专利名称：从亚油酸异构酶产生菌中提取纯化亚油酸异构酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种从亚油酸异构酶产生菌中提取纯化亚油酸异构酶的方法。
背景技术：
共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)是一种非常令人感兴趣的营养添加剂，大量的体内体外试验证明CLA能诱导能量利用并导致体重的下降，且不储存脂肪；能缓和如厌食、蛋白质分解等免疫反应的副作用；具有抗突变、抑制癌细胞中的蛋白质和核酸的合成，此外CLA还可提高人类某些生理状态，如提高体内维生素A的水平。由于CLA具有丰富的营养价值，同时食品中含量很低，所以如何低成本、高纯度地制备CLA成为研究焦点，CLA的商业化生产方法为亚油酸的碱异构化法。碱异构化法的原料是含有77％亚油酸的葵花籽油，经过KOH(或NaOH)强碱的作用转化成CLA，这种方法比较简单，且产物易于处理，在商业上应用较广，但其缺点是产生一系列具有位置和几何异构的CLA混合物。相比之下，利用乳酸菌中提取的亚油酸异构酶生产CLA具有重要意义。因为CLA的微生物异构化具有选择性，其亚油酸异构酶能专一地作用于脂肪酸的12C双键，而不是9C双键，因而能把亚油酸主要转化为c9，t11-CLA，而且微生物在培养方面较为灵活、方便。而乳酸菌兼性厌氧，培养条件易于控制，是人体益生菌，可直接用于食品、保健品和药品。同时乳酸菌含有的亚油酸异构酶对作用底物具有很强的专一性。
亚油酸异构酶可来源于多种微生物如乳酸杆菌(Lactobacillus)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、真杆菌属(Eubacterium)等，其中Lactobacillus、Eubacterium、Butyrivibrio的微生物具有c9，t11亚油酸异构酶的活性，而Propionibacterium有t10，c12亚油酸异构酶的活性。
公开号为1289758、1415718和1356386的中国专利文献介绍了用化学异构法生产CLA的方法，原料主要为富含亚油酸的红花油、脱水蓖麻油、盐地碱蓬籽油等，在强碱环境中发生共轭化反应。虽然工艺简单，对设备要求低，但产物中含有大量有毒溶剂，异构体组成复杂，下游提取纯化工艺复杂，因此应用于食品与药品行业存在一定局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种从亚油酸异构酶产生菌中提取纯化亚油酸异构酶的方法。
本发明所提供的从亚油酸异构酶产生菌中提取纯化亚油酸异构酶的方法，包括以下步骤1)用超高压均质法破碎亚油酸异构酶产生菌的菌体细胞，得到均质液，将该均质液进行离心，收集含有蛋白质的上清液得到粗酶液；所述超高压均质法的均质工作压力为130-160MPa，均质阀片直径为0.05-0.15mm；2)将步骤1)得到的粗酶液进行(NH4)2SO4饱和度为40-90％的(NH4)2SO4分级沉淀，收集沉淀，用磷酸钾缓冲液悬浮，得到酶液；所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0；3)将步骤2)得到的酶液进行离子交换层析，所述离子交换层析采用pH为5.5-7.0、摩尔浓度为0-0.7mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱，收集具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液；4)将步骤3)得到的具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液用摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液进行透析脱盐；5)将经过步骤4)透析的酶液凝胶过滤层析；所述凝胶过滤层析中采用的洗脱液为摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液，得到亚油酸异构酶。
所述超高压均质法中的细胞的含量可为108-1014CFU/ml，优选为1010-1012CFU/ml。
所述凝胶过滤层析采用的凝胶层析柱可为Sephacryl 200HR、也可采用其它分子量范围与上述填料相近似的层析柱如Sephadex。
所述离子交换层析采用的层析柱可为DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，也可可采用其它的弱阴离子交换层析柱。
所述(NH4)2SO4的饱和度具体可为60％、80％或90％。
