专利名称：检测碱性鞘磷脂酶的分析方法以及用于该方法的试剂盒的制作方法
检测碱性鞘磷脂酶的分析方法 以及用于该方法的试剂盒本案为分案申请，母案申请号为02825879.7 (国际申请号 PCT/IT02/00811 )，申请日为2002年12月19日，发明名称为"检测 碱性鞘磷脂酶的分析方法以及用于该方法的试剂盒"。本发明涉及一种评估需要此种评估的患者粪便或生物学流体中的 碱性鞘磷脂酶的分析方法。本发明还涉及用于该方法的试剂盒。更具体地，本发明方法是用于检测碱性鞘磷脂酶的体外荧光分析 方法，其中所述碱性鞘磷脂酶(如下所述)是严重的病理状态如结肠 癌及家族性腺瘤性息肉的标记物。鞘磷脂酶(鞘磷脂磷酸二酯酶，SMase)催化鞘磷脂水解为神经 酰胺及磷酸胆碱。迄今为止，已经鉴定了三种不同的SMase (酸性、中性和碱性), 它们以如下的几种同工型存在-溶酶体酸性SMase ( A - SMase );-胞质Zn2 +依赖性酸性SMase;-膜中性镁依赖性SMase ( N - SMase );-胞质镁非依赖性N-SMase;和-碱性SMase 。SMase显示在许多生理和病理过程中起作用，包括内吞SM的
溶酶体水解、神经酰胺介导的细胞信号传输、动脉粥样硬化形成、终 末分化、细胞周期抑制、细胞凋亡、炎症形成及调节真核生物应激反 应。与通常存在于细胞中分别充当溶酶体及膜固定酶的酸性和中性SMase相反，碱性SMase显示出组织和种属差异性。对人而言，碱性 SMase存在于肠粘膜和胆汁中。碱性SMase首先产生于十二指肠，在 肠内具有较高的含量，特别是在空肠末端，并在结肠和直肠内含量很 高。该SMase的最佳碱性pH值为9.0，并且是Mg2+非依赖性的、胆 盐依赖性的和胰蛋白酶抗性的。碱性SMase的病理学重要性最近才被认识到，由于以下原因促进 了某些研究的发展。首先，该酶可能负责主要存在于奶、蛋、肉和鱼中的饮食鞘磷脂 的水解。其次，该酶可能调节胆固醇的吸收。第三，碱性SMase在肠道中的存在以及其在结肠直肠癌中检测到的选择性降低说明该酶在肠道癌变中起作用，因为在生理条件下，该酶刺激细胞凋亡，保护肠粘膜免遭癌变。先前的研究表明，在生理条件下，碱性SMase可被胆盐从肠粘膜 解离进入腔内。然而，在病理条件下，由于胆盐浓度反常的升高，被 胆盐解离的碱性SMase便超过了正常的酶生物合成，导致碱性SMase 在粘膜中的低活性水平，及反常的粪便或生物学流体即胆汁中酶的排 泄的升高。因此，超过了正常的基础值的过量碱性SMase在粪便或生 物学流体中的排泄可作为结肠直肠癌变及家族性腺瘤性息肉的有价值的诊断标记物；因此，有需要获得可靠的检测方法以检测可能处于前 述肠道病理状态的患者粪便或生物学流体中的碱性SMase。
另外， 一些细菌(如Streptococcus termophilus Lactobacilli)含 有高水平的SMase，对碱性SMase的评估可以提供评估所述细菌数量 变化的方法，也就是说，用微生态调节剂或/和基于微生态调节剂的 产品治疗后进行。
先前的评估碱性SMase的方法是>5^知的。SMase的活性可以进行 体内确定，即用SM的放射性前体标记细胞，然后确定标记产物的水 平，或者也可以用放射性标记的SM或SM的显色类似物、或中性SM 的着色或荧光衍生物进行体外确定。
这些已知的方法由于具有放射性而有潜在的危险，并且敏感度低 于荧光检测而并不完全令人满意。
