专利名称：癌转移检测方法及其设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌转移的检测方法及设备。
背景技术：
为了检查特定组织的癌转移，现在人们纷纷进行使用多重环介导恒温扩增反应(LAMP法，loop-mediated isothermal amplification method)和聚合酶链反应(PCR法，polymerase chain reaction)等检查癌分子的研究。分子检查可以通过检测组织和细胞等所含癌标志物(比如在癌细胞特异表达的蛋白质的mRNA等)进行。比如，作为判断乳腺癌的淋巴结转移的癌标志物(以下也简称为标志)，众所周知，角蛋白19(CK19)和癌胚抗原(CEA)的mRNA是有用的。正常淋巴结上的癌标志物的表达量和转移到淋巴结的乳腺癌细胞上的癌标志物的表达量不同而有意义。
用于判断癌转移的标本可以通过生检等方法采集，根据标本不同，所含细胞数也不同。用分子检查法判断癌转移时，使用含大小不均的组织的标本或含不同细胞数量的标本，检出该标本中的癌标志物。
过去癌转移的判断是采取以下方法测定标本中的癌标志物的量；对测定出的癌标志物的量进行标准化处理；将标准化的癌标志物的量与所定阈值进行比较；然后，用此比较结果判断癌转移。
标准化比如可用管家基因的表达量除以标本中的癌标志物的量来进行(如Inokuchi et al.，British Journal of Cancer(2003)89，1750-1756)，一般认为管家基因不受细胞种类限制，任何种类的细胞其表达量几乎一定。以此可以算出相对于管家基因的1个表达产物分子，癌标志物表达多少。因此，不论标本中所含细胞数有多少，都可以将标准化的癌标志物的值与特定阈值和其他标本的标准化癌标志物的值作比较。
发明内容
过去的检测方法是以标本中所含细胞均一(作为分析对象的标本其所含所有细胞实际上为同一种细胞)为前提的。比如试样中的细胞几乎均为癌细胞时，可视为属均一。
但是，实际上从生物采集的标本往往不仅含癌细胞，还含正常细胞。因此，本发明者选择了有时进行癌标志物表达量的标准化不能正确判断癌转移的课题，并开发了解决此课题、能将错误判断控制在最小的方法和装置，完成了本发明。
本发明提供含以下步骤的癌转移检测方法测定采自生物的组织或细胞中的癌标志物的绝对量的测定步骤；以及通过对比所述测定出的绝对量和预设阈值，判断癌是否向所述组织或所述细胞所属组织转移的判断步骤。
本发明还提供一种癌转移的检测方法，其包括如下步骤测定反映采自生物的组织或细胞中的癌标志物绝对量的信息的测定步骤；以及通过将测定出的反映所述绝对量的信息与预设阈值进行比较，而无需用所述癌标志物以外分子的绝对量进行标准化处理，判断癌是否向所述组织或所述细胞所属组织转移的判断步骤。
其中所述组织为淋巴结组织。
其中所述癌标志物用测定用试样进行测定，该测定用试样是在所述组织或细胞中添加处理液，让所述组织或细胞所含癌标志物移至溶液中制备的，而不进行核酸抽取处理。
其中所述处理液含二甲亚砜。
其中所述的测定采用核酸扩增法。
其中所述癌标志物为mRNA，特别是指角蛋白mRNA。
其中所述癌选自乳腺癌、胃癌、食道癌、大肠癌和前列腺癌。
本发明同时提供一种癌转移检测设备，包括测定采自生物的组织或细胞中的癌标志物的绝对量的测定系统；以及通过对比所述测定出的绝对量和预设阈值，判断癌是否向所述组织或所述细胞所属组织转移的判断系统。
图1为本发明一个实施方式的判断设备整体结构的斜视图。
图2为图1所示判断设备的作为测定系统的核酸扩增测定装置的整体结构斜视图。
图3为图2核酸扩增测定装置的平面略图。
图4为本发明一个实施方式的判断设备中作为判断系统计算机的CPU判断癌转移的流程图。
图5为显示实施例1算出的乳腺癌淋巴结组织中的CK19mRNA拷贝数的附图。
图6为比较例1算出的乳腺癌淋巴结组织中的CK19mRNA标准化值的附图。
图7为显示实施例2测定的大肠癌淋巴结组织中的CK19mRNA拷贝数的附图。
图8为显示实施例3算出的胃癌淋巴结组织中的CK19mRNA拷贝数的附图。
图9为显示实施例4算出的乳腺癌淋巴结组织中的CK19mRNA拷贝数的附图。
图10为显示实施例5算出的大肠癌淋巴结组织中的CK19mRNA拷贝数的附图。
图11为显示实施例6算出的胃癌淋巴结组织中的CK19mRNA拷贝数的附图。
具体实施例方式在本实施方式的癌转移判断中，使用含从生物体采集的组织或细胞的试样作为标本，比如淋巴结组织、血液、尿液、灌肠所得清洗液及其浓缩液等。
用本实施方式可以检出所述组织的癌转移。当使用含细胞的试样作为标本时，可以判断该细胞所属组织的癌转移。比如，当以灌肠所得清洗液为标本时，因为该清洗液中含有从胃中清洗脱落下来的细胞，故可以检出癌的胃转移。
在此，所谓“检出癌转移”包括定性地判断有无癌转移、半定量地判断癌转移程度(如判断阴性、阳性或强阳性)以及定量地判断癌转移程度(如判断转移的大小、转移的癌细胞数)等。本实施方式可以提供这些检出结果作为有关癌转移的信息。
