专利名称：华法林中国人群个体用药剂量的确定方法
技术领域：
本发明涉及一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法。
背景技术：
缺血性脑卒中是心房颤动(房颤)患者死亡最主要的原因，抗凝治疗是房 颤治疗策略中重要的一环，华法林是目前明确唯一可以降低房颤患者卒中和栓 塞风险、降低死亡率的药物。然而华法林的抗凝治疗，尤其在治疗的初始阶段， 容易出现抗凝不当，从而导致出血不良事件的发生，这往往是由于忽视了个体 变异对药物的影响，没有正确的估计药物剂量来预防出血等不良事件的发生。 由于出血等风险以及经常监测INR所需的代价，因此有人估计大约有一半的 心房颤动的患者没有用华法林抗凝治疗。
发明内容
本发明目的是提供一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，利用个 体患者的年龄、体重以及VKORCl(-1639G〉A)和CYP2C9的基因型导出个体 用药剂量，从而能够帮助临床医生更好的合理应用华法林，减少出血不良事件 发生的机会，提高用药的安全性，提高治疗的效果。
本发明的技术方案是 一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，包 括以下步骤
(1) 采集病人组织并进行基因组DNA提取；
(2) 对提取的基因组DNA进行PCR扩增；
(3) 以限制性核酸内切酶Mspl进行VKORCl(-1639G〉A)扩增产物消化；
(4) 以限制性核酸内切酶Nsil进行CYP2C9扩增产物消化；
(5) 用琼脂糖凝胶电泳分别对步骤(3)和步骤(4)所得的酶切产物进 行观察和分析，分别得到VKORCl(-1639G〉A)和CYP2C9的基因型。
(6) 将所得病人的VKORCl(-1639G〉A)和CYP2C9的基因型以及病人的 年龄和体重带入下面的回归方程得出华法林的用药剂量
D=6.22 — O.Ollx(年龄)+ 0'017x(体重)一 0.775x(CYP2C9)— 3.397x(VKORCl誦x1)—4.803x(VKORCl-x2);
其中D为华法林的用药剂量，年龄输入岁数，体重输入公斤数，CYP2C9 基因型如果为*1/*3型输入1，如果为*1/*1型输入0， VKORC1基因型如果为 AA型，在VKORCl-xl中输入0，在VKORCl-x2中输入1，如果为GA型， 在VKORCl-xl中输入l,在VKORCl-x2中输入O，如果为GG型，VKORCl-xl 和VKORCl-x2均输入0。
本发明更为详细的技术方案是 一种华法林中国人群个体用药剂量的确定 方法，包括以下步骤
(1) 首先对病人进行血样采集，再取外周抗凝血2ml，采用Wizard⑥基 因组DNA纯化试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作抽提DNA;
(2) 对提取的基因组DNA进行PCR扩增；PCR反应体系体积为25fU， 基因组DNA 0.2^g ， 10XPCR缓冲液2.5jd ， 2.5mmol/L dNTP 2pl ， 25mmol/LMgcl2 1.5^1，引物PilOpmol，引物P2l0pmo1， Taq聚合酶(5U/L) 0.15^1; PCR反应条件为95。C预变性5 min， 94°C 30s， 59°C 20s, 72°C 30s， 共 35个循环，72 °C延伸 7 min 。 VKORC1 基因正向引物为 5'隱CCAGCAGGAGAGGGAAATA-3'， 反 向 弓l 物为 5,-TTTGG-ACTACAGGTGCCT-3' ; CYP2C9 基 因 正 向 引 物 为 5'-TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3' ， 反 向 弓l 物 为 5'-AAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3'。
(3) 以限制性核酸内切酶Mspl进行VKORCl(-1639G〉A)扩增产物消化 取5^1聚合酶链式反应(PCR)产物，缓冲液(buffer) 2pl，去离子水(dH20) 8^1， Msp I 10U， 37。C水浴过夜。
(4) 以限制性核酸内切酶Nsil进行CYP2C9扩增产物消化取5jUPCR 产物，buffer 2^1， dH20 8^1， Nsil 10U， 37。C水浴过夜；
(5) 用琼脂糖凝胶电泳分别对步骤(3)和步骤(4)所得的酶切产物进 行观察和分析，分别得到VKORCl(-1639G〉A)和CYP2C9的基因型取16jil 酶切产物加入2%琼脂糖凝胶负极端的加样孔，以溴酚蓝为指示剂，溴化乙锭 (EB)为染色剂，在80V电压下电泳1小时，在紫外线灯下观察带型。
