专利名称：基于碱基修饰保护往复延伸的dna测序方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种实现原位清除延伸标记物， 同时保护引物延伸末端完整、能够逐步合成鉴定未知碱基以及涉及一种"标记延 伸_切割_保护延伸"的DNA测序方法。
背景技术：
现有技术在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的 基因的&出。目前用于最为广泛应用的测序技术是Sanger等(1977)发明的双脱 氧链末端终止法，Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在 待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一 套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核香酸三磷酸(dNTP),并混 入限量的一种不同的双脱氧核芬三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的 3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、 A、 T或C处终止。终止点由反 应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应 得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不 同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理 后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。1990年~ 1998年，人类 基因组序列已完成和正在测序的共计约330Mb,占人基因组的11%左右；已识别 出人类疾病相关的基因200个左右。此外，细菌、古细菌、支原体和酵母等17 种生物的全基因组的测序已经完成。Sanger法的优势在于可以分析未知的DNA 序列，而且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到lOOObp以上，然 后，在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证或是对 为数不多的位点进行分析验证，在这种情况下，较短序列的高通量测序方法更为 适用。测序技术可以在多个领域进行应用，在分子诊断学方面，可以用于病原微生 物的快速鉴定，遗传病分子诊断(如SNPs, SNP等位频率)，在法医鉴定方 面，如对线粒体D-Loop区的HVI和HVII高可变区进行分析，在药物基因组学
方面，如瑞典Eurona Medical AB与Pyrosequencing公司合作对血管紧张转换酶 (ACE)的SNP进行分析以及在农业生物方面都有诸多应用。针对基因组测序，目前发展了多种方法，从最先开始的基于Sanger测序法的 凝胶电泳测定技术包括后来改进的毛细管电泳测序技术，到非凝胶电泳测序技术 的DNA杂交测序(SBH, sequencing by hybridization)和飞4亍时间质谱:技术(111116-of-flight mass spectrometry),再到先在的Solexa公司的大规模芯片测序技术和焦 磷酸测序技术以及其他一些单分子测序技术，2006年3月，Solexa公司的总裁就 提出了基因组测序重新回温的见解，之后果然不仅有不断的技术(及其相关文 章)问世，而且罗氏也在454公司的强力支持下推出了 GS20焦磷酸测序系统， 在2003年人类基因组测序完成的时候，美国NIH下属的国立人类基因組研究院 (NHGRI)已经表示将举国进行革命性的DNA测序技术的开发，并且随之推出 了 1000美元基因组计划，可见测序技术已经越来越受到关注，无不预示着测序 技术在不久的将来，不仅仅是只作为一种科学研究的工具，而且将向一个产业发 展，将更好的为人类健康服务，更贴近人类的生活。发明内容技术问题本发明针对上述技术问题，提供基于碱基修饰保护往复延伸的 DNA测序方法，该方法能实现原位清除延伸标记物，同时保护引物延伸末端完 整、能够逐步合成鉴定未知碱基。技术方案 一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方法，DNA序列 的确定是通过基于碱基修饰保护的"标记延伸-切割-保护延伸"测序步骤来实现 的，具体测序步骤为向待测定DNA模板3'端51入一段20-50碱基长度的公用片 段作为测序引物杂交序列，将与公用片段互补的3'端碱基修饰保护的测序引物与 固定在固相载体上的待测定DNA模板杂交结合；标记延伸向上步所得杂交后 的测序DNA才莫板中，顺序加入或同时加入标记核苷酸单体，在测序引物上进行 延伸反应，并根据延伸上的标记核苷酸单体得出待测定DNA模板在该次延伸中 的碱基信息；切割将上步中延伸上的标记核普酸单体通过切割方法进行清除； 保护延伸在经上步处理后的测序引物序列上延伸与被切除碱基相同的的修饰保 护核苷酸单体；循环上述步骤所进行的"标记延伸-切割-保护延伸"过程，由此确 定待测定DNA模板的序列。