专利名称：：猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶缺失菌株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及猪链球菌2型(Sfr卬tococcMtype2，SS2)次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)缺失菌株的构建和特性研究，属于生物
技术领域：
。二
背景技术：
：猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人畜共患病原菌。可引起青年猪患脑膜脑炎、肺炎、关节炎、败血症及新生仔猪突然死亡，对人主要引起脑膜炎和败血症，严重危及人畜的身体健康。1998年江苏南通和2005年四川资阳引起人猪死亡的病原即为SS2。在SS2中，已发现的毒力因子主要包括溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素(SLY)、neworf2、纤粘蛋白(Fn)、荚膜多糖(CPS)、纤维蛋白原结合蛋白(FBP)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、分泌型核酸(SSnA)和三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。这些毒力因子并不能完全解释SS2的致病机理，从病猪体内分离获得的具有不同基因表型的菌株以及人为构建的各种毒力因子的缺失株也进一步证实这一点。次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)是我们前期工作中发现，较为详尽的研究表明其可以明显改变Hep2细胞膜的通透性，利于菌体穿过细胞膜屏蔽进入细胞内增殖，进而致病。IMPDH是鸟嘌呤核苷酸GTP经典合成途径的限速酶，可以明显改变Hep2细胞周期，导致G1期和S期延长，调控链球菌在宿主机体内的增殖速度和数量。构建IMPDH缺失株，进而研究其对生长特性和致病性的影响。所以对SS2的毒力因子及致病机制的研究是一项很必要的工作，是防制SS2的重点。三、发现内容技术问题本发明目的在于构建猪链球菌2型(S&印tococcM"type2,SS2)次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)缺失株，研究其致病性，进而为研制SS2的基因缺失灭活疫苗奠定基础，为更加安全而有效的防控猪链球菌病提供技术支持。技术方案本发明的具体实施方案如下猪链球菌2型(浙印tococc^^"ype2,SS2)次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)缺失菌株，其特征在于，所说的细菌缺失IMPDH基因中第3943个碱基。构建上述缺失菌株的方法，包括(1)获取IMPDH的IN和IC及cat基因，并串联克隆入simplepMD18-T载体根据GenBank登陆的IMPDH序列，序列号为DQ097893，设计两对特异性引物，以SS2-H菌株制备的DNA为模板，分别扩增IMPDH基因5，端上游和3'端下游654bp和574bp序列，其中IMPDH-NR包括IMPDH基因5，端起始3个碱基，IMPDH-CF包括IMPDH3，端末尾14个碱基IMPDH-NF:5陽taagjQg^aagacagccttgctagcagg陽3IMPDH誦NR:5陽gccggatcccatgttctttcctttct-3IMPDH-CF:5-agagg^^gtctatttgcataaaggag-3IMPDH-CR:5-gaag^tt5aattcacgcggactacacatca-3IMPDH-NF和IMPDH-CR引物两端分别加限制性酶切位点SalI和EcoRI及保护性碱基，IMPDH-NR和IMPDH-CF引物两端加同样的限制性酶切位点BamHI及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°Clmin，56.5°C30s，72°Clmin，共30个循环，最后72'C延伸5min，以双蒸水为阴性对照；根据GenBank登陆的pSET3序列，序列号为AB042431，设计一对特异性引物cat-F和cat-R，以pSET3质粒为模板扩增整个的Cm表达盒cat-F:5-tcaggatcctaattcgatgggttccgagg-3cat-R:5-tctggatcccaccgaactagagcttgatg-3cat-F和cat-R引物两端加同样的限制性酶切位点BamHI及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。PCR反应条件为95。C预变性5min,94°Clmin，54°C30s，72°C1.2min，共30个循环，最后72。