专利名称：离子注入诱变甜菜早熟突变体的获得及其验证技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及农作物遗传育种及分子生物技术领域，具体的涉及一种利用离子注入诱变甜菜获得早熟突变体及其验证技术领域。
背景技术：
我国在80年代中期由中国科学院等离子体物理研究所余增亮研究员等一批科技工作者新开创的研究领域，发现了离子注入生命体的生物学效应将各种不同离子注入细胞内，通过电能质的共同作用，不仅可以影响细胞的生理功能，更重要的是它可以使细胞的遗传物质发生改变；由于能量的作用和质量的掺杂，会形成大量的自由基，能够造成生命细胞内遗传物质DNA氢键断裂、双链分开、染色体畸变等，从而诱导和激发细胞对DNA的修复和重组作用，导致生物体发生变异。是育种方法学的重要创新。
离子注入作物改良和生物效应研究，是物理学和生物学相结合的新兴的交叉学科，用离子注入对作物种子进行离子束激发和诱变，可获得损伤轻、突变率高、突变谱广的统计结果，将预期的受控离子注入遗传物质某一薄层内，通过能量交换、离子掺杂过程，引起基因突变和重组，在新的基础上稳定表达，以达到作物改良、获得优良品种的目的，这是一条提高作物产量、改进品质和抗性的行之有效的新途径。近年来中国科学院等离子体物理研究所、安徽农学院、华中农业大学等已将此技术应用于水稻、棉花等育种领域，并有新品系通过鉴定并在生产上已推广600万亩，取得巨大经济效益。
中国科学院离子束生物技术重点实验室用离子束介导法将碳4循环紫玉米的总DNA导入水稻品种获得了一批稳定遗传的变异株系，不仅根系发达，而且在茎干等部位表现出供体玉米的紫色性状，其中农艺性状较好的8个株系的光合速率平均比早籼213提高84％。河南省离子束生物技术重点实验室用离子束介导法将两个大豆品种的总DNA分别导入两个小麦栽培品种获得了两个蛋白质含量分别为20.46％和25.35％的高蛋白小麦株系。
实践证明，离子束介导外源DNA的遗传转化为远缘、超远缘物种间的基因交流提供了一种途径，为实现多基因的转移和协调表达提供了可能性。
目前，由于诸多因素造成甜菜含糖量和产量下降，病害严重，为此急需解决提高甜菜产量、含糖量和抗病能力问题，解决早熟品种合理布局，但因甜菜育种种质资源缺乏。甜菜育种通常通过杂交转育产生新的基因源，存在周期太长，在没有基因来源的情况下，无法获得新的甜菜创新材料，这制约着甜菜育种的发展。在甜菜理化诱变领域，曾先后应用航天、钴60等诱变方法，但效果均不明显。离子注入技术具有定向性、多样性及安全性，有较高的突变率和较宽的突变谱。作为一种新的诱变源，在棉花、水稻、小麦、番茄、谷子等作物育种应用上已取得了有效的进展。在生物学研究领域中，如何优化甜菜等经济作物种子，通过探讨离子束作为诱变源，使甜菜种子内部发生生理突变，提高突变酶活化，促使基因活化形成变异遗传具有重要的意义。
DNA分子标记辅助育种技术是通过利用与目标性状紧密连锁的DNA进行间接选择的现代育种技术。该技术不仅可在早代进行准确、稳定的选择，而且可克服再度利用隐性基因时的识别难问题，从而加速育种进程，提高育种效率。欧美等国近年都投入巨资开展这方面的工作。已经鉴定到水稻、小麦、玉米、棉花、大豆等作物的一些农艺性状分子标记，利用分子标记辅助选择育种也取得进展。对于探讨离子束诱变甜菜后获得的亲本资源，通过分子标记技术进一步验证通过离子束诱变获得亲本资源的特性具有重要作用。
发明内容
针对目前国内外尚未对甜菜用离子束诱变技术进行处理获得相应亲本资源的现状。本发明将离子注入诱变技术和分子标记技术有效地结合应用在甜菜中，获得甜菜早熟突变体亲本基因源。
本发明提供了一种甜菜纯合自交系7201亲本材料，是一种多胚种子。