(6) 将所得病人的VKORCl(-1639G〉A)和CYP2C9的基因型以及病人的 年龄和体重带入下面的回归方程得出华法林的用药剂量
D=6.22 — 0.011x(年龄)+ 0.017x(体重)_ 0.775x(CYP2C9)— 3.397x(VKORCl-xl)—4.803x(VKORCl-x2);
其中D为华法林的用药剂量，年龄输入岁数，体重输入公斤数，CYP2C9
基因型如果为*1/*3型输入1，如果为*1/*1型输入0， VKORC1基因型如果为 AA型，在VKORCl-xl中输入0，在VKORCl-x2中输入1，如果为GA型， 在VKORCl-xl中输入l，在VKORCl-x2中输入O，如果为GG型，VKORCl-xl 和VKORCl-x2均输入0。
本发明中所用的回归方程的得出过程为
首先选取多个患者，其选择标准为已明确为瓣膜置换术后、持续性心房颤 动-以及深静脉血栓、旆栓塞等稳定服用华法林大于3个月的患者，目标INR 为1.5 3.0。(排除标准明确的出血性疾病，如活动性溃疡、支气管扩张等； 肝、肾功能不全；血液病，凝血系统障碍。)这里共选取了 178例临床使用华 法林的患者，包括瓣膜置换术后116例、持续性房颤51例、深静脉血栓4例、 肺栓塞7例。其中男性74例，女性104例，男性中位年龄57岁(17 88)， 女性的中位年龄53岁(15 82)。目标INR在1.5 2.0之间为110例，在2.0 2.5之间为49例，在2.5 3.0之间为19例。VKORCl-1639G>A基因型检测 有149个病人为突变纯合子AA型，28个病人为杂合子GA型，l个病人为纯 合子GG型。CYP2C9基因型检测有162个病人为*1/*1型，16个病人为杂合 子*1/*3型。
其次，从门诊及病房采集血样品进行INR、 CYP2C9以及VKORC1基因
型的检测，并观察年龄、性别、身高、体重以及体表面积对华法林用量及INR 影响情况。
最后，进行统计学分析将所有数据用SPSS统计软件处理，非参数 Spearman等级相关用于分析华法林剂量与性别、年龄、体重、身高、体表面 积以及INR的关系。不同基因型之间华法林剂量的比较用两样本t检验，多 元线形回归用于分析华法林剂量与其它变量之间的关系，从而产生一个新的给 药方案。结果用均数士标准差表示，检验水准ci-0.05。
结果表明，性别对华法林使用剂量没有显著性的影响，女性的平均使用剂 量为2.01mg/d，男性的平均使用剂量为2.02mg/d，两者比较差异没有统计学 意义(P>0.05)。非参数Spearman相关分析显示，华法林剂量与年龄呈显著 的负相关(r = -0.35; P <0.01)，与体重(r = 0.27; P <0.01)、身高(r = 0.21; P<0.01)、体表面积呈正相关(r = 0.27; P <0.01)。 INR值与任一变量均不相 关。VKORC1 (-1639G>A) GA+GG组，华法林平均剂量明显高于AA组(前 者为(3.32± 1.02) mg/d ，而后者为(1.76士 0.57)mg/d， p<0.01,)。 CYP2C9*1/*1
型患者华法林平均剂量高于杂合子*1/*3型患者(前者为(2.06 ±0.83) mg/d; 后者为(1.55 ± 1.32 )mg/d， p<0.05 )。其中基因型为1*/1*和AA的患者137人， 其平均剂量为1.81 mg/d,基因型为1*/1*和GA型的患者25人，其平均剂量 为3.37 mg/d，基因型为1*/3*和AA型的患者12人，其平均剂量为1.15 mg/d， 基因型为1*/3*和GA型的患者3人，其平均剂量为1.84mg/d，基因型为1*/3* 和GG型的患者1人，其使用剂量为6.25mg/d。
多元舞形回归分析提示年龄、体重以及VKORC1基因型分别解释了约 8.4%、 6.3%、 49.4%的个体间剂'量差异，而身高以及体表面积对华法林使用 剂量影响不显著(P>0.05),所以包括年龄、体重、CYP2C9以及VKORC1基 因型的多变量模型能够最好的估计华法林剂量(r2 = 0.628; P<0.01),由此推 导得到回归方程。
本发明的优点是利用个体患者的年龄、体重以及VKORCl(-1639G>A) 和CYP2C9的基因型方便的推导出每个患者个体的用药剂量，从而能够帮助 临床医生更好的合理应用华法林，提前获得INR合适水平，减少出血不良事 件发生的机会，提高用药的安全性，提高治疗的效果。
图1为VKORC1基因-1639G〉A多态性酶切图； 图2为CYP2C9多态性酶切图。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
实施例 一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，包括以下步骤