C延伸7min，以双蒸水和猪链球菌2型DNA为阴性对照IMPDH-NF和IMPDH-NR、IMPDH-CF和IMPDH-CR、cat-F和cat-R三对引物扩增获得相应大小的目的条带654bp、574bp和1074bp，并分别用1%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的Extractionbuffer后56。C作用10min，转移融化的液体于微型柱子，并6000g离心lmin，弃液体，加入500ul的Extractionbuffer,12000g离心30s60s，再弃液体，加入washbuffer750ul，12000g离心lmin，弃液体，空管12000g离心lmin,转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入30ulElutionbuffer,12000g离心lmin，收集离心液，即为经过纯化的654bp、574bp和1074bp片段，命名为IN、IC和cat片段；将BamHI酶切IN和IC片段各3ul，T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各1.Oul，双蒸水2.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4。C连接过夜；取IN-IC的过夜连接产物4.5ul，与simplepMD18-T0.5ul和solutionI4.5ul一同加入一个eppendorf管，混匀后，16r连接3h，用于转化DH5a感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用五coRI和S"/1双酶切，37C水浴3小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条1228bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-IN-IC重组质粒，胶回收cat片段4.5ul，与simplepMD18-T0.5ul和solutionI4.5ul一同加入一个eppendorf管，混匀后，16。C连接3h，用于转化DH5a感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHI单酶切，37t:水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条1074bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-cat重组质粒；(2)pICI重组敲除质粒的构建pMD18-T-IN-IC重组质粒和温敏质粒pSET4sSalI和EcoRI双酶切各2ul，与T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各1.0ul，双蒸水4.0ul同时加入一个eppendor滑，混匀后，4'C连接过夜，转化DH5a感受态细胞，用壮观霉素Spc板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pSET4s-IN-IC。pSET4s-IN-IC和pMD18-T-cat重组质粒分别用BamHI单酶切，碱性磷酸酶去磷酸化处理，4。C连接，转化DH5a感受态细胞，用壮观霉素(Spc)和氯霉素(Cm)板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pSET4s-IN-cat-IC，即获得阳性基因敲除质粒pICI;(3)pICI电转化SS2-H感受态SS2-H单菌落接种于2ml的THBM，37。C培养16h，50倍稀释继续培养至OD600=0.3~0.4，4'C离心收获菌体用于制备SS2-H感受态。菌体依次用1/10体积的双蒸水、0.3、蔗糖和15e/。甘油的0.3M蔗糖洗涤，最后用0.5ml含有15%甘油的0.3M蔗糖重悬菌泥，并分装5(Vl/管，立即用于转化或冻于-8(TC备用；50吗pICI加入到50^1按上述方法制备的SS2-H感受态中，混匀加到电极杯中电转化，电击后立即加入含有0.3M蔗糖的THBM液lml，首先28'C培养一段时间，然后将培养物移至37。C继续培养5-8h，而后涂布于含有Cm的THBM琼脂板，37。