本发明还提供了一种利用离子注入诱变甜菜7201亲本材料获得优良早熟突变体Y系-1材料及其验证技术。
本领域普通技术人员所熟知，甜菜(Beta Vulgaris L)属藜科(Chenopodiaceae)甜菜属，是两年生作物，栽培甜菜分为四个变种，分别为糖用、饲用、食用和叶用，根据甜菜类型的多样性和植株形态、细胞学和遗传学特性所表现出的明显差异，将其又分类为二倍体、单胚或多胚和花粉可育；四倍体、单胚或多胚和花粉可育。
具体的，本发明提供的甜菜7201亲本材料，是经发明人多年多点筛选出的稳定的纯合自交系、多胚种子，花粉可育，四倍体(4n＝36)，一般含糖率在16.1-17.3％，块根产量3508kg/亩，生育期在185天左右，块根根型为锥型，最大根茎为13.5cm左右(所在位置在块根的1/4处)，根皮白色，根肉白色，根沟深浅中等，叶丛直立，叶片呈犁铧型，叶缘中波，叶片绿色，叶丛高度63cm，叶片皱褶，千粒重29g，种株紧密型，花药黄色。该纯合自交系具有幼苗顶土能力强、易保苗、含糖率较高、适应性较强的特点，是经过多年育种工作选用的骨干自交系，其过氧化物酶同工酶谱图和RAPD核酸电泳图参见附图1、2。
本发明提供的甜菜早熟突变体Y系-1按以下几个步骤获得(1)、通过不同的离子注入方式、能量和剂量应用甜菜的试验，确定了获得优良甜菜早熟突变体的最佳离子注入方式、能量和剂量的具体方案；(2)、通过细胞学、过氧化物酶同工酶生理检测和RAPD分子生物学的检测、验证获得甜菜亲本资源属早熟突变体。
本发明具体提供了一种利用离子注入诱变甜菜获得优良早熟突变体Y系-1材料。早熟突变体Y系-1材料获得，通过利用提供的纯合自交系7201亲本材料，经过上述提供的步骤而获得甜菜早熟突变体。获得的甜菜早熟突变体是一种四倍体(4n＝36)，含糖率在生育期165天时为17.3％，而对照为15.6％，与对照相比含糖积累提前20天，种株调查结果成熟期较对照纯合自交系7201亲本材料提前15-20天，其过氧化物酶同工酶谱图和RAPD核酸电泳图参见附图1、2。
具体的，本发明通过选用甜菜纯合自交系7201亲本材料多粒干种子。以能量选用30-60Kev的N+离子进行甜菜种子注入，其注入剂量为2×1016N+/CM2-7×1016N+/CM2，脉冲次数为40-60次。多粒种进行破壳和未破壳处理。处理后的种子装入纱布袋，用20℃温水浸种18小时，人工精量点播。生育期观察记载形态变化，通过综合观测其发芽率、发芽势、叶片过氧化物酶同工酶。收获时测定春播、夏播母根长、宽、重及糖度。并于片真叶期取第五片叶进行观察低剂量离子注入对甜菜植株酶性变化及酶带出现情况，并进行同功酶和RAPD分子生物学的检测。
本发明具体通过离子注入诱变甜菜7201亲本材料，将在离子的一定能量范围，按不同注入方式、不同注入剂量，并且选用不同类型的离子对试验材料进行多种样本的注入试验，本发明具体选用不同的N+能量20Kev、25Kev、30Kev、35Kev、40Kev、45Kev、50Kev、55Kev、60Kev、65Kev、70Kev；选用注入不同的剂量2×1016N+/cm2、3×1016N+/cm2、4×1016N+/cm2、5×1016N+/cm2、6×1016N+/cm2、7x1016N+/cm2、8×1016N+/cm2；选用不同脉冲次数30、35、40、45、50、55、60、65、70分别注入诱变甜菜7201亲本材料。研究和分析以上不同作法对甜菜的生物学特性及品质产生的影响和诱变效果，确定离子束注入的方式、能量范围、注入剂量。确定了甜菜亲本材料在离子注入作用下的生物效应和作物改良的关系。
本发明设置了“离子束一次处理试验”、“离子束亲本材料处理试验”和“早熟亲本材料鉴定试验”及采种试验，先后进行了130个处理项次，取得了2670个试验数据并进行了研究分析，证明了通过离子注入诱变甜菜可获得优良早熟突变体。