本说明书中的“癌标志物”指在癌细胞的表达量比在正常细胞的表达量多且有意义的分子。在本实施方式中，癌标志物比如有核酸和蛋白质等，癌标志物以mRNA、DNA等核酸为宜，最好是mRNA。
作为癌标志物的种类，比如有CK18、CK19、CK20等角蛋白(CK)mRNA、癌胚抗原(CEA)mRNA、MUC1粘朊mRNA和乳腺球蛋白(MMG)mRNA。所述癌标志物以角蛋白(CK)mRNA为宜，最好是CK19mRNA。
本实施方式是测定癌标志物的绝对量。在本说明书中，所谓“癌标志物的绝对量”意味着仅根据癌标志物的量计算出的值，不考虑测定中根据其他因素、比如组织或细胞的量计算出的值。即，对此值不用所述管家基因等进行标准化处理。作为癌标志物的绝对量有癌标志物的浓度、分子数(拷贝数)等。在本说明书中，癌标志物的绝对量包含“与癌标志物绝对量相关的信息”。
所谓“与癌标志物绝对量相关的信息”指仅根据癌标志物绝对量而变化的值，可以是针对以下例示的癌标志物测定方法的各种值。比如，可以是反应液的荧光强度、浊度和吸光度，也可以是这些值达到一定值所需的时间或PCR周期数。
以下，在本说明书中有时称癌标志物的绝对量为癌标志物的“测定值”。另，有时将获取癌标志物的绝对量称为“测定癌标志物”。
根据本实施方式的方法，最好用经处理液处理所述组织或细胞而制备的测定用试样测定癌标志物。该处理液最好含有二甲亚砜(DMSO)。用核酸扩增法测定癌标志物时，靠DMSO的作用，可以减少试样中所含阻碍物质对核酸扩增反应的阻碍。经对组织或细胞如此处理，可将细胞或细胞中所含癌标志物移到溶液中。
含所述DMSO的处理液以DMSO含量占处理液的5～30％体积为宜，占10～25％体积更好。
处理液也可添加缓冲剂和表面活性剂等。
处理液的pH以2.5～5.0为宜。为了使pH保持在2.5～5.0，比如可以添加甘氨酸-盐酸缓冲剂等缓冲液。
所述表面活性剂只要是该领域中通常使用的表面活性剂即可，无特别限定，以非离子型表面活性剂为宜，最好是聚氧乙烯类非离子型表面活性剂。特别是如下通式表示的聚氧乙烯类非离子型表面活性剂更适合。
R1-R2-(CH2CH2O)n-H(在此，R1是碳原子数10～22的烷基、链烯基、炔基或异辛基；R2是-O-或-(C6H4)-O-；n为8～120的整数。)作为表面活性剂可举例如下聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鲸蜡醚、聚氧乙烯油酯醚、聚氧乙烯肉豆蔻醚、聚氧乙烯硬脂醚、聚氧乙烯壬基苯酚醚和聚氧乙烯异辛苯酚醚等。其中尤以BRij35(聚氧乙烯(35)月桂醚)为宜。表面活性剂的浓度是该领域一般使用的即可，无特别限定。以处理液的0.1～6容量％为宜，1～5容量％更好。
所述表面活性剂具有破损细胞膜、溶解组织或细胞的作用。使用含有这种表面活性剂的处理液，可以有效地将存在于细胞膜内的癌标志物移至溶液中。
通过使用所述处理液，不必进行使用市面上销售的纯化试剂盒等一般要进行的核酸抽取和纯化，即可便捷地制备测定用试样。
所述处理液与组织或细胞的混合比例无特别限定。使用组织时，可以在1MG组织中添加0.0001～0.005ML左右的处理液加以混合。
以处理液和组织或细胞混合后再破碎组织或细胞为宜。破碎的方法比如可以用均化器均化或用超声波破碎机破碎等。作为均化器，用在该领域常用的即可，比如韦林氏搅切器、Potter-Elvehjem型均化器、Polytron型均化器和杜恩斯均化器等。也可以用杵手动均化。
用所述方法破碎的破碎液可以通过离心分离、过滤、柱层析等通常的提纯方法进行初提炼。根据检出的癌标志物的种类，也可通过众所周知的核酸抽取法再提纯。
本实施方式可以通过对组织或细胞进行所述处理和提纯等，制备测定用试样。
本实施方式可以按照在该领域常用的方法测定癌标志物。
如果癌标志物是蛋白质，则可以用诸如免疫印迹法、放射免疫分析法、酶免疫分析法以及专利公开2003-130871号上记载的方法等传统的方法测定癌标志物。
如果癌标志物是核酸，则最好采用环介导等温扩增法(LAMP)和聚合酶链反应(PCR)等核酸扩增法。若癌标志物为mRNA则可以使用在核酸扩增反应前含逆转录反应的核酸扩增法(如RT-PCR法、RT-LAMP法等)。当癌标志物为mRNA时，具体而言，在所述测定用试样中添加引物、RNA依赖型DNA聚合酶(逆转录酶)和DNA依赖型DNA聚合酶(以下也称为DNA聚合酶)等制备反应液，进行核酸扩增。
逆转录反应和核酸扩增反应可根据与铸模标记物相对应的CDNA序列和聚合酶序列适当改变条件。关于逆转录反应和核酸扩增反应的条件，比如Sambrook，J.et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual (2nded.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York上有记载。