所述亚油酸异构酶产生菌可为现有的任何亚油酸异构酶产生菌，如可为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)和真杆菌属(Eubacterium)等中的一种或一种以上的菌种或菌株。如乳酸杆菌属(Lactobacillus)中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974。这些菌株的菌体均可按照现有的发酵方法获得。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974，已于2007年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏登记号为CGMCC No.1974。
本发明的方法中采用超高压均质进行细胞破碎，细胞破碎率高，亚油酸异构酶比活力高；选用磷酸钾作为缓冲液，可很好的保持酶活；在透析前进行凝胶过滤层析，减少了提纯环节，减少了酶活损失。采用本发明的方法，可得到219.33-246.24U/mg洗脱峰酶液的亚油酸异构酶。
图1为实施例1的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱图谱图2为实施例1的酶活检测3为实施例1的凝胶过滤层析洗脱及酶活检测图谱图4为实施例2的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱图谱图5为实施例2的酶活检测6为实施例2的凝胶过滤层析洗脱及酶活检测图谱图7为实施例3的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱图谱图8为实施例3的酶活检测9为实施例3的凝胶过滤层析洗脱及酶活检测图谱具体实施方式
本发明中设定各种处理分别如下细胞破碎方法振荡法、超声波破碎法、超高压均质法。
细胞破碎参数菌体的含量为108-1014CFU/ml，溶菌酶的终浓度为10-60g/L。
(NH4)2SO4饱和度30～90％。
NaCl洗脱液浓度0～0.7mol/L。
在以上各个处理设定的范围内，通过试验进行优化。优化指标为共轭亚油酸酶活。优选出各个处理分别为细胞破碎方法采用超高压均质法，菌体的含量为1010-1012CFU/ml，溶菌酶的终浓度为20-50g/L。
(NH4)2SO4饱和度60～90％。
NaCl洗脱液浓度0.3-0.5mol/L。
下面仅以从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974发酵液中提取纯化亚油酸异构酶为例，阐述本发明的技术方案。
实施例1、提取纯化亚油酸异构酶1、亚油酸异构酶发酵液的获得该实施例中所用的发酵培养基按照如下方法配制(1)葵花籽油乳化液的配制葵花籽油(上海佳格食品有限公司，多力牌100％纯正葵花籽油)300mg，吐温-80(Tween-80)0.36ml，去离子水5ml，超声波乳化(25℃，超声频率40KHz)10min，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌，得到葵花籽油乳化液。
(2)脱脂乳培养基的配制将12g脱脂奶粉(三元乳品股份有限公司)溶解于100ml水中，5℃、10min灭菌备用。
(3)发酵培养基的配制将(1)的葵花籽油乳化液加入到(2)的脱脂乳培养基中，使葵花籽油的终浓度为10mg/ml，得到发酵培养基。
将经活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974用接种环挑取2环于种子培养基中，37℃培养8h后，取2％(体积比)种子培养液转接至装有4L发酵液的5L发酵罐中，37℃培养24小时。其中，发酵罐的通风量(通氮气)0-24小时，0.5vvm。
2、亚油酸异构酶的提取将步骤1中的发酵液进行10000×g，15min的离心，收集细胞。向收集的细胞中加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)和溶菌酶，使菌体的最终含量为2×1011CFU/ml，溶菌酶的终浓度为40g/L。用纳米NCJJ0.005/150型超高压均质机(河北廊坊通用机械有限公司)进行细胞破碎。其中，超高压均质的均质工作压力为140MPa，均质阀片直径0.1mm，重复四次，每次处理10min，处理温度为0℃。均质液经10000×g离心60min，取上清液部分，作为进一步纯化的粗酶液。
3、亚油酸异构酶的纯化a.(NH4)2SO4分级沉淀在冰水浴条件下，向步骤1得到的粗酶液中加入(NH4)2SO4至饱和度为80％(在冰浴中将研磨细的(NH4)2SO4边搅拌边缓慢的加入到粗酶液中，每升粗酶液加入(NH4)2SO4516克，4℃静置过夜、离心(10000×g，30min)收集沉淀(蛋白)，将每次所得沉淀用2-3倍体积的磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)悬浮，用聚乙二醇浓缩，得到酶液。
