专利名称：一种编码双齿围沙蚕蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码具有纤维蛋白酶原激活活性的沙蚕蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸 序列，属于生物医药领域。
背景技术：
蛋白酶是一类分布于动物、植物和微生物中能够特异水解肽键的水解酶，其中部分为丝 氨酸内切蛋白酶，这些蛋白酶在生物体发挥凝集、免疫、溶纤、消化、调节胚胎发育等不同 的生理作用。血栓性疾病是中、老年人易发的疾病之一，而且目前青年病人的数量也在上升。 目前治疗血栓病的主要方法就是溶栓疗法，即注射溶栓剂使血管再通。因此开发高效的溶栓 药物在临床上具有重要意义。
双齿围沙蚕是我国海岸广泛分布的一种海洋环节动物，常被用做钓饵，作为中药具有活 血解毒的功效。近几年双齿围沙蚕己引起了人们的关注，多种生物活性多肽已从中被分离和 鉴定，其中最重要的是具有溶栓活性的沙蚕激酶和沙蚕蛋白酶，沙蚕激酶本质上也是特异的 内切蛋白酶。王斌等在其专利(专利号200310115243.1)中公开了一种具有溶栓活性的双 齿围沙蚕激酶的编码基因序列及其氨基酸序列，所公开的基因序列全长249碱基对，编码的 沙蚕激酶含有83个氨基酸残基；洪敏等在申请专利(专利申请号02144828.0)说明书中公 开了一种沙蚕蛋白的制备方法、所制备蛋白酶的五个特征片段的氨基酸序列及其纤维蛋白和 纤维蛋白酶原的水解活性；陈颢等在其申请的专利(专利号98111280.3)中公开了一种沙 蚕激酶的提取方法，利用该方法从双齿围沙蚕中制备的沙蚕激酶分子量在25-55kDa之间，等 电点在3-7之间，纯化的沙蚕激酶体外具有纤维蛋白酶原激活活性。汪靖超等(2007)在发 表的论文中介绍了一种沙蚕蛋白酶的纯化方法，利用该方法从双齿围沙蚕中纯化了一种蛋白 酶，蛋白酶含有两个亚基，分子量66000左右，该蛋白具有酪蛋白水解活性。
从以前的研究可以看出，双齿围沙蚕中具有多种蛋白酶，充分研究这些蛋白酶具有广阔 的应用前景。但由于蛋白酶在沙蚕中含量低，纯化工艺比较复杂，使其开发利用受到了限制。 随着分子生物学技术的快速发展，利用基因工程的方法生产这些蛋白酶就成了一种高效的手 段，但除了王斌等报道了一个基因序列外，尚没有其它沙蚕新蛋白酶基因序列的报道。本专 利公开了一种全新的双齿围沙蚕蛋白酶的氨基酸序列及编码该蛋白酶的cDNA序列，并证明 该蛋白酶具有纤维蛋白酶原激活活性，从而提供了一种新型的溶栓制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种编码具有溶栓活性的双齿围沙蚕蛋白酶的CDNA序列； 本发明的另一个目的在于提供这种具有溶栓活性的双齿围沙蚕蛋白酶的氨基酸序列。
为了实现上述发明目的，本发明利用双齿围沙蚕为材料，构建了cDNA文库，通过 大规模DNA序列分析技术，获得了一种编码具有溶栓活性的沙蚕蛋白酶的cDNA序列。 以该序列作为探针，可以从其它生物体内克隆蛋白酶的编码基因，也可以将该序列克隆 到表达载体上，在原核表达系统(如大肠杆菌)或真核表达系统(如酵母、动物细胞等) 生产具有溶栓活性的重组双齿围沙蚕蛋白酶，重组双齿围沙蚕蛋白酶具有纤维蛋白酶原
激活活性，可作为新型的基因工程药物。
双齿围沙蚕cDNA文库的构建与编码蛋白酶cDNA克隆
1、 以双齿围沙蚕活体组织为材料，使用RNAiso Reagent (TaKaRa Code No.D312)提取总
RNA。
2、 使用01igotex-dT30 mRNA纯化试剂盒(TaKaRa Code No. 9086)提取mRNA。
3、 以mRNA为模板，使用TaKaRa cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库，具体包括以下 步骤
(1) 利用反转录酶M-MLV和Oligo(dT)锚定引物合成cDNA的第一条链，合成时使用5_ 甲基dCTP;
(2) 利用RNaseH、大肠杆菌DNA聚合酶以及DNA连接酶合成cDNA的第二条链；
(3) 利用T4 DNA聚合酶使双链cDNA末端平滑化；
