专利名称：一种多基因片段的亚克隆方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，公开了一种多基因片段的克隆方法，与传统的方法相比，其可以通过末端兼容的酶切位点的反复消除和引入，完成多个基因的克隆。本方法可以用于基因组的改造，疫苗的制备和诊断试剂的生产。
背景技术：
基因克隆是基因组改造的最基本方法。单个基因的克隆比较容易完成，而多个基因特别是像类似于整个病毒基因组序列的克隆，目前操作起来仍然比较困难。重叠PCR可以用于少数几个基因的连接和克隆，但仍然无法用于十多个或数十个基因的克隆。而将十数个或数十个基因置于一个操纵子之下，是一种最有效、最经济的基因组改造的方法，其可以用于大规模的代谢通路的改造，病毒疫苗的制备和诊断试剂的生产。
限制性内切酶，特别是II型内切酶，因其特异性的辨认序列，广泛用于分子生物学领域。本发明专利根据某些限制性酶切位点末端的兼容性，通过基因克隆这一过程反复的消除和引入酶切位点，使得利用有限的限制性内切酶，就可以完成多个基因的克隆，使基因克隆过程酶切位点的选择大为简化，并使代谢通路的改造和病毒全基因组疫苗的制备大为简化并易于操作。
发明的内容发明的目的利用某些限制性内切酶位点末端的兼容性，通过基因克隆这一过程反复的消除和引入酶切位点，使得利用有限的限制性内切酶，就可以完成多个基因片段的克隆，而达到对基因组进行大规模代谢通路的改造、诊断试剂的生产和病毒全基因组疫苗的制备目的。为达到上述目的，特采取下列方法1、一种利用末端兼容性的限制性内切酶进行多个DNA片段反复连接和/或克隆的方法。
2、如权力要求书1所述，通过反复消除和引入末端兼容性的酶切位点，而重复DNA片段的克隆过程。
3、如权力要求书1所述，酶切位点的消除是通过将末端兼容的酶切产物相互连接在一起完成的。
4、如权力要求书1所述，酶切位点的引入是通过在聚合酶连反应的引物中人工合成来完成的。
5、权利要求书1所述，这种利用末端兼容性的限制性内切酶进行多个DNA片段反复连接的方法可以在微生物体内通过特异性的克隆和/或表达质粒载体来完成。
6、如权利要求书1-5所述的方法，可以用于基因的克隆和表达，可以用于诊断试剂、疫苗和代谢通路的改造。
具体实施例方式
限制性内切酶是基因工程操作的最基本的工具之一。基因的克隆和表达都离不开限制性内切酶的使用。限制性内切酶，特别是II型内切酶，因其特异性的识别序列酶切所产生的特异性末端而广泛用于基因的克隆过程。
细菌代谢通路的改造是一项新兴的研究课题，通过将属于不同细菌或其它微生物代谢通路的酶引入，可以使微生物具有新的功能和性状。这种经基因工程改造的微生物可以广泛用于生物化工原料、生物能源和环境污染的防治。细菌代谢通路的改造往往涉及到几个和十数个有功能活性的基因的克隆，并且将这些基因置于一个或少数几个促进子的控制。采用现有的方法进行这种大规模的克隆，不仅费时，而且实施起来也很困难。因为随着基因片段的加长，可选择的合适的内切酶越来越少。
目前除了乙肝外，几乎所有的疫苗都是灭活或减毒的全基因组疫苗。这是因为在病毒与宿主的长期共同进化的过程中，病毒通过与宿主发生多点相互作用，以确保不因宿主在单一的某个点上产生抗体或抵抗，而使其灭绝。因此，只有通过接种使宿主产生多种抗体或细胞毒效应，方能有效预防病毒的感染。这也是灭活或减毒疫苗有效的原因之一。而利用传统的方法，对全基因组进行克隆，不仅费时，而且很难操作，因为随着所需要克隆的DNA片段长度的增加，可供选择的酶切位点越来越少。
随着临床医学的进展，人们对疾病的诊断水平的要求越来越高，都希望通过最少量的样本获取最多的信息。而将多种病原或自身的抗原编码基因整合到一条DNA连中，也需要进行多片段的克隆。而采用传统的方法，也比较费时，费力。
下面以克隆I型艾滋病毒的全基因组为例，说明本专利的实施过程1.根据艾滋病毒的全基因组序列，确定下列末端互补的限制性内切酶在整个基因组中没有酶切位点，NarI GG/CGCC，ClaI AT/CGAT，BssHII G/CGCGC和MluI A/CGCGT，且NarI和ClaI互补，BssHII和MluI互补，及其连接产物将不能被各自对应的内切酶酶切。
2.根据艾滋病毒的全基因组序列，特设计下列引物，并使5’端的引物含有NarI GG/CGCC的酶切位点序列；使3’端的引物含有BssHII MluI ClaI的酶切位点序列。这样通过NarI和BssHII酶切的PCR产物，可以直接连接到用ClaI和MluI酶切处理的pET32a的质粒中。所获得的质粒又可以用ClaI和MluI酶切处理，再插入用NarI和BssHII酶切的PCR产物，而反复重复这一过程，直至完成所有的基因克隆。