作为检测癌标志物的引物，只要是可以扩增与癌标志物相应的CDNA的多核甙酸即可，其序列无特别限定。引物的长度可以是5～100核甙酸，5～50核甙酸更好。引物可以用在该技术中周知的核酸合成方法制造。
逆转录酶和DNA聚合酶可以使用在该技术领域周知的物质。作为逆转录酶比如可以使用禽成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus)由来的逆转录酶和莫洛尼鼠类白血病病毒(Molony Murine Leukemia Virus)由来的逆转录酶等。作为DNA聚合酶可以使用Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶等。
通过测定所述核酸扩增生成的核酸扩增产物，可以取得关于癌标志物绝对量的信息。从而得以测定癌标志物。当癌标志物为mRNA时，最好采用Quantitative Reverse Transcription-PCR(QRT-PCR)和Quantitative ReverseTranscription-LAMP(QRT-LAMP)等。采用这些方法，随着由mRNA逆转录的cDNA的扩增，反应液的光学状态(浊度、吸光度、荧光强度等)会发生变化。因此，反应液的光学状态作为关于癌标志物绝对量的信息被实时测定，用于癌转移的判断。
作为QRT-PCR的具体例子可以使用众所周知的方法，比如嵌合荧光法(SYBR Green法预先在核酸扩增反应前的反应液中添加SYBRGreen，实时测定扩增反应中随着cDNA的扩增而增强的荧光强度的方法)和Taqman(罗氏诊断产品公司Roche Diagnostics注册商标)探针法。
癌标志物的测定值可以根据反应液的荧光强度达到一定值时所需要的循环数计算出来。试样中的癌标志物越多，反应液的荧光强度达到一定值所需循环数越少。试样中的癌标志物越多，反应液的荧光强度达到一定值所需循环数越多。
根据反应液的荧光强度达到一定值所需时间，计算出试样中的癌标志物拷贝数，并将其与该癌标志物拷贝数相对应的阈值进行比较，根据比较结果诊断癌转移。
也可以不计算拷贝数，通过比较反应液荧光强度达到一定值所需时间和与之对应的阈值，诊断癌转移。
如果使用QRT-LAMP，则随着cDNA的扩增，作为副产品生成大量焦磷酸镁。此焦磷酸镁为非溶性，反应液会随焦磷酸镁的增加而变浊。因此，通过实时对反应液的浊度(或吸光度)进行光学测定即可测定癌标志物。另外，在QRT-LAMP中也可使用所述SYBR Green。
癌标志物的测定值可以根据反应液的浊度、吸光度、荧光强度等达到一定值所需时间(检测时间)计算出来。试样中的癌标志物越多，检测时间越短。试样中的癌标志物越少，检测时间越长。
可以根据检测时间算出试样中的癌标志物拷贝数，将其与阈值比较，根据比较结果即可判断癌转移。
也可以不计算拷贝数，通过比较检测时间和与之对应的阈值，诊断癌转移。
过去的癌转移分子检查是根据将癌标志物测定值标准化后所得的值判断癌转移的。
在分子检查中，如果标本中实际上只含癌细胞，则假设管家基因任何细胞都表达一定量，此时进行标准化也能正确判断癌转移。然而，如果标本中包含正常细胞，则进行标准化后含有正常细胞越多的标本，管家基因的表达量越大，因此癌转移的可能性会被忽视。
比如，比较含有大量正常细胞的标本A(癌标志物绝对量为1，管家基因的表达量为1000)和正常细胞比标本A含量少的标本B(癌标志物绝对量为1，管家基因的表达量为10)时，进行标准化，则算出标本A的癌标志物为1/1000，标本B的癌标志物为1/10。尽管标本A和标本B所含癌标志物等量，进行标准化后正常细胞多的标本A判断为癌转移可能性低。但是，如本实施方式这样不进行标准化做出判断，则因标本A与标本B癌标志物等量而关于标本A和标本B癌转移的判断结果也一样。
过去通过镜检组织切片的组织诊断只能检查组织的一部分，一旦在不含癌细胞的部位切片的话，有可能漏过癌细胞。另一方面，通过分子检查判断癌转移能够使用从生物体采集的全部标本(或制作切片剩余的标本)，因此，与仅凭部分截面检查的组织诊断不同，漏诊的可能较小。
在本实施方式中，标本的管家基因的mRNA测定值不用标准化，但是可以作为判断核酸扩增反应是否正确进行的对照物使用。管家基因在几乎各种细胞中均有表达，因此，如果检测出管家基因的mRNA，就可认为癌标志物的核酸扩增反应也适当发生。另一方面，若没有检测出管家基因的mRNA，则认为核酸扩增反应没有正确发生，怀疑其起因于酶失去活性等。
作为管家基因，可以例如β-肌动朊、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、β2微球蛋白和次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)等基因。
在本实施方式中，所述阈值可根据癌标志物和核酸扩增法的种类适当设定。该阈值比如既可以低于确认癌转移的组织或细胞(阳性标本)所含癌标志物的测定值，也可以设定得比确认没有癌转移的组织或细胞(阴性标本)所含癌标志物的测定值高。
