专利名称：：基因工程改造的蓝细菌及其生产乙醇的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物能源
技术领域：
，具体涉及一种蓝细菌集胞藻突变株、筛选蓝细菌集胞藻突变株的方法、导入了编码丙酮酸脱羧酶多核苷酸和/或硝酸盐诱导的启动子序列的质粒表达载体、导入了编码丙酮酸脱羧酶多核苷酸和/或硝酸盐诱导的启动子序列的上述集胞藻突变株、以及上述突变株在制备乙醇中的应用。
背景技术：
：自250多年前英国的工业革命以来，人类社会的发展便与能源的使用息息相关。随着全球经济的不断发展，以石油，煤炭和天然气为主的化石能源的开发和使用问题显得日益突出其一，石油，煤炭和天然气等都是不可再生的资源，不久的将来它们会被消耗枯竭；其二，美国等发达国家对进口石油的依赖，使得世界局部地区的动荡即可产生油价的巨大变化，直接影响到经济发展、社会稳定、甚至是国家安全；其三，使用传统化石能源会排放大量二氧化碳等温室气体，造成严重的环境污染和全球性的气候变化。所以，现在能源问题和环境问题已成为国际高峰会谈最重要的议题。为了保障能源安全，保护环境，走可持续发展的道路，替代能源和可再生能源获得了各国越来越多的重视。可再生能源中，生物质能的发展最为迅速。生物质(Biomass)主要指的是自然界中的各类植物，包括农作物，通过光合作用将太阳能转换成化学能蕴涵在植物有机体内。建立在生物质发酵法的燃料乙醇生产，是以谷物、玉米、小麦、薯类、糖蜜等为原料，经发酵、蒸馏制得，将发酵法乙醇进一步脱水后形成变性燃料乙醇。生物质乙醇生产存在许多缺憾之处。首先，它将争夺消耗众多的植物资源，使得粮食、饲料的供应出现紧缺。其次，生物质生产乙醇需要考虑原料和乙醇运输问题，生物质预处理以及固体废弃物处理等问题。再者，生物质生产乙醇生产过程排放的温室气体二氧化碳将加剧全球温度的升高。为克服上述新能源生产存在的问题，有必要研发新型生物技术用以生产乙醇。对此，加拿大EnnolEnergyInc.申请'的专利(美国专利号6，306，639，2001年；和6，699，696，2004年)以及美国夏威夷大学申请的美国专利("MethodsandCompositionforEthanolProducingCyanobacteria",pending,2007年)均涉及通过基因工程改造的蓝细菌生产乙醇。但是加拿大EnnolEnergyInc.专利技术存在如下缺陷a、蓝细菌单胞藻Sy"ec/20coccwPCC7942使用咸水培养液，生产线不易清洗，设备和管道易受盐分腐蚀；b、启动子为温度诱导，必须升高温度以表达乙醇生产基因。这会影响蓝细菌单胞藻活性；c、无耐热耐乙醇性能；d、乙醇生产浓度低；e、乙醇生产基因pdc和adh以质粒形式存在于单胞藻7942中，稳定性不好。需要使用大量抗生素维持单胞藻菌株内质粒的稳定性，因而提高了生产成本。另外，对于美国夏威夷大学专利技术，其存在的问题为-a、蓝细菌集胞藻6803的乙醇生产基因表达启动子为光诱导，夜间或阴天时乙醇生产效率下降；b、无耐热性能，插入来自Oe"ococcwsoew'的omrA基因或同源基因(丄m"，ZmrCD)提高耐乙醇性能没有得到实验数据确认；c、乙醇生产浓度不够高。
发明内容本发明的发明人为了解决上述问题进行了不懈的研究，结果通过定向进化蓝细菌集胞藻6803(购自美国AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，ATCCNumber:27184)而获得其突变株Synechocystisstrictus(简称为S.strictus)，该突变株具有较强的耐热耐乙醇性能。进一歩地，本发明人通过基因工程的手段对该菌株进行操作，最终使得集胞藻突变株能够集光合作用，二氧化碳收集和乙醇生产三功能于一体，从而完成了本发明。本发明涉及一种蓝细菌集胞藻的突变株、筛选这种集胞藻的突变株的方法、导入了编码丙酮酸脱羧酶多核苷酸和/或硝酸盐诱导的启动子序列的质粒表达载体、导入了编码丙酮酸脱羧酶多核苷酸和/或硝酸盐诱导的启动子序列的上述集胞藻突变株、以及上述突变株在制备乙醇中的应用。具体而言，本发明提供如下技术方案1、蓝细菌集胞藻，其保藏号为CGMCCNO.2137。2、筛选上述1所述的蓝细菌集胞藻的方法，其使用了热休克的方法。3、蓝细菌集胞藻，其为在上述1所述的蓝细菌中导入了编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸。4、上述3所述的蓝细菌集胞藻，其中所述的多核苷酸为(a)多核苷酸，其含有由序列号1碱基序列组成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有与序列号1的碱基序列组成的多核苷酸或序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的多核苷酸；或(C)多核苷酸，其为序列号1的碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸。5、上述4所述的蓝细菌集胞藻，其进一步含有硝酸盐诱导的启动子。