2.1FVifF NarI GGA GGCGCC ATG GAA AAC AGA TGG CAG GTG CTG2.1RVifR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT GTG TCC ATT CAT TGT ATG GTTCCC TCT 582bp2.2FVprF NarI GGA GGCGCC ATG GAA CAA TCC CCA GAA GAT CAG GG2.2R VprR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT GGA TCT ACT GGC TCC ATT TCTTGT TCT TC 291bp2.3F EnveF NarI GGA GGCGCC ATG AGA GTG ACG GGG ATC AAG AAG AAT2.3R EnveRPstI BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT TCT CCT TTT TGC TGC AGTGGG TGC2.4F EnveF1PstI NarI GGA GGCGCC GCAC CCA CTG CAG CAA AAA GGA GA2.4R EnveR1 BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT TTG CAA AGC TGC TTC AAA GCCCT 2580bp
2.5FGagF Nar I GGA GGCGCC ATG GGT GCG AGA GCG TCA ATA TTA AGA2.5RGagR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT TTG TGA CGA GGG GTC GTT GC1488bp2.6FNefF NarI GGA GGCGCC ATG GGG GGC AAG TGG TCG2.6RNefR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT GCA GTC TTT GTA AAA CTC CGGATG TA 621bp2.7FPolyF NarI GGA GGCGCC TTT TTT AGG GAA AAT CTG GCC CTC CCA2.7RPolyRNcoI BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGATTAGCTGACATTGATCACAGCTAGCCAC2.8FPolyF1NcoI NarI GGA GGCGCC GTGGCTAGCTGTGATCAATGTCAGCTA2.8RPolyR1NheI BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT GCT GAC ATT GAT CAC AGCTAG CCA CTA2.9FPolyF2NheI NarI GGA GGCGCC TAG TGG CTA GCT GTG ATC AAT GTC AGC2.9RPolyR2 BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT ATC TTC ATC CTG TCT ACC TGCCAC AC 3012bp2.10F RevF NarI GGA GGCGCC ATG GCA GGA AGA AGC GAA GAC AG2.10R RevR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT TTA AGG GCT TCC CAC CCC CT324bp2.11FTatF NarI GGA GGCGCC ATG GAG CCA GTA GAT CCT AAA TTA GAG TCT TGG2.11R TatR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT AGC AAG ACA AAG ACA GAT CCATTC GAT TAG 306bp2.12FVpuF NarI GGA GGCGCC ATG CAA ACT TTA ACC ATT TTA GCA ATA GTA GCC TTA GTA2.12R VpuR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT CAG ATC ATC AAC ATC CCA AGGAGC A 246bp3.表达用质粒的构建3.1根据表达质粒pET32a的序列，特设计下列引物，以消除其骨架LacI编码序列中的MluI的酶切位点.
3.1.1F PET32aF ATA GTT AAT GAT CAG CCC ACT GAC GCA TTG CGC GAG AAG ATT GTG CAC3.1.1R PET32a GTG CAC AAT CTT CTC GCG CAA TGC GTC AGT GGG CTG ATC ATT AAC TAT3.2建立下列反应体系10X Pfu缓冲液5.0uldNTP 2mM 5.0ul3.1.1F 2uM 5.0ul3.1.2R 2uM 5.0ulpET32a 10ng/ul 5.0ulPfu DNA聚合酶2u/ul 2.0ulH2O 23.0ul94℃2分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃6分钟，共18个循环。
然后，在PCR产物中加入1ul的DpnI于37℃孵育2小时，以消化质粒模板。然后，加入酵母tRNA 5ul(5ug/ul)，5ul 3M醋酸钠，150微升的酒精，离心10分钟，12000转/分。再用70％的酒精漂洗2遍。所得的连接产物电转到大肠杆菌中。所得的质粒用MluI和NdeI酶切，凡释放831bp片段者，为未发生变异者，而未能释放者为变异质粒，为所需要的质粒，并将其中一个质粒命名为pSZTC2000.