最好将数个阳性标本的癌标志物测定值和多个阴性标本的癌标志物测定值进行比较，以能够概率最高地区分阳性标本和阴性标本的值作为阈值。比如，用QRT-PCR法检测乳腺癌转移时，阈值设为230～260个拷贝数，检测胃癌转移时阈值设为8～690个拷贝数，检测大肠癌转移时阈值设为79～180个拷贝数。用QRT-LAMP法检测检测乳腺癌转移时，阈值设为86～360个拷贝数，检测胃癌转移时阈值设为10～270个拷贝数，检测肠癌转移时阈值设为170～640个拷贝数。
在本实施方式中，根据癌标志物的绝对值与阈值的比较结果判断癌向组织或细胞的转移。即，当癌标志物的绝对值比阈值高时可以断定转移为阳性，当癌标志物的绝对值比阈值低时则断定转移为阴性。通过取得这种判断结果即可作为手术方式、切除范围和术后治疗方针等的决定指标。
本实施方式对癌的种类无特别限定，比如可以是乳腺癌、胃癌、食道癌、大肠癌和前列腺癌等。
本实施方式的癌转移判断通过仪器进行。
此仪器包括一个测定装置，用于获取关于癌标志物绝对量的信息；一台计算机，用于对比所述绝对量和预设阈值，判断癌的组织转移。
对于测定装置无特别限定，只要能获得关于癌标志物绝对量的信息即可。但以能以RT-LAMP法和RT-PCR法测定扩增核酸的核酸扩增装置为宜。核酸扩增装置具有测定核酸扩增产物的测定单元，该核酸扩增产物是用引物和酶扩增从生物采集的组织或细胞中的癌标志物而获得的。
计算机用于根据测定单元获得的数据计算出癌标志物绝对量，将其与预设阈值比较，从而检测出癌的转移。此设备也可具备输出癌转移检测结果的显示单元。
本发明的设备的一个实施方式如图1～3所示。图1为本实施方式的设备的整体结构斜视图。图2为图1所示作为测定系统的核酸扩增装置的整体结构斜视图。图3为图2所示核酸扩增装置的平面略图。
本发明某实施方式的设备如图1所示，由核酸扩增装置101和与该核酸扩增装置连接能进行有线或无线通信、作为分析手段的计算机(PC)102组成。
核酸扩增装置101如图2所示，包括分装机构10、上样单元20、吸嘴安装单元30、吸嘴废弃单元40、由5个反应检测块50a构成的反应检测单元50和用于向X方向和Y方向移送分装设备的移送器60。
分装机构10如图2所示，包括被移送器60向X方向和Y方向(水平方向)移动的旋臂11和与旋臂11相对可各自独立地向Z方向(垂直方向)移动的一对(二支)注射器12。
如图2和图3所示，上样单元20从装置眼前开始依次有10个试样管插孔21a～21j、一个酶试剂容器孔21k和一个引物试剂容器孔21L。10个试样管插孔21a～21j分5行2列排列。试样管插孔21C和21d、试样管插孔21e和21f、试样管插孔21G和21H、试样管插孔21i和21j分别从装置里面向外依次置于试样放置位置1、试样放置位置2、试样放置位置3和试样放置位置4。
本实施方式中，正面左侧的试样管插孔21C、21e、21G和21i插有经预处理(匀质化、过滤等)生物组织(淋巴结)切片制作的可溶解抽取液(测定用试样)的试样管22，正面右侧的试样管插孔21d、21f、21H和21j插装有所述试样稀释到10倍的稀释试样的试样管23。
试样管插孔21a用于放置装阳性对照物的容器24，该阳性对照物用于确认应该扩增的核酸是否正常扩增；而试样管插孔21b用于放置装有阴性对照物的容器25，该阴性对照物用于确认不该扩增的核酸是否正常未扩增。
酶容器插孔21k和试剂容器插孔21L分别放置装有用于扩增对应于CK19 mRNA的cDNA(以下也称CK19CDNA)的核酸扩增酶试剂的酶试剂容器26和装有CK19的引物试剂的引物试剂容器27。
反应检测单元50的各反应检测块50a如图2和图3所示，由反应部51、二个浊度检测部52和闭合机构53(参照图2)构成。设置于各反应检测块50a的反应部51如图3所示，设置有二个用于放置检测池54的检测池孔51a。各反应检测块50a从装置里侧向外依次排列于池位1、池位2、池位3、池位4和池位5。
浊度检测部52由置于反应部51一侧基板55a上的由有465nm波长的兰色发光二极管组成的发光二极管光源部52a和配置于反应部51另一侧基板55b上的光电二极管集光部52b构成。各反应检测块50a分别配置了由一个发光二极管光源部52a和一个光电二极管集光部52b为一组的浊度检测部52各二组。
检测池54有装试样的2个试样池54a和盖2个试样池54a的2个盖子54b。
移送器60如图2所示，有向Y方向移送分装机构10的直行向导61和球型螺杆62、驱动球型螺杆62的步进电动机63、向X方向移送分装机构10的直行向导64和球型螺杆65、驱动球型螺杆65的步进电动机66。向X方向和Y方向移送分装机构10是靠步进电动机63和步进电动机66分别转动球型螺杆62和65实现的。
计算机102如图1所示有输入设备键盘102a和鼠标102b、由监视器组成的显示器102c以及分析试样测定结果的CPU102d。
下面，参照图1～图3说明本实施方式中判断设备的运行过程。此实施方式如上所述，从癌手术中切除的淋巴结组织中的癌标志物mRNA合成cDNA，通过RT-LAMP法扩增cDNA。反应液因随着扩增而产生的焦磷酸镁而变浊，由于浊度上升，通过测定反应液的浊度变化即可测定癌标志物数量。将此测定结果与阈值比较，判断癌的淋巴结转移。