C培养，挑取单菌落进行鉴定；(4)IMPDHm菌株的筛选获得单菌落培养物离心收集菌体，重悬，加入蛋白酶K，42'C2h后，煮沸7min，4'C离心收集上清，即为待检测模板，同时制备SS2-H的模板上清；用cat-F和cat-R引物，设计IMPDH-Fp和IMPDH-Rp，IMPDH-Fw和IMPDH-Rw、Spc-F和Spc-R三对引物IMPDH画Fp:5'-gccgaattcaaatcattag卿aaatcc-3'IMPDH-Rp:5'-cctctcgagaaatagaccggtcaagc-3'SPC-F:5，-cgtggatcccgttcgtgaatacatgttat-3，SPC-R:5，-atggg^Je^gcgcttaccaattagaatga-3'IMPDH-Fw:5'-tgaacttcttatctggactgggta-3'IMPDH-Rw:5'-aggtegcaacttgttcatctgt-3'分别进行PCR扩增，IFw和IRw扩增PCR产物进行测序分析，筛选出重组有cat基因的SS2-H，艮卩IMPDHm;同时用重组IMPDH即rIMPDH蛋白制备的单克隆和多克隆抗体分别与IMPDHm进行蛋白质免疫印迹检测，从蛋白水平进行鉴定，经过基因水平和蛋白水平的鉴定，成功获得IMPDH缺失的SS2-H菌株，即IMPDHm菌株。有益效果本发明的特点和优点如下1、本发明针对新发现的IMPDH，构建了IMPDHm菌株。利用PCR技术，获得IN、cat和IC片断，并依次串连，最终克隆入温敏质粒pSET4s，成功构建pSET4s—IN—cat—IC基因敲除质粒载体，即pICI。2、本发明成功获得IMPDHm菌株。pICI基因敲除质粒经电转化进入SS2菌体内，通过同源重组替换掉impdh基因，经基因水平和蛋白水平筛选和鉴定，成功得到缺失IMPDH的SS2菌株，即IMPDHm菌株。3、本发明对IMPDHm缺失株培养特性、致病性进行了分析，明确了IMPDH具有良好的抗原性。该菌株致病力明显降低而且免疫原性良好，可用于研制SS2的基因缺失灭活疫苗避免了强毒株灭活不彻底可能造成的隐患，为更加安全而有效的防控猪链球菌病提供了技术方法。四图l:IMPDHm构建图谱基因敲除质粒pICI(图上部)与然2-H染色体(图中间)通过同源重组，获得缺失IMPDH的IMPDHm染色体(图下部)。图中黑色长方形图标代表氯霉素(cat基因)，箭头空白部分和空白箭头代表impdh基因。点状箭头和黑白方相间的箭头分别代表Ts复制起始点和壮观霉素(spc基因)。黑色加粗线条代表impdh基因两侧序列。图2:IN、IC和cat基因PCR扩增片段泳道l，DL-2000Marker;泳道2、3禾B4分另ij为cat、IN和IC的PCR片段。图3:pSET4s-IN-IC的SalI和EcoRI双酶切鉴定图谱泳道I，DL-2000Marker;泳道2，pSET4s空载体;泳道3~5，pSET4s-IN-IC。图4:pSET4s-IN-cat-IC的SalI和EcoRI双酶切鉴定图谱图5:IMPDHm鉴定图谱图5-l:IMPDHPCR扩增图谱泳道l,DL-2000Marker;泳道2，SS2-H阳性对照；泳道34，MPDHm。图5-2:SpcPCR扩增图谱:泳道l，DL-2000Marker;泳道2，pSET4s阳性对照;泳道3~4，IMPDHm。图5-3:CatPCR扩增图谱泳道l,DL-2000Marker;泳道2,pSE丁3阳性对照泳道3，5，IMPDHm;泳道4，阴性的IMPDHm。图6:IMPDHm免疫转印鉴定图泳道l，蛋白质Marker;泳道2，SS2-H阳性对照；泳道3~5，IMPDHm。五具体实施例方式1、pSET4s-IN-cat-IC重组敲除质粒的构建，构建过程如下(1)获取1MPDH的IN和IC及cat基因，并串联克隆入simplepMDl8-T载体根据GenBank登陆的IMPDH序歹ij，序列号为DQ097893，设计两对特异性引物，以SS2-H菌株(倪艳秀，等，猪链球菌2型SS2-1和SSrH株的培养稳定性检测，屮国兽医科技，2002，32(4):29~30.)制备的DNA为模板，分别扩增IMPDH基因5'端上游和3'端下游654bp和574bp序列。其中IMPDH-NR包括IMPDH基因5'端起始3个碱基，IMPDH-CF包括IMPDH3'端末尾14个碱基。IMPDH-NF:5-taagtcgacaagacagccttgctagcagg-3IMPDH隱NR:5-gcc改atcccatgttctttcctttct-3IMPDH-CF:5-agagg§^gtctatttgcataaaggag-3IMPDH-CR:5-gaagaattcaattcacgcggactacacatca—3IMPDH-NF和IMPDH-CR引物两端分别加限制性酶切位点SalI和EcoRI及保护性碱基，IMPDH-NR禾卩IMPDH-CF引物两端加同样的限制性酶切位点BamHI及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。PCR反应条件为95。C预变性5min，94°Clmin，56.5°C30s，72°Clmin，共30个循环，最后72。C延伸5min，以双蒸水为阴性对照(图2)。根据GenBank登陆的pSET3序列，序列号为AB042431，设计一对特异性引物cat-F禾口cat-R，以pSET3质丰立(TsutomuSekizaki,etal.ConstructionandCharacterizationofStreptococcussuis-EscherichiacoliShuttleCloningVectors,Plasmid，2001,45:101-113.)