3.3设计下列DNA片段及其互补连3.3.1F PET32a EcoRIClaIMulIsalIFGGATCCGAATTCATCGATGGAACGCGTGTCGACGGATCC3.3.1R PET32aEcoRIClaIMluISalIR GGATCCGTCGACACGCGTTCCATCGATGAATTCGGATCC将100微摩尔的3.3.1F和3.3.1R各2微升混匀后，于95℃孵育5分钟后，缓慢冷却到室温。然后加入2微升的10X NEB缓冲液3，12.8微升的水，EcoRI 0.5微升，SalI 0.5微升，BSA0.2微升。于37℃孵育2小时后，再于65℃孵育20分钟以，灭火内切酶。同时用EcoRI和SalI酶切pSZTC2000。然后将二者连接，并将连接产物经沉淀后转入到大肠杆菌中。所获得的质粒命名为pSZTC2001，其含有ClaI和MluI位点。
4.cDNA的制备4.1将0.5毫升TRIzol RNA分离试剂加入0.5毫升抗凝血浆中，混匀，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟；将上清转移到新的离心管中，加入0.5毫升异丙醇，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟，其上清，加入70％的酒精漂洗1遍，溶于12ul水中。所有的离心速度为12000转/分钟。
4.2建立下列反应体系自步骤4.1的RNA 12ul随机引物0.5ug/ul3ul混匀后，于65℃孵育5分钟，然后缓慢冷却到25℃，并放置10分钟然后加入10X AffinityScript RT缓冲液 2.0uldNTP 25mM 0.8ulRnase抑制剂40u/ul 1.0ul逆转录酶1.0ul(购自Stratagene)于42℃反应2小时。
4.3建立下列反应体系10X Pfu DNA聚合酶缓冲液 5.0uldNTP 2mM5.0ul上游引物F 2uM 5.0ul下游引物R 2uM 5.0ul步骤4.2的cDNA 1.0ulPfu 2.5u/ul 1.0uldH2O28.0ul94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃30秒，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。所有的引物组合的退火温度均为55℃，延伸时间根据扩增片段的长度而定，500bp以内，30秒，1000bp以内，60秒，2000bp以内，2分钟。
4.4将PCR产物，分别用NarI和BssHII进行酶切，回收片段备用。
5.0含HIV基因组表达质粒的构建5.1将引物2.1F和2.1R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段，和用MluI和ClaI酶切的pSZTC2001连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2002；将质粒pSZTC2002用MluI和ClaI酶切，并与引物2.2F和2.2R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2003将质粒pSZTC2003用MluI和ClaI酶切，并与引物2.3F和2.3R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2004；将质粒pSZTC2004用MluI和ClaI酶切，并与引物2.4F和2.4R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2005；将质粒pSZTC2005用MluI和ClaI酶切，并与引物2.5F和2.5R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2006.
