了一种miRNA芯片，包括固相载体和miRNA探针，该miRNA探针主要由两条相同的核苷酸序列经串联组成，其每条核苷酸序列与待测miRNA的核苷酸序列和/或其互补序列杂交，所述两条相同的核苷酸序列通过n个聚合的T组成串联，且该n≥1。本发明还公开了所述miRNA芯片的制备方法及其检测方法。应用本发明的miRNA芯片进行检测，具有更高的特异性和灵敏性，且该芯片能用于检测经RAKE标记法标记的miRNA样品。文档编号C12Q1/68GK101348828SQ20071009395公开日2009年1月21日申请日期2007年7月17日优先权日2007年7月17日发明者孟宪欣,朱智东,肖华胜申请人:上海生物芯片有限公司