b.离子交换层析所的酶液上样上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的DEAE-SepharoseFast Flow层析柱(1.0cm×20cm)(Pharmacia公司)，用0～0.8mol/LNaCl的缓冲液以3ml/min流速进行线性洗脱每管收集5 mL，NaCl线性洗脱出4个蛋白峰，如图1。其中峰III为酶活力峰，如图2所示，即NaCl摩尔浓度为0.3-0.5mol/L洗脱峰具有亚油酸异构酶活性。
其中，亚油酸异构酶酶活，以在最适条件(30℃，5h，pH6.0)下，以亚油酸为底物进行反应，每小时生成1μg共轭亚油酸的酶量定义为一个酶活力单位。其中，共轭亚油酸采用紫外分光光度法测定，具体方法如下1)将CLA标准品用正己烷配成不同浓度梯度溶液，测定233nm处吸光度值，以CLA浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2)5ml洗脱液中加入10ml V(氯仿)/V(甲醇)＝2∶1，4500r/min(2000g)离心5min，收集下层液体，用无水Na2SO4干燥，并真空干燥脱除有机溶剂。将上述提取物用10ml正己烷溶解，待测。3)紫外分光光度计在200～350nm范围内扫描，并读取233nm处的吸收值，参比为正己烷溶液，其他步骤同样品。
c.酶液透析脱盐将步骤b中收集的具有亚油酸异构酶活性的酶液装入透析袋中，浸入1000ml磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)中，4℃下磁力搅拌12h，用10mM的NaCl缓冲液(pH6.0)检查脱盐情况，至无沉淀产生时，达到透析平衡。
d.凝胶过滤层析将步骤c中到达到透析平衡的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的Sephacryl 200HR凝胶层析柱(1.6cm×100cm)(Pharmacia公司)，以0.3ml/min流速，用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)洗脱，每管收集3mL，对每管洗脱液进行酶活检测，收集具有亚油酸异构酶活性的部分。结果如图3所示，第30-37管洗脱液具有亚油酸异构酶活性。该具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液的酶比活力为246.24U/mg洗脱峰酶液。其中，亚油酸异构酶活性的测定方法同步骤b。
实施例2、提取纯化亚油酸异构酶1、亚油酸异构酶发酵液的获得该实施例中所用的发酵培养基按照如下方法配制该实施例中所用的发酵培养基按照如下方法配制(1)葵花籽油乳化液的配制葵花籽油(上海佳格食品有限公司，多力牌100％纯正葵花籽油)400mg，吐温-80(Tweenum 80)0.44ml，去离子水5ml，超声波乳化(25℃，超声频率40KHz)10min，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌，得到葵花籽油乳化液。
(2)脱脂乳培养基的配制将12g脱脂奶粉(北京三元乳品股份公司提供)溶解于100ml水中，5℃、10min灭菌备用。
(3)发酵培养基的配制将(1)的葵花籽油乳化液加入到(2)的脱脂乳培养基中，使葵花籽油的终浓度为8mg/ml，得到发酵培养基。
将经活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974用接种环挑取2环于种子培养基中，37℃培养8h后，取2％(体积比)种子培养液转接至装有4L发酵液的5L发酵罐中，37℃微氧(充N2驱除空气)培养12小时。其中，发酵罐的通风量(通氮气)0-12小时，0.5vvm。
2、亚油酸异构酶的提取将步骤1中的发酵液进行10000×g，15min的离心，收集细胞。向收集的细胞中加入0.08M磷酸钾缓冲液(pH5.5)和溶菌酶，使菌体的最终含量为5×1010CFU/ml，溶菌酶的终浓度为20g/L。用纳米NCJJ0.005/150型超高压均质机(河北廊坊通用机械有限公司)进行细胞破碎。其中，超高压均质的均质工作压力为130MPa，均质阀片直径0.05mm，重复四次，每次处理10min，处理温度为0℃。均质液经10000×g离心60min，取上清液部分，作为进一步纯化的粗酶液。
3、亚油酸异构酶的纯化a.(NH4)2SO4分级沉淀在冰水浴条件下，向步骤1得到的粗酶液中加入(NH4)2SO4至饱和度为90％(在冰浴中将研磨细的(NH4)2SO4边搅拌边缓慢的加入到粗酶液中，每升粗酶液加入(NH4)2SO4603克，4℃静置过夜、离心(10000×g，30min)收集沉淀(蛋白)，将每次所得沉淀用2-3倍体积的磷酸钾缓冲液0.08M pH5.5悬浮，用聚乙二醇浓缩，得到酶液。
b.离子交换层析所得的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.08M pH5.5)预平衡的DEAE-SepharoseFast Flow层析柱(1.0cm×20cm)(Pharmacia公司)，用0～0.8MNaCl的缓冲液以3ml/min流速进行线性洗脱每管收集5mL，NaCl线性洗脱出4个蛋白峰，如图4。其中峰III为酶活力峰，如图5所示，即NaCl摩尔浓度为0.3-0.5mol/L洗脱峰具有亚油酸异构酶活性。