首先如图2和图3所示，将对从生物切除的组织进行预处理(匀质化、过滤等)后溶解的液体(以下称试样)装入试样容器22，将试样容器22插入试样管插孔21C～21j。将装有阳性对照物的容器24和装有阴性对照物的容器25分别插入试样管孔21a和21b(参照图3)。在酶试剂容器孔21k(参照图3)和引物试剂容器孔21L分别放入装有CK19CDNA扩增用核酸扩增酶试剂的酶试剂容器26和装有CK19CDNA扩增用引物试剂的引物试剂容器27。吸嘴安装单元30设置2个各自收纳有36个使用后丢弃的吸移管吸嘴31的托盘32。
核酸扩增装置101一启动，首先，分装机构10被图2所示移送器60从初始位置移到吸嘴安装单元30后，分装机构10的二个注射器12在吸嘴安装单元30向下移动。于是，二个注射器12的顶端插入二个吸移管吸嘴31的上部开口处，从而自动装上吸移管吸嘴31。当二个注射器12向上移动之后，分装机构10的旋臂11向X方向移动，移向装有CK19引物试剂的引物试剂容器27的上方。位于引物试剂容器27上方的一个注射器12向下移动，吸移引物试剂后向上移动。分装机构10的旋臂11被移送器60向Y方向移动，使另一个注射器12同样位于引物试剂容器27的上方。然后另一个注射器12向下移动，同样从引物试剂容器27吸移引物试剂后向上移动。如此，引物试剂容器27内的CK19引物试剂被安装在注射器12上的二个吸移管吸嘴31吸移。
引物试剂吸移后，二个注射器12都移向上方后，分装机构10的旋臂11被移送器60移向位于最里面(正对装置的里侧)池位1的反应检测块50a上方。在最里面的反应检测块50a，二个注射器12向下移动，使装在二个注射器12的二个吸移管吸嘴31分别插入检测池54的二个池54a中，再用注射器12将引物试剂吐到二个池54a中。
引物试剂吐出后，二个注射器12向上移动，分装机构10的旋臂11被移送器60向X方向移动，移到吸嘴废弃单元40的上方。在吸嘴废弃单元40的上方，吸移管吸嘴31被丢弃。具体而言，二个注射器12向下移动，使吸移管吸嘴31插入吸嘴废弃单元40的二个吸嘴废弃孔40a(参照图3)。在此状态下，分装机构10的旋臂11被移送器60向Y方向移动，使吸移管吸嘴31移到槽40b下面，然后向上移动二个注射器12，吸移管吸嘴31上部的缘卡在槽40b下面，受到向下的力，从而吸移管吸嘴31自动脱离二个注射器12的嘴部，这样，吸移管吸嘴31就被丢弃在吸嘴废弃单元40。
接下来，以同样的动作酶试剂从酶试剂容器26吐到所述池54a，再以同样的动作将试样从试样容器22和试样容器23吐到所述池54a。
引物试剂、酶试剂和试样向所述池54a的吸移动作完成后，检测池54的盖子54b闭合。当此闭合动作完成后，将检测池54内的液温从约20℃加温到约65℃，通过RT-LAMP反应从癌标志物(mRNA)合成cDNA，再对合成的cDNA进行扩增。随着cDNA的扩增，生成焦磷酸镁，反应液变浊。用图3所示发光二极管光源部52a和光电二极管集光部52b检测(监测)扩增反应过程中检测池54内的浊度。
试样的浊度数据从核酸扩增装置101实时传送到计算机102。计算机102的CPU102d实时接收浊度数据，测定浊度达到一定值时所需时间(检测时间)。根据测定的检测时间计算出试样中所含癌标志物的拷贝数，与预先设定的阈值比较，判断癌转移。
下面，参照图4就计算机102的CPU102d处理过程进行说明。
步骤S1，CPU102d从核酸扩增装置101接收反应液的浊度数据。
步骤S2，CPU102d从接收到的浊度数据测定检测时间，根据此检测时间计算出癌标志物的拷贝数，比较此拷贝数和预设阈值。根据比较结果判断癌转移为阳性还是为阴性。具体地说，拷贝数超过一定阈值时，判断为癌转移阳性，未达到一定阈值时，判断为癌转移阴性。
步骤S3，CPU102d将步骤S2的判断结果输送到显示单元102c。
在所述实施方式中，核酸扩增装置101负责测定反应液的浊度数据和将测得的浊度数据传送至计算机102，计算机102则负责计算出癌标志物的拷贝数，比较拷贝数，判断癌转移。
但是也可以由核酸扩增装置101负责测定反应液的浊度数据、计算出癌标志物的拷贝数、将计算出的拷贝数传送至计算机102，而由计算机102负责比较拷贝数，判断癌转移。
实施例例1用QRT-PCR法诊断乳腺癌的转移测定用试样的制备用在组织诊断中组织学上认为有乳腺癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阳性淋巴结)24个和组织学上诊断为没有乳腺癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阴性淋巴结)52个如下制备测定用试样。
在各淋巴结(约50～600mg/个)中添加4mL处理液(含pH3.4、200mM甘氨酸-HCI、5％Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格玛公司生产)和20％DMSO(和光纯药制))，用搅拌机匀质化。
