专利名称：一种紫杉木霉菌株及其在制备木霉菌酯素中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体地说是一种以南方红豆杉内生真菌紫杉木 霉菌株，及其在制备木霉菌酯素中的用途。
技术背景从天然产物中发现新型先导化合物，是新药创制的重要途径。微生物是 自然界中天然产物的主要来源，植物内生真菌作为其中的一个重要类群，是 相对较新的研究领域。内生真菌产生的丰富多样的具多种生物活性的次生代 谢产物在现代医药和农药工业中具有重要的应用潜力，它们在抗菌、抗病毒、 杀虫、抗肿瘤、抗心血管疾病以及抗衰老等领域具有广阔的应用前景。典型例子是产生紫杉醇的内生真菌的发现(Stierleefa/.， 1993)。另一方面从植物 内生真菌也发现了许多新生物活性物质，如从传统药用植物雷公藤分离到的 内生真菌尺/7/y oc/acf/'e//asp.可产生3种新松胞菌素(cytochalasin)，对多种 人肿瘤细胞有很强的抑制作用(Wagenaarefa/,2000);从青蒿茎干中分离 的内生真菌Co//etoWc/7i/A7 sp.能产生多种对病原真菌和植物病原细菌有良好 抑制作用的化合物，其MIC值一般在25~50 |jg/L (Lu ef a/., 2000)。 发明内容本发明需要解决的技术问题是，提供一种新的菌株一一紫杉木霉 (7>Vc/70cfem7a fax//)菌株，及其在制备具有抗肿瘤抗真菌活性的木霉菌酯素 (Trichodermisin)中的用途。本发明的紫杉木霉(77yc/ octem7a fax/7)菌株，保藏号CGMCC 1672; 在PDA固体培养基上20。C 72小时菌落直径37 mm, 25。C时55 mm， 30。C时 71mm， 35。C时不生长；在PDA上的最适温度为30。C; 25。C光暗培养7 14 天，PDA、 MEA菌落边缘形成大量白色疱状突起，疱状突起可愈合；瓶梗在
疱状突起中的分生孢子梗上密集轮生，瓶梗安瓿形，顶部明显变细；分生孢 子无色，光滑，椭圆形，1.7-2.0 (1.9)X2.2-2.5 (2.3) |jm。本发明的菌株是从南方红豆杉分离得到的，它属于真菌界(Fungi)，子 囊菌门(Ascomycota )，粪壳菌纲(Sordariomycetes ), 肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)，有丝分裂真菌肉座菌目(mitosporic Hypocreales)，木霉属(7"厂/c/7ocfem a)。本发明的菌株在制备木霉菌酯素中的用途，其特征在于以人工发酵生 产的紫杉木霉的发酵液为原料，浓縮发酵液用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸 乙酯，得到化合物木霉菌酯素。本发明提供了一种新的紫杉木霉菌株，以该菌株制备的新化合物木霉菌 酯素具有抗肿瘤抗真菌活性，为进一步开发新的抗真菌药物提供了天然药物 化学研究基础。
图1之A-D为本发明的紫杉木霉菌株的形态特征照片，其中A为MEA 菌落形态；B为PDA菌落形态；C为分生孢子梗和瓶梗；D为分生孢子。
具体实施方式
实施例1、紫杉木霉(7 ycA OGfem7a fax/7)菌株的分离培养 在实验室中按下列条件分离培养，即可获得本发明所述的紫杉木霉菌株。 从我国江西官山自然保护区采集南方红豆杉(raxwsma/re/)树皮及树枝，将 采集的南方红豆杉的树皮及树枝在5%次氯酸钠表面消毒2min，无菌水漂洗 后置于无菌滤纸上吸干水，用无菌刀片去除外皮层，并将其切成1cm左右大 小组织片，将组织片移接在2%含100pg ，m^氨苄青霉素和链霉素的水琼脂 平板上，24'C培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA固体培养基上， 连续重复纯化3次，获得纯培养。