为卞莫丰反扩增整个的Cm表达盒。cat-F:5-tcaggatcctaatt卿tgggttc卿gg-3cat-R:54ctggatcccac卿actagagcttgatg-3cat-F和cat-R引物两端加同样的限制性酶切位点BamHI及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。PCR反应条件为95。C预变性5min，94°Clmin，54°C30s，72°C1.2min，共30个循环，最后72'C延伸7min，以双蒸水为阴性对照(图2)。IMPDH誦NF和IMPDH-NR、IMPDH-CF和IMPDH-CR、cat-F和cat-R三对引物扩增获得相应大小的目的条带654bp、574bp和1074bp，并分别进行切胶纯化。纯化的IN和ICPCR产物经BamHI37。C作用2h，切胶纯化后用T4DNA连接酶《C连接10h。取连接混合物4.5pl与simplepMD18-T0.5|iil和SolutionI5.0|_il，16。C连接2h，转化DH5oc感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用SalI和EcoRl双酶切，37'C水浴3小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条1228bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-IN-IC重组质粒。同时也将纯化的catPCR产物4.5|al与simplepMD18-T0.5(^1和SolutionI5.0^1，混匀后，16。C连接2h，转化DH5a感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHl单酶切，37"C水浴1.5小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条1074bp的条带出现，将酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-cat重组质粒。(2)pSET4s-IN-cat-IC重组敲除质粒的构建将已测序鉴定的pMD18-T-IN-IC重组质粒和温敏质粒pSET4s(TsutomuSekizaki,etal.ThermosensitiveSuicideVectorsforGeneReplacementinStreptococcussuis,Plasmid,2001，46:101-113.)用SalI和EcoRI双酶切，电泳回收目的片段用T4DNA连接酶进行连接，转化DH5a感受态细胞，用壮观霉素(Spc)板筛选，挑取细菌培养，提取质粒进行双酶切鉴定，将见到1228bp的目的条带(图3)，阳性重组质粒命名为pSET4sp-IN-IC。pSET4sp-IN-IC和pMD18-T-cat重组质粒分别用BamHI单酶切，切胶纯化后片段用碱性磷酸酶(CIAP)处理，5(TC作用2h，再次切胶纯化后用T4DNA连接酶进行连接，4'C连接10h，转化DH5a感受态细胞用壮观霉素(Spc)和氯霉素(Cm)板筛选，挑取细菌培养，提取质粒进行双酶切鉴定，将见到2302bp的目的条带(图4)，阳性重组质粒命名为pSET4sp-IN-cat-IC，即获得阳性重组敲除质粒pSET4sp-IN-cat-IC。2、IMPDH缺失的SS2-H(IMPDHm)的构建，过程如下(1)pSET4s-IN-cat-IC电转化SS2-H感受态SS2-H单菌落接种于2ml的THBM(含有2%MEM的THB)，37'C培养16h，50倍稀释继续培养至OD600=0.3~0.4(约3h)，4'C离心收获菌泥。而后依次用1/10(10ml)体积的双蒸水、0.3M的蔗糖分别洗涤2次，再用含有15。/。甘油的0.3M蔗糖洗涤1次。最后用0.5ml含有15。/o甘油的0.3M蔗糖重悬菌泥，并分装50(al/管，立即用于转化或冻于-80。C备用。50吗(约5pl)pSET4sp-IN-cat-IC加入到50(^1按上述方法制备的SS2-H感受态中，混匀加到电极杯中电转化，条件为2.0kV，25pF，200Q，4.3ms左右。电击后立即加入含有0.3M蔗糖的THBM液lml，28。C培养lh后加入Spc和Cm至工作浓度100pg/ml和5pg/ml，继续培养直到OD6Qf0.3(约2h)，而后再用含有12.5吗/mlCm的THBM进行1000倍稀释，28'C继续培养4h,然后将培养物移至37'C继续培养5h以上(一般8h)，而后涂布于含有Ctn的THBM琼脂板，37'C培养，挑取单菌落进行鉴定。(2)IMPDHm的筛选和鉴定单菌落培养物离心收集菌泥，pI^8.0TE重悬，加入20mg/ml蛋白酶K3pl，42°C2h后，煮沸7min，4'C离心收集上清，即为待检测模板，同时制备SS2-H的模板上清。