本发明已证明，通过甜菜离子注入诱变获得亲本材料的早熟性是诸多变异中出现次数最多的一种突变。离子注入甜菜种子收获时，发现Y系-1处理的种子成熟期较对照和其它材料提前15天左右，为此在其第二年二代进行动态含糖积累状况测定，结果表明，Y系-1处理的含糖率在每年的9月4日达到17.3％，每年的9月14日之后仍在缓慢上升为17.4 5％，每年的9月24日为18.96％，而对照7201每年的含糖率同期9月4日只有15.6％，9月14日为16.0％，到9月24日才能达到17.3％，Y系-1处理的含糖率积累时间较对照样提前了20天。
本发明获得早熟突变体具体的步骤如下(1)、N+离子注入能量、剂量、方式实验，优选确定N+离子注入甜菜的能量、剂量、方式。选择N+离子在离子的低能范围，采用7201(多粒)、7201-1(多粒)、等材料及相应的对照，按连续或间断不同的脉冲方式、不同的剂量进行多种的注入试验。通过发芽率、发芽势，第一次筛选剂量、能量范围的分析验证，证明了采用N+离子的30Kev-60Kev，连续脉冲或间断脉冲方式，以2.0×1016N+/CM2-7.0×1016N+/CM2剂量注入甜菜品种可获得早熟甜菜亲本材料Y系-1。
(2)、通过田间对比种植试验，确定最佳离子注入能量、剂量和方式。对多个处理样本安排相同环境条件的比较种植试验，从播种到收获详细记载处理材料的农艺性状和生物学性状，对品质性状进行测试分析、以确定最佳的34Kev N+离子，注入方式为连续脉冲，注入能量为4.0×1016N+/CM2、脉冲次数为40次或注入能量为6.0×1016N+/CM2、脉冲次数为60次，获得优良早熟甜菜亲本材料Y系-1。
(3)、通过离子注入诱变优良甜菜品种前后的变化，通过获得早熟突变体亲本材料与对照样对比进行细胞学、过氧化物酶同工酶生理检测和RAPD分子生物学的检测，逐步纯化有益变异株系，获得的优良早熟突变体亲本材料Y系-1。具体通过叶片过氧化物酶同工酶检测，寻找离子注入生物体后，产生的生物效应和作物改良之间的关系，结合品质检测，筛选有突出诱变效果的处理材料，将母根保存，第二年收获的种子分别进行一年生种植，品质检测和处理种子的繁殖保存，筛选具有优异性状的亲本材料，证实了获得的优良早熟突变体亲本材料Y系-1。
(4)、通过试验验证，通过甜菜离子注入诱变产生的早熟突变体不仅在田间有稳定的突变表现，通过RAPD分析证实了在DNA水平上也同样存在差异。
本领域所熟知，DNA分子标记(DNA Molecular markers)是物种遗传变异在DNA水平上的直接反映，与传统的形态标记相比，它具有既不受生物的组织、器官、细胞类型及发育时期的影响，且数量丰富，稳定性好，操作简便等优点而广泛地在资源与育种研究中得到利用。DNA是形态学、同工酶、核型特征的遗传基础，其位点和数量十分丰富，是准确进行种质资源鉴定的依据。
本发明以离子注入诱变技术获得的甜菜早熟突变体Y系-1和未做诱变处理的材料7201为对照材料，提取DNA并进行RAPD分析，选取800条RAPD随机引物对Y系-1和对照组7201进行扩增，结果表明，Y系-1和对照之间在DNA水平上存在差异。从800条随机引物中筛选到45条在Y系-1和对照中存在差异，存在差异的引物占所用引物数的5.6％，表明Y系-1和对照组相似性很高。本发明以离子注入诱变获得的早熟突变体和未经诱变处理的对照材料7201，将为构建分子标记作图群体，定位与早熟性状相关的基因奠定了坚实的技术基础。
本发明充分利用新疆地区光照充足地域广的优势，实验室与田间试验交替进行。
本发明经过多年的试验研究表明，离子注入对甜菜有明显的诱变效果，并与其它理化诱变效应有明显的区别，离子注入甜菜种子后出现早熟变异性状。