其中，亚油酸异构酶酶活的测定方法同实施例1。
c.酶液透析脱盐将步骤b中收集的具有亚油酸异构酶活性的酶液装入透析袋中，浸入1000ml磷酸钾缓冲液(0.08M pH5.5)中，4℃下磁力搅拌12h，用10mM的NaCl缓冲液(pH5.5)检查脱盐情况，至无沉淀产生时，达到透析平衡。
d.凝胶过滤层析将步骤c中到达到透析平衡的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的Sephacryl 200HR凝胶层析柱(1.6cm×100cm)(Pharmacia公司)，以0.3ml/min流速，用磷酸钾缓冲液(0.08M pH5.5)洗脱，每管收集3mL，对每管洗脱液进行酶活检测，收集具有亚油酸异构酶活性的部分。结果如图6所示，第30-36管洗脱液具有亚油酸异构酶活性。该具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液的酶比活力235.11U/mg洗脱峰酶液。其中，亚油酸异构酶活性的测定方法同实施例1。
实施例3、提取纯化亚油酸异构酶1、亚油酸异构酶发酵液的获得该实施例中所用的发酵培养基按照如下方法配制(1)葵花籽油乳化液的配制葵花籽油(上海佳格食品有限公司，多力牌100％纯正葵花籽油)600mg，吐温-80(Tween-80)0.5ml，去离子水5ml，超声波乳化(25℃，超声频率40KHz)10min，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌，得到葵花籽油乳化液。
(2)脱脂乳培养基的配制将12g脱脂奶粉(三元乳品股份有限公司)溶解于100ml水中，115℃、10min灭菌备用。
(3)发酵培养基的配制将(1)的葵花籽油乳化液加入到(2)的脱脂乳培养基中，使葵花籽油的终浓度为6mg/ml，得到发酵培养基。
将经活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974用接种环挑取2环于种子培养基中，37℃培养8h后，取2％(体积比)种子培养液转接至装有4L发酵液的5L厌氧发酵罐中，37℃微氧培养(充N2驱除空气)培养8小时。其中，发酵罐的通风量(通氮气)0-8小时，0.5vvm。
2、亚油酸异构酶的提取将步骤1中的发酵液进行10000×g，15min的离心，收集细胞。向收集的细胞中加入0.15M磷酸钾缓冲液(pH7.0)和溶菌酶，使菌体的最终含量为2×1012CFU/ml，溶菌酶的终浓度为50g/L。用纳米NCJJ0.005/150型超高压均质机(河北廊坊通用机械有限公司)进行细胞破碎。其中，超高压均质的均质工作压力为150MPa，均质阀片直径0.15mm，重复四次，每次处理10min，处理温度为0℃。均质液经10000×g离心60min，取上清液部分，作为进一步纯化的粗酶液。
3、亚油酸异构酶的纯化a.(NH4)2SO4分级沉淀在冰水浴条件下，向步骤1得到的粗酶液中加入(NH4)2SO4至饱和度为60％(在冰浴中将研磨细的(NH4)2SO4边搅拌边缓慢的加入到粗酶液中，每升粗酶液加入(NH4)2SO4361克，4℃静置过夜、离心(10000×g，30min)收集沉淀(蛋白)，将每次所得沉淀用2-3倍体积的磷酸钾缓冲液(0.15M pH7.0)悬浮，用聚乙二醇浓缩，得到酶液。
b.离子交换层析所得的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的DEAE-Sepharose FastFlow层析柱(1.0cm×20cm)(Pharmacia公司)，用0～0.8MNaCl的缓冲液以3ml/min流速进行线性洗脱每管收集5mL，NaCl线性洗脱出4个蛋白峰，如图7。其中峰III为酶活力峰，如图8所示，即NaCl摩尔浓度为0.3-0.5mol/L洗脱峰具有亚油酸异构酶活性。
其中，亚油酸异构酶酶活的测定方法同实施例1。
c.酶液透析脱盐将步骤b中收集的具有亚油酸异构酶活性的酶液装入透析袋中，浸入1000ml磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)中，4℃下磁力搅拌12h，用10mM的NaCl缓冲液(pH6.0)检查脱盐情况，至无沉淀产生时，达到透析平衡。