(4) 与含有NotI识别序列的接头连接，再用NotI进行酶切；
(5) 使用DNA回收试剂盒(TaKaRa Code No. 9092)去除短链cDNA;
(6) 与质粒pAP3neo进行连接，得连接产物；
(7) 取连接产物转化E. coli DH10B，构建cDNA文库，库容量为7.8xl05;
(8) 利用ABI DNA序列分析仪，通过测序筛选编码蛋白酶的cDNA。 一种具有溶栓活性的双齿围沙蚕蛋白酶cDNA序列，该序列如下
<formula>formula see original document page 4</formula>
GTGTTATCGAATGTGAACAAAGAAATAAAAAATAAAAAA
序列中划线标示的ATG为起始密码子，划线标示的TAG为终止密码子。 以上序列为编码双齿围沙蚕蛋白酶原始cDNA序列，通过基因突变的方法可对其结构 进行改造，得到双齿围沙蚕蛋白酶cDNA序列的衍生序列，该衍生序列包括新分离的具有 与以上所述结构同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、 缺失获得的该基因序列的各种变构体。
根据双齿围沙蚕蛋白酶的原始编码序列，经过翻译得到一种具有溶栓活性的沙蚕蛋白酶的 氨基酸序列，该序列如下
VYARVSTYMNWIGL
上述序列中，划线标示部分为该蛋白酶的信号肽序列。
本发明的有益效果是根据本发明的沙蚕蛋白酶cDNA序列，可以从双齿围沙蚕的cDNA 文库中克隆蛋白酶的编码基因，该编码基因通过基因重组技术，可以在真核表达系统(如酵母 细胞或动物细胞)或原核表达系统(如大肠杆菌)中获得表达，重组沙蚕蛋白酶具有纤维蛋白酶 原激活活性，可作为溶栓药物，用于预防或治疗心肌梗塞、脑动脉血栓等疾病。
图1为双齿围沙蚕蛋白酶编码序列的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为双齿围沙蚕蛋白酶编码序列在大肠杆菌中的表达的SDS-PAGE分析图。
图3为重组双齿围沙蚕蛋白酶的纯化的SDS-PAGE分析图。
图4为重组双齿围沙蚕蛋白酶的纤维蛋白酶原激活活性测定图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:双齿围沙蚕cDNA文库的构建与编码蛋白酶cDNA克隆
1、以2g双齿围沙蚕活体组织为材料，使用RNAiso Reagent (TaKaRa Code No. D312)提
取总RNA。
2、 使用Oligotex-dT30 mRNA纯化试剂盒(TaKaRa Code No. 9086)提取mRNA。
3、 以5|J g mRNA为模板，使用TaKaRa cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库，具体包括 以下步骤
(1) 利用反转录酶M-MLV和01igo(dT)锚定引物合成cDNA的第一条链，合成时使用5_甲 基dCTP;
(2) 利用RNaseH、大肠杆菌DNA聚合酶以及DNA连接酶合成cDNA的第二条链；
(3) 利用T4 DNA聚合酶使双链cDNA末端平滑化；
(4) 与含有NotI识别序列的接头连接，再用NotI进行酶切；
(5) 使用DNA回收试剂盒(TaKaRa Code No. 9092)去除短链cDNA;
(6) 与质粒pAP3neo进行连接，得20|j 1连接产物；
(7) 取2口 1连接产物转化E. coli DH10B，构建cDNA文库，库容量为7. 8xl(f;
(8) 利用ABI DNA序列分析仪，测定1000个克隆，从中筛选编码蛋白酶的cDNA，共得到 阳性克隆3个。
获得编码双齿围沙蚕蛋白酶的cDNA序列如下
GTGTTATCGAATGTGAACAAAGAAATAAAAAATAAAAAA 其编码的氨基酸序列为
VYARVSTY丽WIGL
实施例2:表达载体的构建与CDNA在大肠杆菌中的表达
1、 根据获得的cDNA序列，设计一对引物
引物1: ACATATGCTGAATGGACCAAG ， 引物2: ACCCTCGAGGAAACCTAAAGTC 以双齿围沙蚕蛋白酶的cDNA为模板，利用T叫DNA聚合酶扩增不含信号肽编码区的DNA