N+注入甜菜叶片中过氧化物酶同工酶的动态研究表明，在单粒种处理中，随着脉冲次数增多，酶的着色逐渐变浅。而在多粒种处理中，随着脉冲次数和注入剂量的增多，酶的着色逐渐变深，其糖度和其它性状值都有明显增加。说明N+注入引起植物过氧化物酶同工酶活性发生变化，导致植物体内源激素改变。分子图谱也相应出现了与大田地对照不同的谱带，证明了其种子遗传物质发生了变化。同时也证明了离子注入对甜菜获得早熟突变体具有广泛的大田实用性。
通过本发明的技术方案，证明了离子注入对甜菜有明显的诱变效果，并与其它理化诱变效应有明显的区别，达到以下有益效果1、离子注入甜菜种子后出现早熟变异性状，获得早熟亲本创新材料Y系-1，获得早熟亲本基因源，较目前最早熟品种亲本提前15-20天。
2、首次开展了N+离子注入甜菜种子诱变亲本资源材料的研究，并分析研究了离子注的最佳能量、剂量，为作物改良、创新亲本基因源提供了理论依据。
3、甜菜离子注入诱变产生的早熟突变体，不仅在田间有稳定的突变表现，通过RAPD分析证实了在DNA水平上也同样存在差异。表明N+离子注入诱变确实引发了DNA水平上的改变，这种变异是可遗传的。
图1为早熟突变体甜菜的叶片过氧化物酶谱带。
图2为RAPD随机引物筛选扩增条带，图中的1、3、5、7、9为离子注入早熟突变体Y系-1，2、4、6、8、10为对照7201，Mmaker引物顺次为I20 H4L7 T2 P16。
具体实施例方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量百分比。
本发明中涉及到概念简要解释如下RAPDRandom Amplified PolymorphicDNA随机扩增多态性DNA；DNA脱氧核糖核酸；M1为纯合自交系群体自交繁殖第一代；M2为纯合自交系群体自交繁殖第二代。
实施例1离子注入在甜菜育种中的诱变试验一选用本发明人拥有的甜菜优良亲本7201、7201-1多粒种干种子，以能量为35Kev的N+离子对甜菜种子注入，其注入剂量范围为2×1016N+/cm2-7×1016N+/cm2。脉冲次数范围为40-60次，进行破壳和未破壳处理，分别设单、多粒种对照。处理后的种子装入纱布袋。用20℃温水浸种18小时，人工精量点播。生育期观察记载形态变化。收获时测产测糖。并进行同工酶检测。
1材料与方法1.1供试材料每处理3行，行长6米，株行距50×20cm，间比排列。
1.2将M1代种子进行田间观察鉴定。参试材料9份，小区长6米，3行区，株行距50×20厘米，重复三次，随机区组。
1.3将3份M0种子以能量为35Kev的N+进行了二次处理，注入剂量同上，脉冲次数为60次。每份材料4个处理，共12份处理材料，设对照、行长、间距同上，间比排列。
1.4生育期观察记载形态变化，收获时测定产量、含糖率、产糖量。开始每隔10天就地取样测糖，观察动势含糖积累情况。
2.结果与分析通过离子注入对M1代一年生出苗率及叶片生长过程分析得知，N+注入甜菜种子后当代的辐照损伤表现较为明显，种子的萌发受到抑制，目测出苗率明显较对照低。7201-1处理后，随着注入剂量与脉冲次数的增加，除叶片数有减少趋势外，叶长、叶宽、叶片鲜重等性状值都有明显增加。7201处理后，叶片数、叶长、叶片鲜重有明显增加，以叶片鲜重尤为突出，从性状调查结果表明，以注入剂量4×1016和脉冲次数40次或注入剂量6×1016和脉冲次数60次对叶片生长势和生长量促进最大。表明通过离子注入7201、7201-1多粒种和单粒种亲本材料可获得早熟突变体亲本材料，见表1。
表1离子注入对叶部的影响