d.凝胶过滤层析将步骤c中到达到透析平衡的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的Sephacryl 200HR凝胶层析柱(1.6cm×100cm) (Pharmacia公司)，以0.3ml/min流速，用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)洗脱，每管收集3mL，对每管洗脱液进行酶活检测，收集具有亚油酸异构酶活性的部分。结果如图9所示，第31-36洗脱液具有亚油酸异构酶活性。该具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液的酶比活力219.33U/mg洗脱峰酶液。其中，亚油酸异构酶活性的测定方法同实施例1。
权利要求
1.一种从亚油酸异构酶产生菌中提取纯化亚油酸异构酶的方法，包括以下步骤1)用超高压均质法破碎亚油酸异构酶产生菌的菌体细胞，得到均质液，将该均质液进行离心，收集含有蛋白质的上清液得到粗酶液；所述超高压均质法的均质工作压力为130-160MPa，均质阀片直径为0.05-0.15mm；2)将步骤1)得到的粗酶液进行(NH4)2SO4饱和度为40-90％的(NH4)2SO4分级沉淀，收集沉淀，用磷酸钾缓冲液悬浮，得到酶液；所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0；3)将步骤2)得到的酶液进行离子交换层析，所述离子交换层析采用pH为5.5-7.0、摩尔浓度为0.1-0.7mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱，收集具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液；4)将步骤3)得到的具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液用摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液进行透析脱盐；5)将经过步骤4)透析的酶液凝胶过滤层析；所述凝胶过滤层析中采用的洗脱液为摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液，得到亚油酸异构酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子交换层析中，采用pH为5.5-7.0、摩尔浓度为0.3-0.5mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述超高压均质法中的细胞的含量为1010-1012CFU/ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述超高压均质法中的细胞的含量为1011CFU/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述凝胶过滤层析采用的凝胶层析柱为Sephacryl 200HR，所述离子交换层析采用的层析柱为DEAE-Sepharose FastFlow层析柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述超高压均质法的均质工作压力为130MPa、均质阀片直径为0.05mm，140MPa、均质阀片直径为0.1mm，或150MPa、均质阀片直径为0.15mm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述(NH4)2SO4的饱和度为60％、80％或90％。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度为0.1mol/L、pH为pH6.0，0.08mol/L、pH为pH5.5，或0.15mol/L、pH为pH7.0。
9.根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述亚油酸异构酶产生菌为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)和真杆菌属(Eubacterium)中的一种或一种以上的菌种或菌株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述亚油酸异构酶产生菌为乳酸杆菌属(Lac tobacillus)中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCCNo.1974。
全文摘要
本发明公开了一种从亚油酸异构酶产生菌中提取纯化亚油酸异构酶的方法。该方法包括1)用超高压均质法破碎亚油酸异构酶产生菌的菌体细胞，得到均质液，将该均质液进行离心，收集含有蛋白质的上清液得到粗酶液；2)进行(NH
文档编号C12P7/64GK101092613SQ20071009965
公开日2007年12月26日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者吕加平, 王丽敏, 任星环, 江均平 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所