片段，扩增条件94。C变性45sec， 50。C退火45sec， 72。C延伸lmin。得到700bp片段(图l
中1.PCR产物；2.入DNA/EcoRl+Hind111)。
2、 用Ndel和XhoI切割后克隆到表达载体pET-15b上，构建表达载体pET-15bP，将表达 载体转化E. coliBL21 (DE3)，构建工程菌。
3、 挑取工程菌单菌落，接种于20ml含100iig/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30'C振荡 培养12h,转接到2L同样培养基中同样条件下继续培养4h，加入IPTG(异丙基-e-D-硫代半 乳糖苷)至1.0mM,继续培养6h， 8000Xg离心收集菌体。
4、菌体重悬与100ml Tris-Cl缓冲液(20mM，pH8.0, 5mM咪唑，0. 5丽aCl)，超声波破 碎细胞，取10ul裂解液进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示1.中分子量标准蛋白，从 下至上分子量依次为14、 18、 25、 35、 45、 67、 106kDa; 2. E.coliBL21 (DE3)全蛋白； 3.表达重组双齿围沙蚕蛋白酶的E.coli BL21 (DE3)全蛋白。在28kDa处可见表达重组双 齿围沙蚕蛋白酶。
实施例3:重组双齿围沙蚕蛋白酶的分离纯化
1、 诱导表达的工程菌经超声波破碎细胞后的裂解液，4°C， 15000Xg离心30min，取 上清液。
2、 上清液流过附2+树脂柱(2.6X8cm)，用100ml洗涤液(20mM， pH8. 0, 50mM咪唑， 0.腦aCl)。
3、 用洗脱缓冲液(20mM，pH8. 0， 500mM咪唑，0. 5丽aCl)洗脱结合蛋白，得重组双齿 围沙蚕蛋白酶，重组蛋白的为28kDa(图3: l.中分子量标准蛋白；2.未结合的杂蛋白；3.重 组双齿围沙蚕蛋白酶)。
实施例4:重组双齿围沙蚕蛋白酶的纤维蛋白酶原激活活性测定
1、在10ml缓冲液(50m mol/L Tris.Cl pH8. 0， 150m mol/L NaCl)中，加1%琼脂
糖，微波炉加热使之熔化。迅速加入1%脱脂奶粉，混匀。冷却至4(TC后加IOpI纤维蛋
白酶原，混匀。2、倒入小平皿中，待琼脂糖冷却凝固，在平皿中打直径5mm孔，加入10ul重组双齿 围沙蚕蛋白酶，以洗脱液为阴性对照，以重组链激酶为阳性对照。37'C温育12h，图4结果 显示在加入重组双齿围沙蚕蛋白酶和链激酶的小孔周围形成明显的透明圈，而在加入洗脱液 的小孔周围无透明圈的形成(图4: 1,3，5.洗脱液；2. 2iJg重组链激酶；4. 2|j g重组双 齿围沙蚕蛋白酶；6. 5|J g重组双齿围沙蚕蛋白酶)，说明重组双齿围沙蚕蛋白酶具有纤维 蛋白酶原激活活性。序列表
<110>青岛大学
<120〉一种编码双齿围沙蚕蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列 <160>2
<170>PatentIn3.1
<210>1
<211〉839
<212〉cDNA
<213>围沙蚕属(户m'M冊;s)
<221〉CDS <222〉(17)...(781)
<221>signal peptide <222〉(17)...(82)
<221>mat peptide <222〉 (83)…(778)
<221>PolyA-signal <222〉 (790)...(795)
<221〉PolyA-siteRNA <222> (823)…(839)
<400〉1
CCGGGGGGCT TGCTGCATGG CAGTTCTTGC CTACGGATGG GAATCTGGAT GTGGTAAAAG 60 CAGGTATACT GACGCTGGTG GCCTGAATGG ACCAAGGATT GTAGGAGGAC AAGAGAGCCG 120 ACCCAATGAG TTCCCATGGC AGGTCAGCAT GCAATCCAGC TTTGGTAGCC ACTACTGTGG 180