紫杉木霉菌株的形态特征见图1。 经测定，该菌株具有特异性序列如下TCGCGGGGAGGATGAGGACAAGCCCAGTAGGGT丌TCCCTTGTT AGGAGTGTCACTGGTGACCCTGCGCTCGACGGCTCTTTTTCGCGGAG AACAGTTGCCTACATGTCATAGGAATGTGTTAGCGTTTTGAAACATTTC AGGATAAATGGGAATAATAAAAGGAGAATTGAAGAGAAGTGGGCAGATA ATCAAGTGTCATGAAAATGGATATGAGGTGAGATGGTGGCAAATGAAG CTGCAGCGAGAAAACATACACCACCATTCGTTCCCATGCCAAAGGCCC 丌GAGTCGCCTC丌CTCCGTCGACGGCGTGCCTGGGTAAAAATCCTG GTAGCGATTCCTGGAAGGGGTCGCCATCGCCATGGTAAATGTGCGAA GCTCCAGTATTTCGTAAACTGAGGTTTG丌TCTGTTCCTGAACTTCCTA GAGTATGGCTTGGATCCAAGTCTTCCAGTAGCTCAACGGCGC。实施例2 、化合物木霉菌酯素的分离提取木霉菌菌株ZJUF0986发酵培养，浓縮发酵液用乙酸乙酯萃取，减压回 收乙酸乙酯，得到化合物木霉菌酯素，该化合物为黄褐色液体。经测定，其 结构式为，EIMS确定分子量292，m/z(rel.int): (292[M+]，40)，277(75)，149 (25)， 107 (50), 91 (48), 43(100);红外光谱(KBr)确定具有C=0(1735 cm-1), C-O画C (1220,1080 cm—1) and C=C (977cm'1 );采用高分辨核磁共振仪(500MHz)测 定了该化合物的1H-NMR、 13C-NMR、 H-HCOSY、 HMBC、 HMQC、 DEPT (135)等二维相关谱,确定了化合物所有碳原子和氢原子的信号归属。 新化合物木霉菌酯素的核磁共振图谱数据为
No.1H-NMR13C-NMR1H-1HCOSY15.4175.12-140.335.57118.64-CH21.43d，1.93d,24.553.61d70.5H4a6-40.57-CH22.53m， 1.94m36.783.83d79.19-CH22,83d，3.12d47.910-65.611-CH21.96m28.012-CH30.72s5.9113-CH31.71s14.29Hi14-CH32.06s21.115-CH32.00s21.216-CH30.93s19.217-CH24.14dd60.518-171.119CH31.27m16.0新化合物木霉菌酯素的抗菌生物测定马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA):马铃薯200g，葡 萄糖20g,琼脂20g,水1000ml 。以植物病原真菌立枯丝核菌(尺/7/zoctoA /aso/aA7/')、灰葡萄孢(8ofAyf/'s c/'nerea)及根霉(R/ /zopus sp.)为指示菌株，采用生长速率法测定新化合 物木霉菌酯素对指示菌的抑制作用。将木霉菌酯素配成不同浓度的药液按一 定量分别加入到预先溶化的一定量的PDA固体培养基中，混匀制成一定浓度 的带毒培养基，将带毒培养基倒入直径9 mm的培养皿中制成平板，同时用 无毒培养基作对照，各种浓度和对照重复3次。用打孔器打出菌丝块放在平 板中央。在24'C培养至菌丝生长接近培养皿边缘时测定菌落直径，每个菌落 十字交叉测量2次，计算出每种处理菌落平均直径。按公式计算药剂对菌丝 生长的相对抑制率，采用剂量对数-抑制率机率值法计算求得半抑制浓度 (IC50)。