6、上述5所述的蓝细菌集胞藻，其中所述的启动子为(a)多核苷酸，其含有由序列号2碱基序列组成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有与序列号2的碱基序列组成的多核苷酸或序列号2的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有硝酸盐诱导的启动子活性的多核苷酸；或(c)多核苷酸，其为序列号2的碱基序列和/或其互补碱基序列组成的多核苷酸。7、上述3-6任意一项所述的蓝细菌集胞藻，其中所述的编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸和/或启动子是由质粒表达载体所承载。8、上述7所述的蓝细菌集胞藻，其中所述的质粒表达载体序列为序列号3所示的序列。9、上述1-8任意一项所述的蓝细菌在生产乙醇中的应用。图1重组质粒pSKBPDC的结构示意图。图2重组质粒pPDCNIRA的结构示意图。图3在户外利用光生物反应器观察乙醇生成率的试验，其中图3a为温度变化曲线，图3b为细胞浓度和乙醇生产能力。具体实施例方式对于所有能够生产乙醇的微生物细胞(例如大肠杆菌，酵母菌，运动发酵单孢菌等)而言，已知乙醇生产路径是从糖酵解途径的丙酮酸经过乙醛再到末端代谢产物乙醇。丙酮酸到乙醛的反应过程由丙酮酸脱羧酶基因pdc控制，乙醛到乙醇的反应过程由乙醇脱氢酶基因adh控制。蓝细菌存在地球已有35亿年以上，是地球上最古老的生物之一。它的适应能力非常强，可忍受高温，冰冻，缺氧，干涸及高盐度，强辐射等许多恶劣生存条件。由于其基因组中不存在丙酮酸脱羧酶基因pdc，造成野生株集胞藻6803的乙醇生产路径残缺，因而不具有乙醇生产能力。本发明采用基因工程的方法，对一种低等水生绿色植物蓝细菌(Cyanobacteria，简称蓝细菌，俗称蓝绿藻或蓝藻)进行改造。从而使得蓝细菌吸收太阳光中的能量，直接将二氧化碳转换为乙醇。本发明使用的蓝细菌集胞藻Synechocystissp.PCC6803(以下简称为"集胞藻6803")是一种非丝状和非固氮淡水菌株，兼具自养和异养生长能力。集胞藻6803是第一个基因组被完全测序的光自养微生物(Ikeuchietal.,TanpakushitsuKakusanKoso1996,41(16):2579-2583)，这为藻类基因工程的发展奠定了重要基础。集胞藻6803可以融合外源DNA，通过同源重组把外源DNA整合到染色体DNA上。因为能够自然转化，它的基因组可通过重组DNA技术进行精确调节(Aoki"a/.,JMicrobiolMethods2002,49(3):265-74.,Vermaasda/"ProcNatlAcadSciUSA,1986,83(24):9474-9477,Williams,MethodsEnzymol.，1988,167:766—778)。所以，集胞藻6803是一种研究利用植物放氧光合作用的生物和代谢过程的理想系统。它也是藻类基因工程研究中常用的表达系。人们已将解毒酶基因、人源超氧化物歧化酶基因及小鼠金属硫蛋白基因成功地转入到集胞藻6803中(孙军.生物工程进展，1994，14(6):3942)。本发明是利用基因工程技术人工合成丙酮酸脱羧酶pdc和nirA启动子，将其与高表达质粒载体PSKAIIKS连接，构建出了重组质粒pPDCNIRA，然后将其插入以"热休克"定向进化而筛选的蓝细菌集胞藻突变株51.^7'd"5,从而连通乙醇合成路径，构建出重组菌株，其中所述的蓝细菌集胞藻突变株S.具有很强的耐热耐乙醇能力。构建出的该重组菌株可以用硝酸盐诱导，高效地利用太阳光能和二氧化碳生产乙醇，从而使得该集胞藻重组菌株能够集光合作用，二氧化碳收集和乙醇生产三功能于一体。本发明的发明人通过"定向进化"的方法提高集胞藻6803耐热耐乙醇能力。使用二氧化碳(co2)作为碳源的大规模燃料乙醇生产需要采用室外封闭式管道蓝细菌集胞藻工业用光合生物反应器系统并且在日间采集太阳光满足蓝细菌光合反应的需求。一般集胞藻的生长温度在3(TC左右，而夏季中午室外温度可能高达4CTC以上，这对集胞藻的正常生长和燃料乙醇生产能力带来了不利的影响。例如，野生株集胞藻6803在未加温度控制的室外光合生物反应器内培养，使用BG-ll培养液。由于日间的高温很快便使得蓝细菌叶绿素全部失活，从而产生"白化"现象，失去生长能力；再者，野生株集胞藻6803加温度控制的实验室光合生物反应器内培养，采集50毫升置于小瓶中，放入45。C水浴箱内"热休克"二小吋后取出。放回30。C摇床培养，三天后蓝细菌同样产生了完全的"白化"现象。燃料乙醇工业生产如果需要增加温度控制，将会额外增加设备和能源方面的投资。本发明的发明人采用了"定向进化"的方法提高蓝细菌耐热能力，使其能够在高温条件下正常生长和生产燃料乙醇，从而避免了温度控制的需要。蓝细菌突变株提高耐热能力的同时，也会提高耐乙醇能力。由"定向进化"获得的蓝细菌集胞藻突变株除了耐热能力之外，还具有耐乙醇能力。使用蓝细菌生产燃料乙醇的一大问题是当乙醇在培养液中积累到一定的浓度(例如5%浓度)，就会阻碍蓝细菌的生长。