(1) 首先对病人进行血样采集，再取外周抗凝血2ml，采用Wizard⑧基 因组DNA纯化试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作抽提DNA;
(2) 对提取的基因组DNA进行PCR扩增；PCR反应体系体积为25^11， 基因组DNA 0.2pg , 10XPCR缓冲液2.5pl ， 2.5mmol/L dNTP 2^1 ， 25mmol/LMgcl2 1.5fd，引物P, lOpmol，引物P2 lOpmol， Taq聚合酶(5U/L) 0.15jil; PCR反应条件为95。C预变性5 min， 94°C 30s， 59°C 20s， 72。C 30s， 共35个循环，72 。C延伸 7 min 。
VKORC1 基因正向引物为 5'隱CCAGCAGGAGAGGGAAATA-3'， 反 向 弓l 物为 5'誦TTTGG誦 ACTACAGGTGCCT-3' ; CYP2C9 基 因 正 向 弓l 物 为 5誦TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3' ， 反 向 弓l 物 为
5'-AAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3',引物设计参照有关文献，由大连宝生 工程公司合成。
(3) 以限制性核酸内切酶Mspl进行VKORCl(-1639G〉A)扩增产物消化 取5pl聚合酶链式反应(PCR)产物，缓冲液(buffer) 2^1，去离子水(dH20) 8^1， Msp I IOU， 37。C水浴过夜。；
(4) 以限制性核酸内切酶Nsil进行CYP2C9扩增产物消化取5plPCR 产物，buffer 2fd, dH20 8fU， Nsil IOU， 37。C水浴过夜；
(5)用琼脂糖凝胶电泳分别对步骤(3)和步骤(4)所得的酶切产物进行 观察和分析，分别得到VKORC1(-16390A)和CYP2C9的基因型取16pl酶切产 物加入2%琼脂糖凝胶负极端的加样孔，以溴酚蓝为指示剂，溴化乙锭(EB)为染
色剂，在80V电压下电泳1小时，在紫外线灯下观察带型。
其中基因型的鉴定如图1和图2所示，经PCR扩增后VKORC1 (-1639G 〉A)基因目的片段大小为290bp， CYP2C9基因目的片段大小为131bp 。根 据酶切情况，VKORC1 (-1639G〉A)基因型有3种，如图1所示(其中M : DNA mark; 1: GA基因型；2、 3: AA基因型；4: GG基因型)纯合子 A/A型有290 —条带，杂合子G/A有290、 168、 122三条带，野生型G/G为 168、 122两条带；CYP2C9基因型有两种，如图2所示(其中M : DNA mark; 1、 2、 4: CYP2C9*1/*1型；3、 5: CYP2C9*l/*3型)，CYP2C9*1/*1有110 和21两条带，CYP2C9*l/*3型有131、 110和21三条带。
(6)将所得病人的VKORCl(-1639G〉A)和CYP2C9的基因型以及病人的 年龄和体重带入下面的回归方程得出华法林的用药剂量
D-6.22 — 0.011x(年龄)+ 0.017x(体重)一 0.775x(CYP2C9) — 3.397x(VKORCl誦x1) —4.803x(VKORCl-x2);
其中D为华法林的用药剂量，年龄输入岁数，体重输入公斤数，CYP2C9 基因型如果为*1/*3型输入1，如果为*1/*1型输入0， VKORCl基因型如果为
AA型，在VKORCl-xl中输入0，在VKORCl-x2中输入1，如果为GA型， 在VKORCl-xl中输入l，在VKORCl-x2中输入O，如果为GG型，VKORCl-xl 和VKORCl-x2均输入0。
如一个70公斤80岁的人，CYP2C9*l/*3和VKORC1 AA基因型，将 以上数据带入回归方程，则可以估算到其所需的华法林剂量为0.95 mg。
采用本发明所提出的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，利用个体 患者的年龄、体重以及VKO'RCl(-1639G〉A)和CYP2C9的基因型方便的推导 出每个患者个体的用药剂量，从而能够帮助临床医生更好的合理应用华法林， 提前获得INR合适水平，减少出血不良事件发生的机会，提高用药的安全性， 提高治疗的效果。
权利要求