修饰保护核普酸单体为使延伸上的单体不被切除的 基团或者粒子的修饰保护的脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核香酸。修饰保护核苷 酸单体为硫代或者碘代修饰保护的脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸。标记核苦酸单体为核苦酸单体上标记上直接或间接检测到的基团或者粒子。标记核苷酸 单体为核苷酸单体上标记着荧光分子、放射性同位素或者辣^^过氧化物酶。标记 核苷酸单体为标记脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸。切割方法为酶外切法或 者化学切割法。切割方法为的利用核酸外切酶的酶外切法或利用氨水、氢氧化钠 或过氧化氢的化学切割法。根据延伸上的标记核香酸单体得出待测定DNA模板 在该次延伸中的碱基信息的方法为焚光检测、化学发光检测或者放射自显影检 测。有益效果本发明与现有技术相比，具有如下优点1. 本发明的最大优点是实现了无损伤原位清除延伸标记物的方法。在传统的延 伸合成测序方法中，当标记物阻碍了进一步的测序信息的获得时，通常采用 将标记物破坏或者将标记物与单体分离的方法清除标记物信息，以进行进一 步的延伸测序。但是，由于标记物通常都是一个大分子，并且标记物与单体 的连接均是稳定的共价化学键，因此无论是采用化学或物理的方法破坏标记 物结构，还是将标记物与单体切割分离，都将对延伸位点造成破坏，其结果 可能是标记物大分子由于其空间位阻效应依然阻碍延伸的进行，也可能是造 成延伸位点的减少，降低下一步的延伸信号，增加错误延伸的信息，给测序 长度和正确性造成影响。而我们的方法清除的是所延伸上的标记物单体，单 体与引物之间的化学键断裂属于正常的生物学过程，最大程度的保护了延伸 位点的完整性，而且没有空间位阻效应影响进一步的延伸测序。2. 本发明是逐一的单体延伸测序，延伸一种标记单体，提取信息，然后清除这 种单体，加上修饰保护单体，再衍生下一种标记单体，错误延伸的累积效应 不严重，序列的判读明了准确，不存在测序长度的限制。
图1是本发明基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方法的示意图。图中 有DNA模板①，通用硫代修饰保护测序引物②，固相载体③， 一种标记核香酸 单体④，与 相同的^ 代修饰保护核苦酸单体 ,另一种标记核苦酸单体 ,可 切割的化学键⑦和不可切割的化学键⑧。DNA模板与通用测序引物杂交反应I, 一种标记核苦酸单体的延伸反应并且 检测信号II,切割延伸上的标记核芬酸单体III,延伸上修饰保护核普酸单体 IV,延伸另一种标记核苷酸单体并且检测信号V，经过III, IV和V的循环最终 将确定DNA模板的序列信息。
图2是本发明基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方法的修饰保护原理 图。图中有疏代修饰核普酸单体A,硫代修饰①，疏代二聚体B,抗切割化学 键②。硫代修饰核苷酸是指正常核脊酸的氧原子被硫原子取代，进而形成的硫代 修饰的化学键抗酶的化学活性，进而保护延伸上的单体不被切割。
具体实施方式
制备需要测序的DNA模板，并将其固定，将通用修饰保护测序引物与DNA 模板杂交，通过在测序引物上延伸一种标记核苷酸单体，确定该位置的序列信 息，然后通过切割单体的方式将延伸上的标记单体清除，随后延伸上同种修饰保 护核苷酸单体，确保下一种标记核苷酸单体的延伸，循环"标记延伸-切割-保护延 伸，，步骤，直到DNA模板序列得到确定。该方法不需要通过去除引物或是破坏标 记物结构或是断裂标记物与单体的化学键来去除已知信号，并且是逐个测定，错 误延伸的累积效应不严重，序列的判读明了准确，不存在测序长度的限制。图1是本发明基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方法的示意图，DNA 模板①固定在固相载体③上，通用修饰保护测序引物②与DNA模板杂交反应I, 加入一种标记核香酸单体④，在聚合酶作用下将通用引物延伸一种碱基II,并且通过检测可以确定在本次延伸中DNA模板是否含有与之相互补的^l&信息；清 除延伸的标记单体III，去除已知信号；加入同种硫代修饰保护核苷酸单体⑤，在 聚合酶作用下延伸引物IV,得到进一步测序的位点；加入另一种标记核苷酸单体 ⑥，在聚合酶以及修饰保护核苷酸单体的基础上进行下一种碱基的确定；循环 "标记延伸-切割-保护延伸"步骤，直到DNA模板序列得到确定。