本发明的一个目的是提供可靠的、不昂贵的检测可能患有结肠直 肠癌及家族性腺瘤性息肉、或胆囊或肝脏疾病的患者粪便或生物学流 体中的碱性SMase的方法，该方法克服了已知方法的缺陷。
本发明进一步的目的是提供用于上述检测方法的检测试剂盒。
本发明的另一个目的是评估在不同的健康条件下，或疾病之后或 用药物或微生态调节剂或食物补充剂治疗后的细菌繁殖情况。
附图简述
图l表示应用荧光检测法检测鞘磷脂酶，每个反应物包括所示量 的特定检测緩冲液中的细菌鞘砩脂酶。反应物在37t:孵育一小时，用 荧光微板读取器测定荧光。在530nm波长下激发，并在5卯nm波长 下检测焚光。
本发明的间接荧光分析方法是基于以下顺序的反应。
在存在于粪便或其它生物学流体中的碱性SMase的作用下，鞘磷 脂水解为神经酰胺和磷酸胆碱，在碱性磷酸酶的作用下，磷酸胆碱水解产生胆碱。在胆碱氣化酶的存在下，胆碱生成过氣化氢(H202). 在辣根过氧化物酶的存在下，过氧化氢与10-乙酰基-3，7-二羟基吩
噁嗪(H202的灵敏的荧光探针)(以下称为"Amplex Red试剂，，)发生 反应，产生高荧光物质试卣灵。荧光是用荧光计数微板荧光仪，在 530-560nm下激发，并在590nm下检测的。根据前述的反应顺序和荧光检测方法，本发明的用于检测粪便中 的碱性SMase的检测方法包括以下步骤。然而，对于本领域普通技术 人员来说，很明显本方法可以容易地进行一些常规改变而应用于生物 学流体，如胆汁。1) 收集患者的粪便样品并干燥；2) 称取大约3-4克干燥样品，并悬浮于20ml包含0.25M蔗糖、 0.15M的KC1、 50mM的KH2P04的匀浆緩冲液中，pH值7.4;3) 在+4。C, 4000rpm下离心样品60分钟；4) 回收上清液，再在+4。C， 4000rpm下离心15分钟；5) 应用Pierce Protein Assay,使用牛血清白蛋白作标准参照，测 定上清液中的蛋白含量，对于每个样品，所用的蛋白浓度在"mg/ml -40mg/ml之间，每孑L吸入25jil样品；6) 每25jil样品加入65nl包含50mM Tris/HCl、 2 mM EDTA、 0.15M NaCl的pH值9.0的緩沖液和10^1 29fiM的鞘磷脂，并加入3mM 浓度的胆盐(TC、 TDC、 GC、 GCDC);7) 在37。C下孵育1小时；8) 吸量每种标准参照物各lOOjil和10fU鞘磷脂(29jiM )，如样品 一样在37。C下孵育1小时；9) 1小时后，加入lOOfil包含50 mM Tris/HCl(pH7.4)、 10mM |3画 磷酸甘油、750fiM ATP、 5 mM EDTA、 5 mM EGTA、 IOOjiM的Amplex Red、 8U/ml碱性磷酸酶、0.2U/ml胆碱氧化酶、2U/ml辣根过氧化酶的反应緩冲液；10) 避光在37。C下孵育1小时或更长；11) 使用范围在530 - 560nm的激发光源和荧光微板读取器在