生长速率法测定表明，化合物木霉菌酯素对立枯丝核菌的半抑制浓度IC50 为1.1ljg/ml，对灰葡萄孢的IC5o为2.0ijg/ml，对根霉的1〇50为17.1 |jg/ml。新化合物木霉菌酯素的抗肿瘤生物测定以对卤虫(/\ntem/'a sa//>7a)的细胞毒试验测定新化合物木霉菌酯素的抗 肿瘤活性。卤虫卵在pH 8.5的人工海水中28°C培养孵化24hr。将人工海水 以1:1的比例与系列浓度的木霉菌酯素溶液混合加入到试管中，每处理3个 重复，同时以蒸馏水、鬼臼毒素分别作为空白对照和阳性对照。在每个试管 中加入10只正常的卤虫，培养24hr后观察及记录各处理的卤虫死亡数，计 算校正死亡率，采用剂量对数-死亡率机率值法计算求得半抑制浓度(LC50)。细胞毒试验测定表明，化合物木霉菌酯素对卤虫的LCw为1.3 |jg/ml。
权利要求
1、一种紫杉木霉菌株，保藏号CGMCC1672；在PDA固体培养基上20℃72小时菌落直径37mm，25℃时55mm，30℃时71mm，35℃时不生长；在PDA上的最适温度为30℃；25℃光暗培养7～14天，PDA、MEA菌落边缘形成大量白色疱状突起，疱状突起可愈合；瓶梗在疱状突起中的分生孢子梗上密集轮生，瓶梗安瓿形，顶部明显变细；分生孢子无色，光滑，椭圆形，1.7-2.0(1.9)×2.2-2.5(2.3)μm。
2、 根据权利要求1所述的紫杉木霉菌株，其特征在于该菌株具有特异性序列如下TCGCGGGGAGGATGAGGACAAGCCCAGTAGGGTTTTCCCTTGTT AGGAGTGTCACTGGTGACCCTGCGCTCGACGGCTCTTTTTCGCGGAG AACAG丌GCCTACATGTCATAGGAATGTGTTAGCGTTTTGAAACATTTC AGGATAAATGGGAATAATAAAAGGAGAATTGAAGAGAAGTGGGCAGATA ATCAAGTGTCATGAAAATGGATATGAGGTGAGATGGTGGCAAATGAAG CTGCAGCGAGAAAACATACACCACCATTCGTTCCCATGCCAAAGGCCC TTGAGTCGCCTCTTCTCCGTCGACGGCGTGCCTGGGTAAAAATCCTG GTAGCGATTCCTGGAAGGGGTCGCCATCGCCATGGTAAATGTGCGAA GCTCCAGTATTTCGTAAACTGAGGTTTGTTTCTGTTCCTGAACTTCCTA GAGTATGGCTTGGATCCAAGTC丌CCAGTAGCTCAACGGCGC。
3、 一种以权利要求1或2所述的紫杉木霉菌株在制备木霉菌酯素中的用途，其特征在于以人工发酵生产的紫杉木霉的发酵液为原料，浓縮发酵液 用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，得到化合物木霉菌酯素； 所述的化合物木霉菌酯素，具有以下结构-<formula>formula see original document page 2</formula>
全文摘要
本发明涉及一种以南方红豆杉内生真菌紫杉木霉菌株，及其在制备木霉菌酯素中的用途。木霉菌酯素具有抗肿瘤抗真菌活性，为进一步开发新的抗真菌药物提供了天然药物化学研究基础。本发明菌株，保藏号CGMCC1672；25℃光暗培养7～14天，PDA、MEA菌落边缘形成大量白色疱状突起，疱状突起可愈合；瓶梗在疱状突起中的分生孢子梗上密集轮生，瓶梗安瓿形，顶部明显变细；分生孢子无色，光滑，椭圆形，1.7-2.0(1.9)×2.2-2.5(2.3)μm。
文档编号C12R1/885GK101113414SQ20071010625
公开日2008年1月30日 申请日期2007年5月14日 优先权日2006年5月19日
发明者林福星, 章初龙, 陈绍瑗 申请人:建德市大洋化工有限公司