用cat-F和cat-R引物，设计IMPDH-Fp和IMPDH-Rp(7951bpofimpdhORF)，IMPDH匿Fw和IMPDH-Rw(包含整个impdhORF，ATG上游多73bp，TAA下游多241bp)、Spc-F和Spc-R(扩增整个基因表达盒)三对引物分别进行PCR扩增，IFw和IRw扩增PCR产物进行测序分析，筛选出重组有cat基因的SS2-H，艮HMPDHm(图5)。同时Westernblotting方法从蛋白水平进行鉴定。单菌落培养物离心收集菌泥，1X上样缓冲液重悬，煮沸，上清SDS-PAGE电泳，并电转印到NC膜上，IMPDHm不能和IMPDH的多抗和单抗反应(图6)。经过基因水平和蛋白水平的鉴定，成功获得IMPDH缺失的SS2-H，即IMPDHm。IMPDH-Fp:5'-gccg^^aaatcattaggaaaaatcc-3'IMPDH-Rp:5'-cctctcgagaaatagaccggtcaagc-3'SPC-F:5'-cgtggatcccgttogtgaatacatgttat-3'SPC-R:5'-atggg§^gcgcttaccaattagaatga-3'IMPDH-Fw:5'-tgaacttcttatctggactgggta-3'IMPDH-Rw:5，-aggtcgcaacttgtteatctgt-3，3、IMPDHm的培养特性研究，如下所述IMPDHm单菌落接种于5mlTHBM培养液中，过夜培养。而后取16h培养物以1%的比例(约1.5X109CFU)再次接种于100ml的新鲜THBM中，培养30h，分别于2h，4h，6h，8h，10h，12h，16h，20h,24h和30h取5ml菌液测定OD540，以监测细菌的生长曲线(表1)。同时对不同时间的培养物测定pH，以监测细菌的酸碱变化(表1)。同时以SS2-H作对照，比较二者的异同。IMPDHm较亲本株SS2-H生长速度减慢，并且菌数生长高峰维持时间缩短。同时，IMPDHm在生长过程中产酸量大大减少，6h后pH基本维持在一个稳定的水平，对葡萄糖、麦芽糖、水杨素、甘露糖、乳糖和棉子糖的发酵利用能力有较明显降低。表l:亲本株SSrH与缺失株IMPDHm培养特性比较培养时间Oh2h4h6h8h10h12h16h20h24h30hIMPDHm0a0.0110.042U641.4391.8911.9461.9091.8011.6191.501OD540SSrH00.0230.0921.7521.9262.2032.4092.3772.3302.1811.90pHIMPDHm8,208.208.118.047.958.007.86譜7.997.987.76SS2-H8.20譜7.897.216.866.876.846.866.866.826.65a:生理盐水对照4、IMPDHm的致病性研究，如下所述(1)对BALB/c鼠的致病性选择46周龄的BALB/c小鼠，分成四组(A、B、C和D)，4只/组。A、B、C和D四组分别腹腔注射1.5X1(^CFU，1.0X109CFU、5.0X108CFl^tH.OX108CFU的IMPDHm，观察并记录小鼠的精神状态，死亡情况，统计其半数致死量(表2)。结果表明，IMPDHm对BALB/c小鼠致病力降低，半数致死量为8.3X108CFU，而亲本株(SS2-H)半数致死量为3.36X1()8CFU。表2:IMPDHm与亲本株SS2-H致病性比较(BALB/C小鼠)剂量1.5X109c.f.u./ml1.0X109c.f.u./ml5.0)><108c.f.u./ml1.0X108c.f.u./ml组别IMPDHm4/4a2/41/40/4SS2-H4/44/43/40/4*a代表死亡数/总数(2)对家兔的致病性选择体重为2.0Kg的新西兰家兔，分成4组(A、B、C、D、E和F)，4只/组。A、B、C、D、E禾口F六组分别耳静脉注射3.0X109CFU,1.5X109CFU，l.OX109CFU，5.0X108CFU，l.OX1()8CFU和5.0X107CFUIMPDHm，观察并记录家兔的精神状态，体温和死亡情况，统计其半数致死量(表3)。结果表明，对家兔，IMPDHm基本丧失了致病力，只有一过性体温升高，体温升至4041.5'C，维持4070h之后恢复正常(38.5t:左右)。而亲本株攻毒家兔体温升至4142。C，于攻毒20h左右开始发生死亡，A-D组72h之内全部死亡。SS2-H的半数致死量为1.0X108CFU。表3:IMPDHm与亲本株SS2-H致病性比较(新西兰家兔)c.f.u./ml剂量组别5X1071.0X10s5.0X1081.0X1091.5X1093.0X109IMPDHm0/40/40/40/40/40/4SSrH0/42/44/44/44/44/4*a代表死亡数/总数(3)对仔猪的致病性选择断奶仔猪，分成2组(A和B)，4只/组。A、B两组分别耳静脉注射IMPDHm(A)2.0X109CFU，(B)2.0X1()8CFU两个剂量，观察并记录家兔体温和死亡情况，统计其半数致死量，同时设置相应的SS2-H攻毒组(表3)。结果表明，对仔猪，IMPDHm基本丧失了致病力，只有体温升高，体温升至4042.3'C，个别猪(2/8)有关节炎症状，体温维持72h左右恢复正常G8.5t:左右)，关节炎症状也逐步的缓解和消除。而亲本株攻毒仔猪体温升至4142。C，于攻毒20h左右开始发病，4872h左右A组全部死亡，而B组50%死亡。表3:IMPDHm与亲本株SS2-H致病性比较(仔猪)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*a代表死亡数/发病数/总数权利要求1、猪链球菌2型(Streptococcussuistype2，SS2)次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)缺失菌株，其特征在于，所说的细菌缺失IMPDH基因中第3～943个碱基。2、构建如权利要求1所述缺失菌株的方法，该方法包括(1)获取IMPDH的IN和IC及cat基因，并串联克隆入simplepMDl8-T载体根据GenBank登陆的IMPDH序歹U，序列号为DQ097893，设计两对特异性引物，以SS2-H菌株制备的DNA为模板，分别扩增IMPDH基因5'端上游和3，端下游654bp和574bp序列，其中IMPDH-NR包括IMPDH基因5'端起始3个碱基，IMPDH-CF包括IMPDH3，端末尾14个碱基IMPDH-NF:5-taag^g§￡aagacagccttgctagcagg-3IMPDH-NR:5-gccggatcccatgttctttectttct-3IMPDH-CF:5-agagg§^gtctatttgcataaaggag-3IMPDH-CR:5-gaagaattcaattcacgcggactacacatca—3IMPDH-NF和IMPDH-CR引物两端分别加限制性酶切位点SalI和EcoRI及保护性碱基，IMPDH-NR和IMPDH-CF引物两端加同样的限制性酶切位点BamHI及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃lmin，56.5℃30s，72℃lmin，共30个循环，最后72℃延伸5min，以双蒸水为阴性对照；根据GenBank登陆的pSET3序列，序列号为AB042431，设计一对特异性引物cat-F和cat-R，以pSET3质粒为模板扩增整个的Cm表达盒cat-F:5陽tcaggatccteattcgatgggttccgagg-3cat-R:5-tctggatcccaccgaactagagcttgatg-3cat-F和cat-R引物两端加同样的限制性酶切位点BamHI及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃lmin，54。C30s，72℃1.2min，共30个循环，最后72r延伸7min，以双蒸水和猪链球菌2型DNA为阴性对照IMPDH-NF和IMPDH-NR、IMPDH-CF和IMPDH-CR、cat-F和cat-R三对引物扩增获得相应大小的目的条带654bp、574bp和1074bp，并分别用1%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的Extractionbuffer后56℃作用10min，转移融化的液体于微型柱子，并6000g离心lmin，弃液体，加入500ul的Extractionbuffer,12000g离心30s60s，再弃液体，加入washbuffer750ul，12000g离心lmin，弃液体，空管12000g离心lmin，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入30ulElutionbuffer,12000g离心lmin，收集离心液，即为经过纯化的654bp、574bp和1074bp片段，命名为IN、IC和cat片段；将BamHI酶切IN和IC片段各3ul，T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各1.Oul，双蒸水2.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜；取IN-IC的过夜连接产物4,5ul，与simplepMD18-T0.5ul和solutionI4.5ul—同加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接3h，用于转化DH5a感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用￡coRI和I双酶切，37℃水浴3小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条1228bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-IN-IC重组质粒，胶回收cat片段4.5ul，与simplepMD18-T0.5ul和solutionI4.5ul一同加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接3h，用于转化DH5a感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHI单酶切，37'C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条1074bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-cat重组质粒；(2)pICI重组敲除质粒的构建pMD18-T-IN-IC重组质粒和温敏质粒pSET4sSalI和EcoRI双酶切各2ul，与T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各1.0ul，双蒸水4.0ul同时加入一个eppendor滑，混匀后，4℃连接过夜，转化DH5a感受态细胞，用壮观霉素Spc板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pSET4s-IN-IC。pSET4s-IN-IC和pMD18-T-cat重组质粒分别用BamHI单酶切，碱性磷酸酶去磷酸化处理，4℃连接，转化DH5a感受态细胞，用壮观霉素Spc和氯霉素Cm板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pSET4s-IN-cat-IC,即为获得的阳性基因敲除质粒pICI;(3)pICI电转化SS2-H感受态SS2-H单菌落接种于2ml的THBM，37℃培养16h，50倍稀释继续培养至OD600=0.30.4，4'C离心收获菌体用于制备SS2-H感受态。菌体依次用1/10体积的双蒸水、0.3M蔗糖和15%甘油的0.3M蔗糖洗涤，最后用0.5ml含有15%甘油的0.3M蔗糖重悬菌泥，并分装50pl/管，立即用于转化或冻于-8℃备用；50|^g的pICI加入到50nl按上述方法制备的SS2-H感受态中，混匀加到电极杯中电转化，电击后立即加入含有0.3M蔗糖的THBM液lml，首先28℃培养一段时间，然后将培养物移至37℃继续培养5-8h，而后涂布于含有Cm的THBM琼脂板，37℃培养，挑取单菌落进行鉴定；(4)IMPDHm菌株的筛选获得单菌落培养物离心收集菌体，重悬，加入蛋白酶K，42℃2h后，煮沸7min，4℃离心收集上清，即为待检测模板，同时制备SS2-H的模板上清；用cat-F和cat-R引物，设计IMPDH-Fp和IMPDH-Rp，IMPDH-Fw和IMPDH-Rw、Spc-F和Spc-R三对引物IMPDH-Fp:5'-gccg§g￡^aaatcattaggaaaaatcc-3，IMPDH-Rp:5，-cctctcgagaaatagaccggtcaagc-3，SPC-F:5，-cgtggatcccgttcgtaatacatgttat-3，SPC-R:5，-atgggatccgcttaccaattagaatga-3'IMPDH-Fw:5'-tgaacttcttatctggactgggta-3'IMPDH-Rw:5，-aggtcgcaacttgttcatctgt-3'分别进行PCR扩增，IFw和IRw扩增PCR产物进行测序分析，筛选出重组有cat基因的SS2-H，即IMPDHm;同时用重组IMPDH即rIMPDH蛋白制备的单克隆和多克隆抗体分别与IMPDHm进行蛋白质免疫印迹检测，经过基因水平和蛋白水平的鉴定，成功获得IMPDH缺失的SS2-H菌株，即IMPDHm菌株。全文摘要本发明涉及次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)猪链球菌2型(S5<sub>2</sub>)缺失株，属于生物
技术领域：
。包括设计引物，获取impdh基因上下游序列(IN和IC)和氯霉素(cat)基因完整表达盒，基因经串联并克隆入simplepMD18-T载体，串联片段经测序后再经酶切后克隆入温敏质粒pSET4s载体，构建重组基因敲除质粒pSET4s-IN-cat-IC，转化入SS<sub>2</sub>。IMPDHm培养特性、生化特性和致病性较亲本菌株SS<sub>2</sub>有明显的不同。本发明构建了IMPDH缺失菌株(IMPDHm)，可用于研制SS<sub>2</sub>的基因缺失灭活疫苗，为更加安全而有效的防控猪链球菌病提供技术方法。文档编号C12N1/21GK101173243SQ20071013446公开日2008年5月7日申请日期2007年10月23日优先权日2007年10月23日发明者何孔旺,俞正玉,倪艳秀,刘亚彬,吕立新,萍周,周俊明,张雪寒,沈江萍,郭容利申请人:江苏省农业科学院;南京天邦生物科技有限公司