当乙醇浓度继续增加，蓝细菌可能开始死亡。提高蓝细菌集胞藻耐乙醇能力成为燃料乙醇生产的一个关键因素。最新研究结果表明，温度升高，乙醇浓度增加等外界不利因素，对细胞会产生类似的应力，都会使得细胞内热休克蛋白高度表达(Royetal.,JOURNALOFBACTERIOLOGY,180(15):39974001,1998;Glatzetal,ActaBiologicaSzegediensis.46(3-4):53,2002)。同时，研究结果表明也表明，耐热耐乙醇具有交互性(Micheletal.,1986)。当大肠杆菌，酵母菌和蓝细菌的抗热能力增加时，它们的抗乙醇能力也同时增力B(Horvathetal.,Biochemistry,95:3513—3518，1998)。在野生株蓝细菌和"定向进化"蓝细菌菌株中加入5%乙醇进行培养，三天后发现野生株蓝细菌集胞藻6803出现"白化"，而"定向进化"的集胞藻突变株未受影响。本发明将通过上述定向进化而筛选的蓝细菌集胞藻突变株命名为蓝细菌集胞藻6)，te"erj's加ecte/"/s(简称为6:"/7'"^)，该微生物于2007年8月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)进行了保藏，保藏编号为CGMCCNO.2137)。本发明釆用分子克隆技术将人工合成的丙酮酸脱羧酶基因pdc(序列号1)和可用硝酸盐诱导的nirA启动子(序列号2)与蓝细菌集胞藻6803的同源高表达质粒载体PSKAIIKS连接,构建出了重组质粒pPDCNIRA，再转入上述蓝细菌集胞藻突变株，从而构建出重组菌株，该工程菌可以用硝酸盐诱导，高效地利用太阳光能和二氧化碳生产乙醇。本发明采用化学诱导的nirA启动子(不受温度，光照影响)达到稳定高效的乙醇生产基因表达，提高乙醇生产效率；而且本发明采用"热休克"定向进化获取具有耐热耐乙醇性能的蓝细菌集胞藻突变株。另夕卜，相比而言，EnnolEnergyInc.和夏威夷大学的实验数据均产生自实验室内光生化反应器，而本发明人除了用实验室内光生化反应器外，还使用户外实验装置获得了比它们更高的乙醇生产结果。为获得生产乙醇的本发明的蓝细菌集胞藻，可将编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸导入上述所获得的蓝细菌集胞藻突变株，只要导入的多核苷酸能够编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽就能够实现本发明的目的，这样的多核苷酸优选为序列号l所示的序列。另一方面，本领域的普通技术人员应当理解的是，本发明所使用的酮酸脱羧酶基因和可用硝酸盐诱导的启动子序列并不限于序列号l和序列号2所述的序列，编码具有酮酸脱羧酶活性的蛋白质的其它多核苷酸或核酸以及其它的可被硝酸盐诱导的启动子序列均可用于本发明。例如，本发明所述的丙酮酸脱羧酶基因以及可用硝酸盐诱导的启动子序列也包含如下多核苷酸，其含有与序列号l或序列号2碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且具有丙酮酸脱羧酶活性或硝酸盐诱导的启动子活性的多核苷酸，或者其含有与序列号1或序列号2碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且具有丙酮酸脱羧酶活性或硝酸盐诱导的化学启动子活性的多核苷酸。此处的"在严格条件下杂交的多核苷酸"，是指由序列号1或序列号2的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。杂交方法，例如可禾U用MolecularCloning3rdEd.、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons1987-1997等中所述的方法。对于本说明书中所述的"严格条件"，例如为5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、32。C的条件；或者，例如为5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、42。C的条件；或者，例如，为5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、50。C的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严格性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，可实现同样的严格条件。还需要注意的是，本文所述的乙醇不仅仅指燃料乙醇，其它用途的乙醇也包含在本发明之内。以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不限于以下实施例。实施例1具体操作野生株集胞藻6803接种在光合生物反应器组内(由一个改装摇床内置6个150ML摇瓶组成，工作液为50ML)，且由BG-ll培养液培养，摇床内置光源，反应器表面光强度约为200Einstein/m2/s。