TGCCATCATCATCAACAGGAACTGGATCAT
AGCAAGCGATCTTTACCTTATGGTTGGAGA
AAGGACATATCGTGTTTCAGTCCTCAGGCA
CAATGATATCTCTGTGATGCAAACCACCCA
TGTATGTGCCCCAAGTACTTCCACTTATGC
AACCCTCAGATCTGGTGGTCCTTGCTGCCC
AATTAGCAACAATGAATGTAACACTATAGA
CTGTGCTGGAAACCGATTAAGTACTGATGC
GGTGAAGGATGGAGAGACCTTTGCTGTCAT
CTCTGGCTATGCTGGAGTTTATGCCAGAGT
GGTTTCTGTAATAAACCCAAGTGTTATCGA
<210〉2
<211>254
<212〉PRT
<213〉围沙蚕属(Pen'wew^)
<221> signal peptide <222〉 (1)…(22)
<221>mat peptide <222〉 (23)...(254)
<400〉2
MAVLAYG冊SGCGKSRYTDA巡LNGPRIVG
RNW頂TAAHCTAGDSASDLYLMVGEHDRSS
MQTTQTIGLSEDVAAVCAPSTSTYAGRTAV
CNT服PGDITDGMICAGNRLSTDACQGDS
VYARVSTY顧WIGL
GACCGCTGCTCACTGCACAGCAGGAGACTC240
ACACGACCGCTCAAGCACTGATGGACCAGA300
GCACGAAAATTACAACCAATTCACCCTGGA360
AACCATTGGACTGAGTGAGGACGTTGCTGC420
TGGCAGAACAGCTGTTGTTTCTGGATGGGG480
ACAGATTCTTCAATATGTGCAAGTACCTGT540
CTACCCAGGAGACATCACTGATGGCATGAT600
TTGCCAAGGTGACTCTGGTGGCCCACTGGT660
TGGCATCGTGTCCTGGGGAATTGGCTGTGC720
CTCAACCTACATGAACTGGATTGGACTTTA780
ATGTGAACAAAGAAATAAAAAATAAAAAA839
GQESRPNEFPWQVSMQSSFGSHYCGAIIIN60
TDGPERTYRVSVLRQHENYNQFTLDNDISV120
VSGWGTLRSGGPCCPQ歸VQVPVISNNE180
GGPLVVKDGETFAVIGIVSWGIGCASGYAG240
25权利要求
1、一种编码双齿围沙蚕蛋白酶的cDNA序列，其特征在于具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
2、 一种编码双齿围沙蚕蛋白酶的氨基酸序列，其特征在于具有序列表中序列2所 示的氨基酸序列。
3、 根据权利要求l所述的一种编码双齿围沙蚕蛋白酶的cDNA序列，其特征在于通 过DNA重组技术制备具有溶栓活性的基因工程药物。
全文摘要
本发明公开了一种编码双齿围沙蚕蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列，分别如序列表中序列1和序列2所示，其中cDNA全长839bp，编码双齿围沙蚕蛋白酶的核苷酸序列长765bp，编码的双齿围沙蚕蛋白酶的氨基酸序列全长254个氨基酸残基，包含22个氨基酸残基组成的信号肽，属于生物医药领域。根据本发明的沙蚕蛋白酶cDNA序列，可以从双齿围沙蚕的cDNA文库中克隆蛋白酶的编码基因，该编码基因通过基因重组技术，可以在真核表达系统或原核表达系统中获得表达，重组沙蚕蛋白酶具有纤维蛋白酶原激活活性，可作为溶栓药物，用于预防或治疗心肌梗塞、脑动脉血栓等疾病。
文档编号C12N15/57GK101186923SQ200710115010
公开日2008年5月28日 申请日期2007年11月20日 优先权日2007年11月20日
发明者李荣贵, 杜桂彩, 斌 王 申请人:青岛大学