专利名称：一种生产生物酶制剂和酵母饲料蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及一种生产生物酶制剂和酵母 饲料蛋白的方法。
背景技术：
随着经济的飞速发展和技术的不断进步，自20世纪60年代以来，味精生产 量逐年上升,目前我国已经成为味精的生产和消费大国。味精产量的不断提高，味 精工业废水对环境造成的污染问题日趋突出。而这些废水的主要来源是在味精提 取过程中产生的离子交换尾液(简称离交尾液)。味精废水的离交尾液中COD (化 学需氧量)、硫酸根和氨氮的含量非常高。因此味精废水的处理成为制约味精生 产企业发展的重大难题。
近年来，国内外众多专家对味精废水的治理进行了大量研究，主要方法包括 物化处理、厌氧生物处理和好氧生物处理法。物化处理法COD去除率仅达30 40 %。厌氧生物处理虽然运行费用较低，但在厌氧环境下，高浓度氨氮和硫酸根对 甲烷菌具有较强的毒害和抑制作用，因此一般要采用预先脱硫脱铵、稀释进水等
措施，从而增加处理成本。好氧生物处理在处理高浓度有机废水时易产生污泥膨 胀，因此也必须将废水大量稀释。目前一些味精厂利用离交尾液生产词料酵母(通 常是热带假丝酵母和产朊假丝酵母)，这种方法能够去除40% 60n/。的COD，而 且产生的菌体能够作为饲料蛋白得到利用。但饲料酵母法要求经常性地进行菌种 培养和比较严格的无菌条件，同时利用该法生产的细胞培养液中细胞干物质较低， 约20 30g/L，这样在后提取过程中需要消耗大量的热能和电能，使得生产成本居高不下，而且由于上述酵母不能够利用铵基氮因而生产的酵母蛋白产品仍含有较 高的铵基氮，对产品的质量影响较大。因此寻求一种较理想的解决方案是摆在科 研人员面前的一项重大课题。
磷是动物生长、繁殖、骨骼矿化及代谢所必需的矿物元素之一。作为动物饲 料主要成分的植物性饲料中虽含有相当数量的总磷，但其中50% 70%是以植酸 磷(六磷酸肌醇)的形式存在，单胃动物缺乏分解植酸磷所必需的酶，故磷的利用 率仅有0 % 40 %，从而造成磷源浪费、饲料成本增加和动物生产性能的降低。同 时，植酸磷不能被动物有效利用，而直接排出体外还会造成严重的土壤和水源的 磷污染。另外，植酸磷在动物胃肠道的消化吸收过程中，还会与多种金属离子和 蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，影响这些营养元素的有效利用。
植酸酶可使植酸磷降解成肌醇和磷酸，其对单胃动物的饲喂效果己得到了广 泛的确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40 %，从而减少饲料中无机磷的添加量，它还可降低植酸盐的抗营养作用，因此对提 高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。植酸酶广泛存在于微生物、 麦芽、种子等中，但含量低，难以获得大量产品，价格昂贵，从而一直限制着植 酸酶的推广利用。通过基因工程的手段，已经实现了在生物反应器中高效表达植 酸酶基因，从而大幅度降低了植酸酶生产的成本。
毕赤酵母本身具有很好的安全性，自20世纪70年代起建立的以巴斯德毕赤 酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法己经成熟，干细胞产量可高达100g/ L。同时，利用基因工程构建的重组酵母中也不带任何抗药性标记，所以重组酵母 本身作为饲料蛋白是安全的
发明内容
为了解决氨基酸生产过程中离交尾液的污染和再利用问题，本发明的发 明人提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种生产生物酶制剂和酵母饲料蛋白的方法。
根据本发明的方法以表达所述生物酶的重组毕赤酵母为出发菌株，以氨基酸 生产离子交换尾液为基础发酵培养基，经种子培养、液体深层发酵和离心分离制 得所述的生物酶制剂和酵母饲料蛋白。本领域普通技术人员可以根据实际的研究 和生产需求，将某特定酶的编码基因导入毕赤酵母中，从而构建重组毕赤酵母。 巴斯德毕赤酵母是近十年来发展起来的较为完善的，被广泛用来表达外源蛋白的 甲醇营养型酵母菌。在高效表达载体中最常用的启动子是A0X1启动子，它的甲 醇诱导性很强，使在它控制下的外源基因能得到较高的表达。PGAP(三磷酸甘油醛 脱氢酶启动子)是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子，由于该 组成型启动子不需甲醇诱导，发酵工艺更为简单，而同时其产量很高，所以成为代 替PA0X1的最有潜力的启动子。根据本发明的方法，可以将大肠杆菌的植酸酶 appA克隆到PGAP启动子上，在流加葡萄糖的情况下可以组成性高效表达植酸酶， 来源于大肠杆菌的植酸酶appA具有优良的酶学性质和较高的比活。
根据本发明的方法，其中，所述酶为能在毕赤酵母中组成性表达的酶，优 选植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶或半乳糖苷酶、更优选 来源于大肠杆菌的植酸酶appA。
根据本发明的方法，其中，所述氨基酸为可用离子交换方法提取的氨基酸， 优选谷氨酸或赖氨酸。
根据本发明的方法，其中，在所述种子培养步骤中
所用种子培养基配方1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；培养条件培养时间为20~24小时，温度30'C，摇床转速为250rpm。 根据本发明的方法，其中，在所述液体深层发酵步骤中
所用发酵培养基配方氨基酸生产离子交换尾液300 kg/吨、KH2P04 5 kg/ 吨、CaS04 l.Okg/吨、MgS04 8kg/吨、用KOH调pH值5.0，培养过程中连续流 加50%的葡萄糖，流加量为2 10ml/L/h;
发酵培养条件在5L发酵罐中，发酵时间60 64小时，温度30'C，通风量 1.5 2.0wm，搅拌转速1000 rpm ， pH值用氨水维持在5.0，发酵过程溶氧不低于 20%。