1.一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，包括以下步骤(1)采集病人组织并进行基因组DNA提取；(2)对提取的基因组DNA进行PCR扩增；(3)以限制性核酸内切酶MspI进行VKORC1(-1639G＞A)扩增产物消化；(4)以限制性核酸内切酶NsiI进行CYP2C9扩增产物消化；(5)用琼脂糖凝胶电泳分别对步骤(3)和步骤(4)所得的酶切产物进行观察和分析，分别得到VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型；(6)将所得病人的VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型以及病人的年龄和体重带入下面的回归方程估算出华法林的用药剂量D＝6.22-0.011×(年龄)+0.017×(体重)-0.775×(CYP2C9)-3.397×(VKORC1-x1)-4.803×(VKORC1-x2)；其中D为华法林的用药剂量，年龄输入岁数，体重输入公斤数，CYP2C9基因型如果为*1/*3型则输入1，如果为*1/*1型则输入0；VKORC1基因型如果为AA型，在VKORC1-x1中输入0，在VKORC1-x2中输入1，如果为GA型，在VKORC1-x1中输入1，在VKORC1-x2中输入0，如果为GG型，VKORC1-x1和VKORC1-x2均输入0。
2. 根据权利要求1所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特 征在于所述步骤(1)中基因组DNA的提取为首先对病人进行血样采集，取 外周抗凝血2ml，采用WizardS基因组DNA纯化试剂盒，严格按照试剂盒说明 书操作抽提DNA。
3. 根据权利要求l所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特 征在于所述步骤(2)中PCR扩增采取PCR反应体系体积为25>U，基因组 DNA 0.2jig， 10XPCR缓冲液2.5pl, 2.5mmol/L dNTP 2^1， 25mmol/LMgcl2 1.5^1， 引物P,10pmo1，引物P2l0pmo1， Taq聚合酶(5U/L) 0.15^1; PCR反应条件为 95。C预变性5min， 94°C 30s， 59°C 20s， 72。C 30s，共35个循环，72。C延伸7 min。
4. 根据权利要求3所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特 征在于VKORC1基因正向引物为5'-CCAGCAGGAGAGGGAAATA-3'，反 向引物为 5'-TTTGGACTACAGGTGCCT-3' ; CYP2C9基因正向引物为 5-TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3'， 反 向 弓l 物 为 5'-AAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3，。
5. 根据权利要求1所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特 征在于所述步骤(3)取5pl聚合酶链式反应(PCR)产物，缓冲液(buffer) 2fU，去离子水(dH20) 8jU, MspI10U, 37。C水浴过夜。
6. 根据权利要求1所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特 征在于所述步骤(4)取5^1 PCR产物，缓冲液2pl，去离子水8^1, Nsil 10U, 37'C水浴过夜。
7. 根据权利要求1所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特 征在于所述步骤(5)取16pl酶切产物加入2%琼脂糖凝胶负极端的加样孔， 以溴酚蓝为指示剂，溴化乙锭(EB)为染色剂，在80V电压下电泳1小时，在紫 外线灯下观察带型。
全文摘要
本发明公开了一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，先对患者提取基因组DNA并进行基因型检测，然后将个体患者的年龄、体重及VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型方便的推导出每个患者个体的用药剂量，从而能够帮助临床医生更好的合理应用华法林，提前获得INR合适水平，减少出血不良事件发生的机会，提高用药的安全性，提高治疗的效果。
文档编号C12Q1/68GK101182573SQ200710135388
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月8日 优先权日2007年11月8日
发明者剑 杨, 沈振亚, 缪丽燕, 蒋文平, 黄晨蓉 申请人:苏州大学附属第一医院