将所得匀质液以10,000XG、室温下离心分离1分钟。
取上清200μL。
用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN公司制，产品号74014)纯化上清中所含RNA，将所得溶液作为测定用试样使用。
癌标志物的测定使用从阳性淋巴结和阴性淋巴结制备的测定用试样，采用实时PCR装置(ABI PRISM(注册商标)7000型荧光定量PCR仪，应用生物系统公司)进行QRT-PCR反应，测定CK19的mRNA。
实时RT-PCR使用QRT-PCR试剂盒QuantiTect SYBR Green RT-PCR试剂盒(QIAGEN公司制，产品号204245)按照使用说明书进行，反应液的组成和反应条件如下检测CK19的引物上游引物5′-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3′(序列号1)下游引物5′-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3′(序列号2)反应液RNase-free H2O 10.99μL2Xmastermix 12.50μL100μM上游引物(最终浓度500nM)0.13μL100μM下游引物(最终浓度500nM)0.13μLQuantiTect RTmix 0.25μL测定用试样 1.00μL合计 25.00μL反应条件50℃、30分钟95℃、15分钟以下工序重复40个周期；94℃、15秒60℃、1分钟。
求反应液荧光强度超过阈值(所述实时PCR仪配备的SDS软件自动设定的值)时的PCR周期数，根据此PCR周期数算出mRNA拷贝数。
阈值被设定为每个测定用试样500个拷贝(图5中的点线)。
各测定用试样的mRNA拷贝数如图5所示。
得知，用本实施例的方法可以判断组织诊断中诊断为阳性标本的标本(+)为阳性，组织诊断中诊断为阴性标本的标本(-)为阴性。
(比较例1)测定测定用试样中β-肌动朊的mRNA的量作为管家基因。测定方法同实施例1中测定CK19的mRNA。用于PCR的引物如下用于检测β-肌动朊的引物上游引物5′-CCACACTGTGCCCATCTACG-3′(序列号3)下游引物5′-AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3′(序列号4)用比较例1所得β-肌动朊mRNA的拷贝数除以实施例1所得CK19的mRNA拷贝数(进行标准化)，结果如图6所示。
从图6的结果可以看出，标准化CK19的mRNA拷贝数，即使将阈值设为0.0001～0.001，也有可能判断几个阴性标本为阳性。
例2用QRT-PCR法诊断大肠癌的转移除用在组织诊断中组织学上认为有大肠癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阳性淋巴结)34个和组织学上诊断为没有大肠癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阴性淋巴结)40个外，其他与实施例1同，测定测定用试样中的CK19mRNA的绝对量。
求反应液荧光强度超过阈值时的PCR周期数，根据此PCR周期数算出mRNA拷贝数。
阈值设定为每个测定用试样130个拷贝数。
各测定用试样的mRNA拷贝数如图7所示。
得知，用本例的方法可以判断出组织诊断中诊断为阳性标本的标本(+)为阳性，组织诊断中诊断为阴性标本的标本(-)为阴性。
例3用QRT-PCR法诊断胃癌的转移除用在组织诊断中组织学上认为有胃癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阳性淋巴结)7个和组织学上诊断为没有胃癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阴性淋巴结)8个外，其他与实施例1同，测定CK19的mRNA绝对量。
求反应液荧光强度超过阈值时的PCR周期数，根据此PCR周期数算出mRNA拷贝数。
阈值设定为每个测定用试样350个拷贝数。
各测定用试样的mRNA拷贝数如图8所示。
得知，用实施例1～3的方法可以判断出，组织诊断中诊断为阳性标本的标本(+)为阳性，组织诊断中诊断为阴性标本的标本(-)为阴性。
从以上结果可以知道，用实施例1～3的方法可以正确判断各种癌的癌转移。
例4用QRT-LAMP法诊断乳腺癌的转移测定用试样的制备用在组织诊断中组织学上诊断为有乳腺癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阳性淋巴结)19个和组织学上诊断为没有乳腺癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阴性淋巴结)45个，如下制备测定用试样。