本发明提出了一种处理工业废水的方法，氨基酸生产过程中的离子交换尾液 通过液体深层发酵生产饲料用酶制剂和酵母饲料蛋白，利用重组毕赤酵母在富含 铵基氮的离子交换尾液中快速生长，并可以大幅度降低发酵液中铵基氮离子，提 升酵母蛋白产品的品质。根据本发明的方法，不仅减少了工业废水的处理成本， 降低了对环境的污染，而且还将工业废水变废为宝，生产出较高价值的产品；用 该工业废水经液体深层发酵可制备植酸酶，酶活达到3025 u/ml，可添加到饲料中。 植酸酶可使饲料中的植酸磷降解成肌醇和磷酸，提高植物性词料中磷的利用率， 减少动物粪便中磷的排出量，从而减少饲料中无机磷的添加量，因此对提高畜牧
生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。
图1为发酵过程培养曲线。
具体实施例方式
培养基成份
种子培养基(YPD): 1%酵母提取物(进口)， 2%蛋白胨(进口)， 2%葡萄糖发酵培养基离子交换尾液300 kg/吨、KH2P04 5 kg/吨、CaS04 1.0 kg/吨、 MgSO48kg/吨、用KOH调pH值5.0。
PTM1成份
硫酸铜6.0g/L，碘化钾0.18 g/L，硫酸锰10 g/L，钼酸钠0.2 g/L，硼
酸0.02 g/L，氯化钴0.5 g/L，氯化锌20 g/L，硫酸亚铁65 g/L，硫酸5.0 mL/L(以
上成份配制后单独高压灭菌)，生物素0.2g/L(过滤灭菌)。
1、 种子液制备
从斜面上刮取两环菌种，置于装有50 ml种子培养基的250 ml三角瓶中进行 种子培养。条件为培养时间24小时，温度30 °C，摇床转速250 rpm。再以10% 接种量接入装有200 ml种子培养基的1000 ml三角瓶中进行发酵培养。条件为培 养时间24小时，温度3(TC，摇床转速250rpm。此时菌液的0D值应达到12(以上)。
2、 发酵生产
在5L发酵罐内装3.0 L发酵培养基灭菌后，按每升培养基加入4.37mL PTM1 ， 5 10%接种种子液，温度30。C，通风量为1.6 0L/L/min， 1000卬m搅拌培养，培养过 程中连续流加50% (w/v)葡萄糖(每升中含12mLPTMl)，流加量为2 8mL/h/L， pH用氨水维持在5.0，溶氧维持在20%以上。培养结束时，酶活可以达到3025 U/mL，菌体干重达到120-130 g/L (如图1所示)。
3、 植酸酶活性测定的原理与定义
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物， 在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的(NH4)3P04NH4V03 '16MoCb复合 物，在波长415nm下进行比色测定。样品在底物浓度为5.0mmol/L、温度37。C、 pH值5.0的条件下，每分钟从植 酸钠中释放l^mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
权利要求
1、一种生产生物酶制剂和酵母饲料蛋白的方法，其特征在于，所述方法以表达所述生物酶的重组毕赤酵母为出发菌株，以氨基酸生产离子交换尾液为基础发酵培养基，经种子培养、液体深层发酵和离心分离制得所述生物酶制剂和酵母饲料蛋白。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶为能在毕赤酵母中组成性表达的酶。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶为植酸酶、木聚 糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶或半乳糖苷酶。
4、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶为来源于大肠杆菌 的植酸酶appA。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸为可用离子 交换方法提取的氨基酸。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述氨基酸为谷氨酸或 赖氨酸。
7、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述种子培养步骤中 所用种子培养基配方1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；培养条件培养时间为20-24小时，温度3(TC，摇床转速为250rpm。
8、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述液体深层发酵步骤中所用发酵培养基配方氨基酸生产离子交换尾液300 kg/吨、KH2P04 5 kg/ 吨、CaS04 l.Okg/吨、MgS04 8kg/吨、用KOH调pH值5.0，培养过程中连续流 加50%的葡萄糖，流加量为2 10ml/L/h;发酵培养条件在5L发酵罐中，发酵时间60-64小时，温度30'C，通风量 1.5 2.0vvm，搅拌转速1000 rpm , pH值用氨水维持在5.0，发酵过程溶氧不低于 20%。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及一种生产生物酶制剂和酵母饲料蛋白的方法。根据本发明的方法以表达所述生物酶的重组毕赤酵母为出发菌株，以氨基酸生产离子交换尾液为基础发酵培养基，经种子培养、液体深层发酵和离心分离制得所述含生物酶制剂和酵母饲料蛋白。根据本发明的方法，不仅减少了工业废水的处理成本，降低了对环境的污染，而且还将工业废水变废为宝，生产出较高价值的产品。植酸酶可使饲料中的植酸磷降解成肌醇和磷酸，提高植物性饲料中磷的利用率，减少动物粪便中磷的排出量，从而减少饲料中无机磷的添加量，因此对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。
文档编号C12N1/19GK101298596SQ20071009895
公开日2008年11月5日 申请日期2007年4月30日 优先权日2007年4月30日
发明者史秀云, 斌 姚, 昆 孟, 杨培龙, 柏映国, 王亚茹, 石鹏军, 罗会颖, 袁铁铮, 黄火清 申请人:中国农业科学院饲料研究所