实施例1:基于硫代碱基修饰保护往复延伸的荧光测序法测定人基因组p16外显 子1序列设计一对针对人基因組p16外显子1的PCR引物，其中一条引物5'端修饰着 氨基。用PCR引物扩增人样本(血液、组织等)中的p16外显子1序列片段， PCR产物纯化后，通过点样的办法在醛基修饰的基片上形成阵列，氨基与醛基缩 合后，洗去未结合的PCR产物，采用氢氧化钠(2%, w/v)变性的办法去除未固 定的DNA链，得到单一的模板链，将修饰保护的引物与固定的DNA模板杂交， 并确保模板链的3'端突出5 ~6个#以上。按照dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP的次序，每次加入一种Cy5标记的单体与 未标记单体的一定比例(100: 1~1: 100)的混合物(Cy5标记单体浓度为0.01 p mol/L ~ 10 m mol/L)，用扫描仪记录该次延伸中焚光的有无和强弱，通过预先
建立的线性关系确定重复碱基的个数。收集荧光数据后，用核酸外切酶m(iu/H L )切除掉延伸的焚光碱基dATP，加入硫代修饰dATP ( 0.01 n mol/L ~ 10 m mol/L)，在聚合酶的作用下，填充Cy5-dATP原先的位置，然后进行下一步延伸 Cy5-dCTP的过程，如此循环，直到PCR序列确定。实施例2:基于碘代碱基修饰保护往复延伸的荧光测序法测定人基因组p16外显 子1序列设计一对针对人基因组p16外显子1的PCR引物，其中一条引物5'端修饰着 氨基。用PCR引物扩增人样本(血液、组织等)中的p16外显子1序列片段， PCR产物纯化后，通过点样的办法在醛基修饰的基片上形成阵列，氣基与醛基缩 合后，洗去未结合的PCR产物，采用氢氧化钠(2%， w/v)变性的办法去除未固 定的DNA链，得到单一的模板链，将修饰保护的引物与固定的DNA模板杂交， 并确保模板链的3'端突出5 ~ 6个#以上。按照dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP的次序，每次加入一种Cy5标记的单体与 未标记单体的一定比例(100: 1 - 1: 100)的混合物(Cy5标记单体浓度为0.01 Mmol/L~ 10jLtmol/L)，用扫描仪记录该次延伸中焚光的有无和强弱，通过预先 建立的线性关系确定重复碱基的个数。收集荧光数据后，用核酸外切酶III (1U/ M L )切除掉延伸的焚光碱基dATP,加入碘代修饰dATP ( 0.01 n mol/L ~ 10 n mol/L),在聚合酶的作用下，填充Cy5-dATP原先的位置，然后进行下一步延伸 Cy5-dCTP的过程，如此循环，直到PCR序列确定。实施例3:基于硫代碱基修饰保护往复延伸的放射自显影测序法测定人基因组 p16外显子1序列设计一对针对人基因组p16外显子1的PCR引物，其中一条引物5'端修饰着 M。用PCR引物扩增人样本(血液、组织等)中的p16外显子1序列片段， PCR产物纯化后，通过点样的办法在趁基修饰的基片上形成阵列，氨基与醛基缩 合后，洗去未结合的PCR产物，采用氢氧化钠(2 % , w/v)变性的办法去除未固 定的DNA链，得到单一的模板链，将修饰保护的引物与固定的DNA模板杂交， 并确保模板链的3'端突出5 ~ 6个碱基以上。按照dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP的次序，每次加入一种磷32 (P32)标记的 单体与未标记单体的一定比例(100: 1 - 1: 100)的混合物(P^标记单体浓度为 0.01 p mol/L ~ 10 m mol/L ),用放射自显影技术记录该次延伸中同位素信号的有 无和强弱，通过预先建立的线性关系确定重复碱基的个数。收集荧光数据后，用 核酸外切酶III (1U/mL)切除掉延伸的P32dATP，加入石克代修饰dATP (0.01|u mol/L ~ 10 n mol/L)，在聚合酶的作用下，填充Cy5-dATP原先的位置，然后进 行下一步延伸P32 - dCTP的过程，如此循环，直到PCR序列确定。实施例4:基于双脱氧核糖核苷酸的的硫代碱基修饰保护往复延伸的荧光测序法 测定人基因组p16外显子1序列设计一对针对人基因组p16外显子1的PCR引物，其中一条引物5'端修饰着 M。用PCR引物扩增人样本(血液、组织等)中的p16外显子1序列片段， PCR产物纯化后，通过点样的办法在趁基修饰的基片上形成阵列，氛基与醛基缩 合后，洗去未结合的PCR产物，采用氢氧化钠(2%, w/v)变性的办法去除未固 定的DNA链，得到单一的模板链，将修饰保护的引物与固定的DNA模板杂交， 并确保模板链的3'端突出5 ~ 6个碱基以上。加入四种不同焚光修饰(分别是Cy3, Cy5， FAM, TAMRA)的ddNTP (0.01 |J mol/L ~ 10 (J mol/L)和聚合酶(0.01 m mol/L ~ 10 y mol/L)的混合液，在 引物的3'端进行一个碱基的延伸，通过扫描， 一次性确定模板序列第一个碱基的 信息，然后用核酸外切酶III切除掉延伸的四种不同荧光威基ddNTP,顺序加入 四种硫代碱基(0.01 ja mol/L ~ 10 |a mol/L)与聚合酶(0.01 p mol/L ~ 10 p mol/L) 的混合物，在聚合酶的作用下，填充ddNTP原先的位置，清洗干净后，再加入四 种不同荧光修饰的ddNTP和聚合酶的混合液，进行下一步的延伸过程，如此循 环，直到PCR序列确定。