摇床温度调控在低于30°C，速度为200RPM。5天后放入热水浴箱内加温热休克。然后放回30。C光合生物反应器内，待产生了完全的"白化"现象后(约3天)，离心分离集胞藻6803细胞，倒掉上清液，使用新鲜BG-11培养液培养"白化"的集胞藻6803细胞。适应了热休克的集胞藻细胞将会重新生成叶绿素，进而恢复光合作用和生长能力。同时，细胞的代谢机理会发生缓变，集胞藻突变株将能适应温度的升高。本发明人花费了一年的时间反复进行上述蓝细菌集胞藻细胞热休克-白化-复苏的"定向进化"过程，逐渐增加温度(从35。C升到47°C)和热休克时间(从30分钟升到4小时)。最后得到了本发明保藏的集胞藻突变株，其能在夏季室外高温条件(>45。C)下正常生长。实施例2:丙酮酸脱羧酶基因pdc和nirA启动子设计由生物信息学的方法，很容易获得丙酮酸脱羧酶基因pdc和nirA启动子的序列(本发明的发明人使用日本KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes提供的搜索引擎http://www.kegg.com/获得丙酮酸脱羧酶基因pdc和nirA启动子的序列)。Pdc(序列号1)和nirA(序列号2)可以依次用人工合成的方法获得(Roy,etal.EuropeanJournalofBiochemistry.191(3):647-652，1990;Shabalina,etal.NucleicAcidsRes.34:2428-2437，2006;Satyaetal.ProcIEEEComputSocBioinformConf.2:294-305，2003;Kim，etal.Gene.199:293-301，1997)。将上述获得的序列用Sanger方法(F.Sanger,Science,214,1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。实施例3:pdc基因转化集胞藻突变株根据蓝细菌集胞藻6803内源质粒PSBAIIKS中氨卡青霉素抗性基因、和果聚糖蔗糖酶基因^cfi的位置和序列，为转化丙酮酸脱羧酶基因pdc设计了一对PCR引物P1(序列号4)和P2(序列号5):P1(5端引物)5，誦GGAGTAAGCATATGAGTTATACTG國3，NdelP2(3'端引物)5,-GGATCTCGACTCTAGAGGATCC-3,BamHI其中引物Pl设计了一个NdeI酶切位点，其序列为CAITATG，引物P2设计了一个BamHI酶切位点，其序列为GGATCIC。以常规PCR扩增法扩增后得1410bp的pdcDNA片段P。PCR反应物在0.5mL无菌离心管中依次加入去离子水3610XTaq酶缓冲液5fxl;4XdNTP(2.5mmol/L)5pl;Pl引物l^il;P2引物1^1;模板(即人工合成的pdc)Taq酶(3U/fi1)lfil。共50pl。PCR反应热循环参数首先94'C预变性5分钟.；接着94"C变性30秒.；50。C复性45秒.；72。C延伸50秒；35个循环；72。C再延伸5分钟.；4'C终止。反应结束后，取2.5^1PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(2XTAE,100V电压，40分钟)，在电泳图谱上出现一条约1410bp亮带，表明要扩增的是预期要转化的pdc基因片段。电泳回收1410bp片段。根据引物中的酶切位点，用限制性内切酶Ndel和BamHI同时双酶切片段P和载体PSBAIIKS，然后用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌co//C600，通过Amp筛选获得重组质粒pSKBPDC，该质粒大小为5.58kb(图1)。如图1所示，人工合成的丙酮酸脱羧酶基因pdc被插入启动子psbAII的下游，即原来aphX和sacB基因的位置。利用自然转化将整合表达载体导入集胞藻突变株S.Wn'"M，并通过单交换同源重组使人工合成的丙酮酸脱羧酶基因pdc整合到集胞藻突变株51.Wn'"w染色体上。转化后，先将含蓝细菌集胞藻突变株S.WnW^细胞的BG-ll培养液涂布在复盖在不含氨苄青霉素(Amp)的BG-11固体培养基上的Millipore滤膜上培养20小时，然后转移滤膜至含氨苄青霉素浓度为15pg/ml的BG-ll固体培养基上进行筛选培养。一周后，滤膜上出现抗Amp的绿色单藻落，即为转化集胞藻菌株。重复BG-ll固体培养基培养并逐步提高氨节青霉素浓度，可筛选得到遗传性状稳定的转基因集胞藻突变株S.Wn'"w。为了证明外源基因已整合到集胞藻突变株51.WW"^染色体上，从而整个乙醇合成路径(丙酮酸—乙醛—乙醇)已被连通，使用希夫试剂(Schiff，sreagent)测试乙醛的生成。野生株集胞藻6803没有pdc基因，不能催化丙酮酸—乙醛反应，希夫试剂加在BG-ll固体培养基上的野生株集胞藻6803菌落时，没有颜色变化。然而，希夫试剂加在BG-ll固体培养基上的转基因集胞藻突变株S.^7'"^菌落时，菌落及周边变成暗红色。