在各淋巴结(约50～600mg/个)中添加4mL处理液(含pH3.4、200mM甘氨酸-HCI、5％Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格玛公司生产)和20％DMSO(和光纯药制))，用搅拌机匀质化。
将所得匀质液以10,000XG、室温下离心分离1分钟，取上清液200μL。
将此上清液作为测定用试样使用。
反应缓冲液的制备将以下物质混合，制备13.97μL的反应液。
750mM TRIS缓冲液(pH8.0) 1.00μl10XThermopol缓冲液(新英格兰bioLaboratorie公司生产)2.50μl
10mM dNTPs 2.00μl100mM MgSO4 0.75μl100mM二硫苏糖醇 1.25μl2％Tergitol(Sigma Aldrich Japan公司制)2.50μlH2O 3.97μl酶试剂的制备混合以下成份制备3.04μL的酶试剂。
10U/μl AMV逆转录酶(普洛麦格(Promega)公司制) 0.14μl8U/μl Bst DNA聚合酶(新英格兰bioLaboratorie公司制)2.27μlRNase inhibitor(普洛麦格公司制) 0.63μl引物溶液的制备混合以下成份制备6.00μL的引物试剂。
80pmol/μl上游内引物 1.00μl(序列号55′-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3′)80pmol/μl下游内引物 1.00μl(序列号65′-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3′)5pmol/μl 上游外引物 1.00μl(序列号75′-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3′)5pmol/μl下游外引物 1.00μl(序列号85′-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3′)60pmol/μl loop上游引物 1.00μl(序列号95′-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3′)60pmol/μl loop下游引物 1.00μl
(序列号105′-CGTCTGGCTGCAGATGA-3′)反应液的制备混合所述反应缓冲液、酶试剂和引物溶液调制出23μL溶液，将此溶液与测定用试样2μL混合，制备反应液25μL。
用QRT-LAMP技术进行核酸扩增及其测定用实时浊度测定装置(Teramecs公司制LA-200)对反应液中的核酸扩增，实时测定作为核酸扩增副产品生成的焦磷酸镁所造成的反应液的混浊。
测定反应液浊度达到0.1时所需的时间(检测时间)。
根据此检测时间计算出CK19mRNA的拷贝数(绝对量)。
阈值设定为220拷贝数。
各测定用试样的mRNA拷贝数如图9所示。
得知，本例方法可以将在组织诊断中诊断为阳性标本的标本(+)判断为阳性，可以将在组织诊断中诊断为阴性标本的标本(-)判断为阴性。
例5用QRT-LAMP法诊断大肠癌的转移除用在组织诊断中组织学上认为有大肠癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阳性淋巴结)34个和组织学上诊断为没有大肠癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阴性淋巴结)40个制备测定用试样外，其他与实施例4相同，测定CK19mRNA的绝对量。
用QRT-LAMP法测定各测定用试样中所含mRNA相应的cDNA扩增、浊度达到0.1时所需的时间(检测时间)。
根据此检测时间计算出CK19mRNA的拷贝数(绝对量)。
阈值设定为400个拷贝。
各测定用试样的mRNA拷贝数如图10所示。
得知，用本例方法可以判断在组织诊断中诊断为阳性标本的标本(+)为阳性，可以判断在组织诊断中诊断为阴性标本的标本(-)为阴性。
例6用QRT-LAMP法诊断胃癌的转移除用在组织诊断中组织学上诊断为有胃癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阳性淋巴结)7个和组织学上诊断为没有胃癌由来的癌细胞转移的淋巴结(阴性淋巴结)8个制备测定用试样外，其他与例4相同测定CK19mRNA的绝对量。
用QRT-LAMP法测定各测定用试样中所含mRNA相应的cDNA扩增、浊度达到0.1时所需的时间(检测时间)。
根据此检测时间计算出CK19mRNA的拷贝数(绝对量)。
阈值设定为140个拷贝。
各测定用试样的mRNA拷贝数如图11所示。
得知，用实施例4～6所示方法可以判断在组织诊断中诊断为阳性标本的标本(+)为阳性、在组织诊断中诊断为阴性标本的标本(-)为阴性。
从以上结果看，显然用实施例4～6所示方法可以正确判断各种癌的癌转移。