权利要求
1.一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方法，其特征在于DNA序列的确定是通过基于碱基修饰保护的“标记延伸-切割-保护延伸”测序步骤来实现的，具体测序步骤为a.向待测定DNA模板3′端引入一段20-50碱基长度的公用片段作为测序引物杂交序列，将与公用片段互补的3′端碱基修饰保护的测序引物与固定在固相载体上的待测定DNA模板杂交结合；b.标记延伸向步骤a)所得杂交后的测序DNA模板中，顺序加入或同时加入标记核苷酸单体，在测序引物上进行延伸反应，并根据延伸上的标记核苷酸单体得出待测定DNA模板在该次延伸中的碱基信息；c.切割将步骤b)中延伸上的标记核苷酸单体通过切割方法进行清除；d.保护延伸在经步骤c)处理后的测序引物序列上延伸与步骤c)中被切除碱基相同的的修饰保护核苷酸单体；e.循环上述步骤b)、c)和d)所进行的“标记延伸-切割-保护延伸”过程，由此确定待测定DNA模板的序列。
2. 根据权利要求1所述的一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方 法，其特征在于所述的修饰保护核苦酸单体为使延伸上的单体不被切除 的基团或者粒子的修饰保护的脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸。
3. 根据权利要求2所述的一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方 法，其特征在于所述的修饰保护核苷酸单体为疏代或者碘代修饰保护的 脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸。
4. 根据权利要求1所述的一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方 法，其特征在于所述的标记核苷酸单体为核苷酸单体上标记上直接或间 接检测到的基团或者粒子。
5. 根据权利要求2所述的一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方 法，其特征在于所述的标记核苷酸单体为核苷酸单体上标记着荧光分 子、放射性同位素或者辣根过氧化物酶。
6. 根据权利要求1所述的一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方 法，其特征在于所述的标记核芬酸单体为标记脱氧核糖核脊酸或双脱氧 核糖核苦酸。
7. 根据权利要求1所述的一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方 法，其特征在于所述的切割方法为酶外切法或者化学切割法。
8. 根据权利要求7所述的一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方 法，其特征在于所述切割方法为的利用核酸外切酶的酶外切法或利用氨 水、氢氧化钠或过氧化氢的化学切割法。
9. 根据权利要求1所述的一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方 法，其特征在于所述的根据延伸上的标记核苷酸单体得出待测定DNA模 板在该次延伸中的碱基信息的方法为荧光检测、化学发光检测或者放射 自显影检测。
全文摘要
一种基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方法，DNA序列的确定是通过基于碱基修饰保护的“标记延伸-切割-保护延伸”测序步骤来实现的。该方法能实现原位清除延伸标记物，同时保护引物延伸末端完整、能够逐步合成鉴定未知碱基；逐一的单体延伸测序，延伸一种标记单体，提取信息，然后清除这种单体，加上修饰保护单体，再衍生下一种标记单体，错误延伸的累积效应不严重，序列的判读明了准确，不存在测序长度的限制。
文档编号C12Q1/68GK101153338SQ200710131550
公开日2008年4月2日 申请日期2007年9月14日 优先权日2007年9月14日
发明者白云飞, 罗俊峰, 郑文莉, 陆祖宏 申请人:东南大学