实施例2离子注入在甜菜育种中的诱变试验二材料与方法1.供试材料为甜菜优良亲本材料为7201和7201-1干种子，以能量分别为20Kev、25Kev、30Kev、35Kev、40Kev、45Kev、50Kev、55Kev、60Kev、65Kev、70Kev不同的N+注入甜菜种子，选用注入分别为2×1016N+/cm2、3×1016N+/cm2、4×1016N+/cm2、5×1016N+/cm2、6×1016N+/cm2、7×1016N+/cm2、8×1016N+/cm2不同的剂量，脉冲次数分别选用为30、35、40、45、50、55、60、65、70次。每处理3行，行长6米，株行距50×20cm，间比排列。
2.将M1代种子进行田间观察鉴定。参试材料9份，小区长6米，3行区，株行距50×20厘米，重复三次，随机区组。
3.将3份7201和7201-1一年生M1种子以能量按上述设定不同的N+进行了二次处理，注入剂量和脉冲次数同上。每份材料4个处理，共12份处理材料，设对照、行长、间距同上，间比排列。
生育期观察记载形态变化，收获时测定产量、含糖率、产糖量。
实验结果分析早熟性是诸多变异中出现次数最多的一种突变。离子注入甜菜种子M1种子收获时，发现Y系-1处理的红眼期较对照和其它材料提前15天左右，为此在其二代M2进行动态含糖积累状况测定，结果表明，Y系-1含糖率在每年的9月4日达到17.3％，之后仍在缓慢上升为17.45％、18.96％，而对照7201含糖率每年的9月4日只有15.6％，每年的9月14日时16.0％，到每年的9月24日才达到17.3％，Y系-1处理的含糖率积累时间较对照提前了20天。但从产量性状看，其最终产量较对照下降28.6％。说明离子注入种子后，会出现电荷，能量、质量的沉积，从而打破有机生物固有的统一平衡。
本试验及相关系列试验表明，通过按照不同的N+离子能量，不同的注入剂量，不同的脉冲次数注入甜菜进行对比分析获得的亲本材料。确定以N+离子的能量为30-60Kev，注入剂量为2×1016N+/CM2-7×1016N+/CM2，脉冲次数为40-60次注入甜菜可明显获得甜菜早熟突变体。
实施例3叶片中过氧化物酶、同工酶和N+注入的关系过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶，它与作物的生长代谢有密切关系，从甜菜叶片的过氧化物酶谱带的分析中，发现N+注入与对照的酶带存在明显差异，参见附图1。从附图1的图谱上看，以字母编号B(单)4×1016、40次，C(单)4×1016、60次，H(多)6×1016、40次，I(多)4×1016、60次，L(多破)4×1016、60次处理均多了2条带，G(多)4×1016、40次，M(多破)6×1016、60次处理多几条带。在单粒种处理中，随着脉冲次数增多，酶的着色逐渐变浅。而在多粒种处理中，随着脉冲次数和注入剂量的增多，酶的着色逐渐变深。无论是单粒种处理或多粒处理，都有双带增加的现象，其糖度和其它性状值都有明显增加。说明N+注入引起植物过氧化物酶同工酶活性发生变化，导致植物体内源激素改变。
实施例4甜菜离子注入诱变早熟突变体的RAPD分子标记筛选材料甜菜离子注入诱变早熟体Y系-1，未经诱变的种质材料7201和7201-1。
方法1.采用本领域熟知的CTAB法作为甜菜RAPD分子标记研究的DNA提取方法。
2.PCR反应采用常规PCR反应程序，终反应体积为25ul，95℃预变性5min，然后94℃变性1min，37℃复性1min，72℃延伸2min，44个循环后，在72℃条件下再延伸5min，达到了PCR扩增。4℃条件下保存备用。
3.电泳及染色电泳条件采用1％琼脂糖凝胶电泳；电压3.5v/cm，溴乙锭染色，在Bio-Rad自动凝胶成像仪上观察扩增结果。
4.统计以0、1为标记，建立EXCEL分子标记数据库，0表示无条带，1表示有条带。
结果分析1.总DNA提取结果的检测采用此方法其主带整齐一致，无降解现象，符合进行RAPD分析。