从所述得知，不进行标准化，采用癌标志物的绝对量可以正确判断癌转移。显然，本发明的检测方法不论诊断对象为何种癌，不论用何种核酸扩增法，均可有效判断。
序列表<110>希森美康<120>癌转移检测方法及其设备<130>IP3784<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1cagatcgaag gcctgaagga20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2cttggcccct cagcgtact 19<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ccacactgtg cccatctacg 20<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4aggatcttca tgaggtagtc agtcag 26<210>5<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5ggagttctca atggtggcac caactactac acgaccatcc a 41<210>6<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6gtcctgcaga tcgacaacgc ctccgtctca aacttggttc g 41<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7tggtaccaga agcagggg 18<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gttgatgtcg gcctccacg19<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9agaatcttgt cccgcagg 18<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10cgtctggctg cagatga 1权利要求
1.一种癌转移的检测方法，其特征在于包括如下步骤测定采自生物的组织或细胞中的癌标志物的绝对量的测定步骤；以及通过对比所述测定出的绝对量和预设阈值，判断癌是否向所述组织或所述细胞所属组织转移的判断步骤。
2.一种癌转移的检测方法，其特征在于包括如下步骤测定反映采自生物的组织或细胞中的癌标志物绝对量的信息的测定步骤；以及通过将测定出的反映所述绝对量的信息与预设阈值进行比较，而无需用所述癌标志物以外分子的绝对量进行标准化处理，判断癌是否向所述组织或所述细胞所属组织转移的判断步骤。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述组织为淋巴结组织。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述癌标志物用测定用试样进行测定，该测定用试样是在所述组织或细胞中添加处理液，让所述组织或细胞所含癌标志物移至溶液中制备的，而不进行核酸抽取处理。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述处理液含二甲亚砜。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的测定采用核酸扩增法。
7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述癌标志物为mRNA。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述mRNA为角蛋白mRNA。
9.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述癌选自乳腺癌、胃癌、食道癌、大肠癌和前列腺癌。
10.一种癌转移检测设备，包括测定采自生物的组织或细胞中的癌标志物的绝对量的测定系统；以及通过对比所述测定出的绝对量和预设阈值，判断癌是否向所述组织或所述细胞所属组织转移的判断系统。
全文摘要
本发明提供一种癌转移的检测方法及其设备。其中癌转移的检测方法包括测定步骤，测定采自生物的组织或细胞中所含癌标志物的绝对量；判断步骤，通过比较所述所测绝对量和预设的阈值，判断癌是否向所述组织或所述细胞所属组织转移。癌转移检测设备包括测定采自生物的组织或细胞中的癌标志物的绝对量的测定系统；以及通过对比所述测定出的绝对量和预设阈值，判断癌是否向所述组织或所述细胞所属组织转移的判断系统。
文档编号C12M1/34GK101089197SQ20071011099
公开日2007年12月19日 申请日期2007年6月12日 优先权日2006年6月13日
发明者中林一树, 大友泰裕, 大东元就, 高田英基, 桧山佳代 申请人:希森美康株式会社