5.2将引物2.6F和2.6R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段，和用MluI和ClaI酶切的pSZTC2001连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2007；将质粒pSZTC2007用MluI和ClaI酶切，并与引物2.7F和2.7R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2008；将质粒pSZTC2008用MluI和ClaI酶切，并与引物2.8F和2.8R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2009；将质粒pSZTC2009用MluI和ClaI酶切，并与引物2.9F和2.9R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2010；将质粒pSZTC2010用MluI和ClaI酶切，并与引物2.10F和2.10R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2011；将质粒pSZTC2011用MluI和ClaI酶切，并与引物2.11F和2.11R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2012；将质粒pSZTC2012用MluI和ClaI酶切，并与引物2.8F和2.8R所获得的用NarI和BssHII酶切的PCR片段连接，经沉淀、漂洗的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒为pSZTC2013。
6.HIV融合蛋白的纯化。
将pSZTC2006和pSZTC2013电转到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，在对数期生长的细菌中加入1mM的IPTG诱导4小时，然后用镍柱纯化上清，所获得的蛋白可以用于诊断用的抗原，或疫苗用的抗原。
一种多基因片段的克隆方法2.1FVifF NarI GGA GGCGCC ATG GAA AAC AGA TGG CAG GTG CTG2.1RVifR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT GTG TCC ATT CAT TGT ATG GTTCCC TCT2.2FVprF NarI GGA GGCGCC ATG GAA CAA TCC CCA GAA GAT CAG GG2.2R VprR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT GGA TCT ACT GGC TCC ATT TCTTGT TCT TC2.3F EnveF NarI GGA GGCGCC ATG AGA GTG ACG GGG ATC AAG AAG AAT2.3R EnveRPstI BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT TCT CCT TTT TGC TGC AGTGGG TGC2.4F EnveF1PstI NarI GGA GGCGCC GCAC CCA CTG CAG CAA AAA GGA GA2.4R EnveR1 BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT TTG CAA AGC TGC TTC AAA GCCCT2.5FGagF NarI GGA GGCGCC ATG GGT GCG AGA GCG TCA ATA TTA AGA2.5RGagR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT TTG TGA CGA GGG GTC GTT GC2.6FNefF NarI GGA GGCGCC ATG GGG GGC AAG TGG TCG2.6RNefR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT GCA GTC TTT GTA AAA CTC CGGATG TA2.7FPolyF NarI GGA GGCGCC TTT TTT AGG GAA AAT CTG GCC CTC CCA2.7RPolyRNcoI BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT TAGCTGACATTGATCACAGCTAGCCAC2.8FPolyF1NcoI NarI GGA GGCGCC GTGGCTAGCTGTGATCAATGTCAGCTA2.8RPolyR1NheI BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT GCT GAC ATT GAT CAC AGCTAG CCA CTA2.9FPolyF2NheI NarI GGA GGCGCC TAG TGG CTA GCT GTG ATC AAT GTC AGC2.9RPolyR2 BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT ATC TTC ATC CTG TCT ACC TGCCAC AC2.10F RevF NarI GGA GGCGCC ATG GCA GGA AGA AGC GAA GAC AG2.10R RevR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT TTA AGG GCT TCC CAC CCC CT2.11FTatF NarI GGA GGCGCC ATG GAG CCA GTA GAT CCT AAA TTA GAG TCT TGG2.11R TatR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT AGC AAG ACA AAG ACA GAT CCATTC GAT TAG2.12FVpuF NarI GGA GGCGCC ATG CAA ACT TTA ACC ATT TTA GCA ATA GTA GCC TTA GTA2.12R VpuR BssHIIMluIClaI GGA GCGCGC ACGCGT GAA ATCGAT CAG ATC ATC AAC ATC CCA AGGAGC A3.1.1F PET32aF ATA GTT AAT GAT CAG CCC ACT GAC GCA TTG CGC GAG AAG ATT GTG CAC
3.1.1R PET32a GTG CAC AAT CTT CTC GCG CAA TGC GTC AGT GGG CTG ATC ATT AAC TAT3.3.1F PET32a EcoRIClaIMulIsalIF GGATCCGAATTCATCGATGGAACGCGTGTCGACGGATCC3.3.1R PET32aEcoRIClaIMluISalIR GGATCCGTCGACACGCGTTCCATCGATGAATTCGGATCC
权利要求
1.一种利用末端兼容性的限制性内切酶进行多个DNA片断反复连接和/或克隆的方法。
2.如权力要求书1所述，通过反复消除和引入末端兼容性的酶切位点，而重复DNA片断的克隆过程。
3.如权力要求书1所述，酶切位点的消除是通过将末端兼容的酶切产物相互连接在一起完成的。
4.如权力要求书1所述，酶切位点的引入是通过在聚合酶连反应的引物中人工合成来完成的。
5.权利要求书1所述，这种利用末端兼容性的限制性内切酶进行多个DNA片断反复连接的方法可以在微生物体内通过特异性的克隆和/或表达质粒载体来完成。
6.如权利要求书1-5所述的方法，可以用于基因的克隆和表达，可以用于诊断试剂、疫苗和代谢通路的改造。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种多基因片段的克隆方法，与传统的方法相比，其可以通过末端兼容的酶切位点的反复消除和引入，完成多个基因的克隆。本方法可以用于基因组的改造，疫苗的制备和诊断试剂的生产。
文档编号C12Q1/68GK101063160SQ20071011121
公开日2007年10月31日 申请日期2007年6月18日 优先权日2007年6月18日 公开号200710111214.发明者刘吉荣, 迟云发 申请人:北京神洲天才科技发展有限公司 被以下专利引用 (1),