表明集胞藻产出的乙醛与希夫试剂发生反应。实施例4:nirA启动子转化集胞藻本发明人进一歩用硝酸盐诱导nirA启动子置换pSKBPDC中的psbAII启动子，从而变光诱导为化学诱导。nirA启动子引物设计如下Tl(序列号6)(5'端引物)5，—GAGAGAGAGCTGCAGAGCGTTCCAGTGGATATT-3'PstlT2(序列号7)(3'端引物)5，-ATTATATATATCATATGTTCATCTGCCTACAAAGCAGC-3'Ndel其中引物Tl设计了一个PstI酶切位点，其序列为CTGCA1G，引物T2设计了一个NdeI酶切位点，其序列为CA1TATG。以常规PCR扩增法扩增后得528bp的nirA片段T。PCR反应物在0.5mL无菌离心管中依次加入去离子水3610XTaq酶缓冲液5|il;4XdNTP(2.5mmol/L)5jxl;Pl弓l物P2引物liil;模板(即人工合成的nirA启动子)l)til;Taq酶(3U/iul)1^1。总共50pl。PCR反应条件与扩增1410bp的pdcDNA片段P相同。反应结束后，取2.5^1PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(2XTAE，100V电压，40分钟)，在电泳图谱上出现一条约528bp亮带，表明要扩增的是预期要转化的nirA启动子片段。电泳回收528bp片段。根据引物中的酶切位点，用限制性内切酶Pstl和Ndel同时双酶切片段T和载体质粒pSKBPDC，然后用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌五.co//C600，以Amp筛选，获得重组质粒pPDCNIRA(图2)，该质粒大小为5.96kb。利用自然转化将整合表达载体导入集胞藻突变株S.欲/c加。转化后，先将含蓝细菌集胞藻S.细胞的BG-ll培养液涂布在不含氨苄青霉素(Amp)的BG-ll固体培养基上的Millipore滤膜上，并培养20小时，然后转移滤膜至含氨苄青霉素浓度为5)Lig/ml的BG-ll固体培养基上进行筛选培养。一周至10天后，滤膜上出现抗Amp的绿色单藻落，即为转化集胞藻菌株。重复BG-ll固体培养基培养并逐步提高氨苄青霉素浓度(至浓度为15|ag/ml),可筛选得到遗传性状稳定的集胞藻突变株S.WW^^工程菌。挑取生长好的不同藻落接种到6个150ML摇瓶组成，BG-ll培养液工作液位为50ML的光合生物反应器组培养，摇床内置光源，反应器表面光强度约为200Einstein/m2/s。摇床温度调控在低于30°C，速度为200RPM。5天后，从6个反应器各取lml悬浮液，离心得上清液。用酶反应试剂(R-Biopharm,Inc.,Marshall,MI,USA)测乙醇的生成浓度。经比较得乙醇高产集胞藻突变株S.欲&加菌株。实施例5:实验室内光生物反应器培养观察乙醇生成率液体培养实施例4中获得的集胞藻突变株S.^7'"M工程菌不但能确定外源基因已经得到高效表达，而且还提供优化生物反应过程的可能性。本实验室内光生物反应器为1升(CelliGenPlus,NewBrunswickScientificInc.,Edison,NJ,USA)。该系统自带温度，pH，转速，溶氧等测量和控制器。在此基础上，加装可调节光源，使反应器外壁光强达1000Einstein/m2/8。并设计计算机采样和控制系统，软件则用LabVIEW6.0(NationalInstrumentsCorp.,Austin,TX,USA)编程。在此系统中，硝酸盐诱导乙醇合成是在集胞藻工程菌细胞光学密度达OD730=0.5时开始的。结果，蓝细菌集胞藻工程菌生产的乙醇浓度可达14mM。实施例6:利用户外光生物反应器观察乙醇生成率在户外使用10升光生物反应器悬浮培养实施例4中获得的蓝细菌集胞藻突变株S.Wr/"附工程菌。用控制pH的方式控制二氧化碳的加入量。温度不加控制。该自制反应器由玻璃制成，上升管中加置内件可以有效地促进气泡的分散，改善气液两相的混合，强化二氧化碳传递过程。图5a为温度变化曲线，图5b为细胞浓度和乙醇生产能力。硝酸盐诱导乙醇合成是在集胞藻工程菌细胞光学密度达0073。=0.5时开始的。结果乙醇浓度可达50mM，比室内光生物反应器结果提高了约5倍。为了更清楚地理解本发明，将本发明与另外两个同类相关发明进行了对比，结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表<110〉黄娟<120〉基因工程改造的蓝细菌及其生产乙醇的用途〈130〉PIF072427C〈160〉7〈170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉1766〈212>DNA〈213〉人工序列〈220><223>首先根据生物信息学的方法获取序列信息然后人工合成的序列〈400〉1atgagttatactgtcggtacctatttagcgg解cggcttgtccagattggtctcaagcat60cacttcgcagtcgcgggcgactacaacctcgtccttcttgacaacctgct120aacatggagcaggtttattgctgtaacgaactgaactgcggtttcagtgcagaaggttat180gctcgtgcca卿gcgcagcagcagccgtcgttacctacagcgtcggtgcgctttccgca240tttgatgctatcggtggcgcctatgcagaaaaccttccggttatcctgatctccggtgct300ccg朋c朋caatgatcacgctgctggtcacgtgttgcatcacgctcttgg360tatcactatcggccaagaacatcacggccgcagctgaagcgatttacacc420ccagaagaagctccggctaaaatcgatcacctgctcttcgtgag^g犯g■ccggtttatctcgaaatcgcttgca^cattgcttccatgccctgcgccgctcctggaccg540gcaagcgcattgttcaatgscgaagccagcgacga已gcttctttgaatgc3gcggttg皿600gaaaccctgaaattcatcgccaaccgcgacaaagttgccgtcctcgtcggcagcaagctg660cgcgcagctggtgctga卿agctgctgtcaaatttgctgatgctctcggtggcgcagtt720gctaccatggctgctgcaaaaagcttcttcccagaagaaaacccgcattacatxggtacc780tcatggggtgaagtcagctatccgggcgtttga犯gaagccgatgcggtt840atcgctctggctcctgtcttcaacgactactccaccactggttggacggatattcctgat900tggttctcgctgaaccgcgttctgtcgtcgttaacggcgttcgcttcccc960agcgttcatctgaaagactatctgacccgtttggctcaga33gtttCC33gaaaaccggt1020gctttggacttcttcaaatccctcaatgcaggtgaactgaagaaagccgctccggctgat1080ccgagtgctccgttggtcaaCgC3g3a3tCgcccgtcaggtcgaagctcttctgaccccg1140aacacgacggttattgctgaaaccggtgactcttggttcaatgctcagcgcatgaagctc1200ccgaacggtgCtCgCgttg￡Latatgaaatgcagtggggtcacatcggttggtccgttcct1260gccgccttcggttatgccgtcggtgctccggaacgtcgcaacatcctcatggttggtgat1320ggttccttccagctgacggctcaggaagtcgctcagatggttcgcctgaaactgccggtt1380atcatcttctctatggttacaccatcgaagttatgatccatgatggtccg1440tcaagaactgggattatgccggtctgatggaagtgttcaacggtaacggt1500ggttatgacagcggtgctggtaaaggcctgaaggctaaaaccggtggcgaactggcagaa1560gctatcaaggttgctctggcaaacaccgacggcccaaccctgatcgaatgcttcatcggt1620cgtgaagactgcactgaagaattggtcaaatggggtaagcgcgttgctgccgccaacagc1680cgtaagcctgttaac33gctcctctagtttttggggatcaattcgagctcggtacccaaa1740ctagtatgtagggtgaggtt1766〈210〉2<211〉528〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉启动子〈400〉2g卿g卿gctgc卿gcgttccagtggatatttgctgggggttaatgaaacattgtggc60ggaacccagggacaatgtgaccaaaaaattcagggatatcaataagtattaggtatatgg120atcataattgtatgcccgactattgcttaaactgactgaccactgaccttaagagtaatg180gcgtgc皿ggcccagtgatcaatttcattatttttcattatttcatctccattgtccctg240gtgtcgcccctctacacagcccagaactatggtaaaggcgcacgaaaaac300cgccaggtaaactcttctcaacccccaaaacgccctctgtttacccattccctctcagct360caatgattacttaatgtttgttctgcgcaaacttcttgcagaacatgcat420aagttgtagtttctgttaccaattgcgaatcgagaactgcctaatctgcc480gagtatgcaagctgctttgtaggcagatgaacatatgatatatataat528〈210〉3<211>5962<212〉DNA〈213〉pPDCNIRA转化质粒<400〉3tcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggta60tcagctcactca卿gcggtaatacggttatCC￡LC3gaatcaggggataacgcagga卿120aacatgtgagcaaaaggccagcaaa已ggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcg180tttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctc卿tcagagg240tggcgaaacccgacsggacta^33gataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg300cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggga360agcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgc420tccaagctgggctgtgtgcaCg33CCCCCCgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt■aactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccact540ggtaacaggattagcagagcgagg城gtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtgg600cctaactacggctacactag^ga^cagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtt660accttcggaa認gagttggtagctcttgatccggcaaacaa3cc3ccgctggtagcggt720ggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaa犯aaaggatctcaagaagatcct780ttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttg840gtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaa11aaaaatgaagtttt■aaatcaatcta^gtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagt960gaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtc1020gtgtagataactacgatacgg眺ggcttaccatxtggccccagtgctgcaatgataccg1080cgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggcc1140gtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgg1200gaagct卿gtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctaca1260ggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacga1320tc卿gcgagttacatgatcccccatgttgcggttagctccttcggtcct1380ccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactg1440cataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactca1500accaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaata1560cgggataataccgcgccacatagcagaacttcatcattggaaaacgttct1620tcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccact1680cgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaa1740aaaatgccgcaaaaa^gggaat犯gggcgacacggaaatgttgaiatactc1800atactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgga1860<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>ggtttattgctgaactgcggtttcagtgcagaaggttatgctcgtgccaa3660aggcgcagcagcagccgtcgttacctacagcgtcggtgcgctttccgcatttgatgctat3720cggtggcgcctatgcagaaaaccttccggttatcctgatctccggtgctccgaaca^caa3780tgatcacgctgctggtcacgtgttgcatcacgctcttggcaa^ccgsct3tc3ctatca3840gttggaaatggccaagaacatcacggccgcagctgaagcgatttacaccccagaagaagc3900tccggctaaaatcgatcacgtgatt33aactgctcttcgtcggtttatct3960cgaaatcgcttgcaacattgcttccatgccctgcgccgctcctggaccggcaagcgcatt4020gttcaatgacgaagccagcgacgaagcttctttgaatgcagcggttgaaga^accctgaa4080attcatcgccaaccgcgacaaagttgccgtcctcgtcggcagcaagctgcgcgcagctgg4140tgctgaagaaaatttgctgatgctctcggtggcgcagttgctaccatggc4200tgctgcaa已aagcttcttccc3g33g3aaacccgcattacatcggtacctcatggggtga4260agtcagctatccgggcgttg朋aagacgatgaaagaagccgatgcggttatcgctctggc4320tcctgtcttcaacgactactccaccactggttggacggatattcctgatc4380ggttxtcgctgaaccgcgttctgtcgtcgttaacggcgttcgcttccccagcgttcatct4440g333g3ctatctgacccgtttggctcagaaagtttccaagaaaaccggtgctttggactt4500cttcaaatccctcaatgcaggtgaactgaagaaagccgctccggctgatccgagtgctcc4560gttggtcaacgcagaaatcgcccgtcaggtcgaagctcttctgaccccgaacacgacggt4620tattgctgaaaccggtgetctcttggttcaatgctcagcgcatgaagctccCg33CggtgC4680tcgcgttgaaagtggggtcacatcggttggtccgttcctgccgccttcgg4740ttatgccgtcggtgctccggaacgtcgcaacatcctcatggttggtgatggttccttcca4800gctgacggctctcagatggttcgcctgaaactgccggttatcatcttctt4860gatcaataactatggttacaccatcg已已gttatgatccatgatggtccgt4920ca已gaactgggattatgccggtctgatggaggt認ggtggttatgacag4980cggtgctggtaaaggcctg3aggctaaaacCggtggCg33ctggc卿agctatcaaggt5040tgctctggcaaacaccgacggcccaaccctgatcgaatgcttcatcggtcgtga卿ctg5100cactgaagaattggtcaaatggggt卿cgcgttgctgccgccaacagccgt犯gcctgt5160taacaagctcctctagtttttggggat固ttcgagctcggtscccaaactagtstgtsg5220ggtg鄉ttatagcttaattccttggtgtaatgccaactgaataatctgc5280ctccttcaatggggggtgctttttgcttgactgagt已atcttctgattgctgatcttgat5340tgccatcgatcgccggggagtccggggcagttaccattagagagtctaga5400atcttcgatagaggaattatggggga卿acctgtgccggcggataaagca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技术领域：
，具体涉及一种蓝细菌集胞藻突变株、筛选这种集胞藻突变株的方法、导入了编码丙酮酸脱羧酶多核苷酸和/或硝酸盐诱导的启动子序列的质粒表达载体、导入了编码丙酮酸脱羧酶多核苷酸和/或硝酸盐诱导的启动子序列的上述集胞藻突变株、以及上述突变株在制备乙醇中的应用。文档编号C12P7/06GK101372669SQ20071014278公开日2009年2月25日申请日期2007年8月23日优先权日2007年8月23日发明者娟黄申请人:娟黄