2.RAPD随机引物筛选以Y系-1和对照7201为材料，采用本发明建立的的甜菜RAPD分子标记技术体系，从800条RAPD引物中筛选出扩增带型有差异且清晰、稳定的45条引物，参见附图2。
参见附图2可以看出离子注入诱变早熟体Y系-1在用引物AL17和BD3扩增的结果有显著的不同，表明Y系-1和7201存在着DNA水平上的差异。
3.带型统计分析利用RAPD引物对实验材料进行“指纹”分析。在相同迁移率位置上，以1、0标记扩增片段的有和无，形成每个材料对应的指纹数码。录入EXCEL数据库并管理，为甜菜分子标记作准备。
结论利用RAPD分子标记扩增Y系-1的DNA，经多次重复，得出RAPD技术在甜菜研究中具有一定的稳定性，可以作为构建连锁遗传图谱的分子标记。
作为一种新的诱变源，离子注入诱变已在多种作物上取得成效。甜菜离子注入诱变产生的早熟突变体Y系-1，不仅在田间有稳定的突变表现，通过RAPD分析证实了在DNA水平上也同样存在差异。表明离子注入诱变确实引发了DNA水平上的改变，这种变异是可遗传的。
在选用的800条引物中，只有45条在Y系-1和7201种表现出多态性，占所选引物的5.6％，这说明离子注入诱变并没有引起诱变体广泛的变异。
权利要求
1.一种甜菜纯合自交系7201亲本材料。
2.一种利用离子注入诱变权利要求1所述的亲本材料获得早熟突变体Y系-1。
3.如权利要求2所述的甜菜早熟突变体Y系-1，其特征在于，以N+离子的能量为30-60Kev，注入剂量为2×1016N+/CM2-7×1016N+/CM2，脉冲次数为40-60次注入甜菜而获得甜菜早熟突变体。
4.如权利要求3所述的甜菜早熟突变体Y系-1，其特征在于，以N+离子的能量优选为35Kev，注入剂量为4×1016N+/CM2，脉冲次数为40次注入甜菜而获得优良甜菜早熟突变体。
5.如权利要求3所述的甜菜早熟突变体Y系-1，其特征在于，以N+离子的能量优选为35Kev，注入剂量为6×1016N+/CM2，脉冲次数为60次注入甜菜而获得优良甜菜早熟突变体。
6.如权利要求4或5任意所述获得的优良早熟突变体亲本材料，其特征在于，通过叶片过氧化物酶同工酶检测，结合品质检测，筛选有突出诱变效果的处理材料，将母根保存，第二年收获的种子分别进行一年生种植，品质检测和处理种子的繁殖保存，筛选具有优异性状的亲本材料，逐步纯化有益变异株系而获得优良早熟突变体亲本材料。
7.一种优良早熟突变体材料的验证技术，其特征在于，以N+离子注入诱变技术获得的甜菜早熟突变体，不仅在田间有稳定的突变表现，通过RAPD分析证实了在DNA水平上也同样存在差异，离子注入诱变甜菜引发了DNA水平上的改变，这种变异是可遗传的。
全文摘要
本发明提供了甜菜纯合自交系7201亲本材料，并公开了一种利用离子注入诱变甜菜7201亲本材料获得早熟突变体，通过离子注入甜菜种子后的田间种植获得早熟突变体亲本材料，不仅在田间有稳定的突变表现，通过RAPD分析验证了在DNA水平存在差异，离子注入诱变甜菜确实引发了DNA水平上的改变。本发明具体通过在甜菜作物上开展离子注入诱变，探索了离子注入甜菜种子的最佳能量和最佳剂量对杂交种、亲本材料的影响，获得优良甜菜早熟突变体，为甜菜产区合理布局急需工艺早熟性品种提供了珍贵的基因源亲本，也为选育甜菜新品种、创新亲本材料资源开辟了一条新途径。
文档编号C12N13/00GK101092615SQ20071010338
公开日2007年12月26日 申请日期2007年5月19日 优先权日2007年5月19日
发明者王燕飞, 曾宪贤, 符子华, 刘华君, 沙红, 张立明, 曲延英, 高卫时, 刘军, 高文伟, 杨洪泽, 白晓山 申请人:新疆农业科学院经济作物研究所