590nm检测发射荧光；12)对每一个值，通过减去非鞘磷脂酶对照值来校正背景荧光。本发明还涉及根据前述的检测方法用于检测患者粪便或生物学流 体中的碱性鞘磷脂酶的检测试剂盒，其中包含分别含有以下试剂样品 的测试管a) 将被存在于粪便或生物学流体中的碱性鞘磷脂酶水解以生成 磷酸胆碱的神经鞘磷脂；b) 用于催化磷酸胆碱水解成胆碱的碱性磷酸酶；c) 用于氧化胆碱至过氧化氢的胆碱氧化酶；d) 用于辅助过氧化氢反应的辣根过氧化物酶；e) Ampler Red试剂(10-乙酰基-3,7-二羟基吩噍嗪)，用于得到荧 光化合物试卣灵，其荧光为存在于粪便或生物学流体中的碱性SMase 的标i己；以及f) 用作标准浓度的冻干的细菌鞘磷脂酶。为了本发明的分析方法的适当应用，除上述的试剂盒成分外，以 下的材料和设备也是需要的蔗糖；氯化钾(KC1); 磷酸二氢钾(KH2P04); Trizma base^ EDTA; 氯化钠；牛磺胆酸(TC);牛磺脱氧胆酸(Taurodeoxycholate) ( TDC ); 甘氨胆酸(GC);
羟鹅脱氧胆酸(GCDC);P-磷酸甘油；ATP 二钠盐；EGTA;BCA Protein Assay Reagent;牛血清白蛋白；冷冻离心才几；能够在550-562nm下检测的微板读数器，和荧光计数微板荧光仪。 为完成SMase活性的定量，将进行以下的检测。 标准曲线的制作试剂盒中有标准的SMase制品，该制品由含有在pH9起作用的 SMase的细菌提取物組成。进行以下操作。制作SMase校准曲线稀释标准浓缩液，得到一系列稀释液。用lml检测緩冲液(pH值9.0)重构SMase标准液，得到96mU/ml 的贮备溶液。吸量0.500ml的检测緩沖液于每管中。应用贮备溶液得到一系列 稀释液。下一次转移前将每管完全混和。未稀释的标准液作高浓度标 准(96mU/ml)，标准曲线包括以下浓度值(mU/ml): 96-48-24-12-6-3。 緩沖液作为0浓度标准(0 mU/ml )。典型标准曲线在附
图1中的标准曲线仅用作示范。对每一个测试样品都要制作
标准曲线。计算结果求算每一标准品和样品的两次读数的平均值，并减去零浓度标准 的荧光平均值。绘制标准品的焚光对标准品活性(mU/ml)的最佳曲线。为了确 定每一样品的SMase活性，首先找到y-轴上的荧光值，再水平延伸至 标准曲线上。在交点处垂直延伸至x-轴，可读取相应的SMase活性。所述的方法可以体外检测SMase的活性；已经发展了用于检测有 机样品中的碱性SMase的方法。为特异性检测碱性SMase，该方法应用检测酸性和中性SMase活 性的条件。实际为-匀浆緩冲液处于中性pH值，但没有蛋白酶和磷酸酶抑制剂从 而可以排除中性SMase，因为后者对蛋白酶和磷酸酶的活性敏感并因 此被这些酶抑制；-在匀浆緩沖液中没有MgCl2，从而阻断了 Mg依赖性中性 SMase的活性；-反应緩冲液包含P-磷酸甘油和ATP以防止酸性SMase在中性 pH值具有过多活性，在该緩沖液中，EDTA和EGTA均以高浓度存 在，以抑制中性SMase。
权利要求
1.一种检测患者粪便中的碱性鞘磷脂酶的方法，包括以下步骤1)收集患者的粪便样品并使其干燥；2)称取大约3-4克干燥样品，并悬浮于20ml包含0.25M蔗糖、0.15M的KCl、50mM的KH2PO4并且pH值为7.4的匀浆缓冲液中；3)在+4℃，4000rpm下离心样品60分钟；4)回收上清液，再在+4℃，4000rpm下离心15分钟；5)应用Pierce Protein Assay测定上清液中的蛋白含量，使用牛血清白蛋白作为标准参照，对于每个样品，所用的蛋白浓度在32mg/ml-40mg/ml之间，吸取25μl各样品至孔中；6)向各25μl样品加入65μl包含50mM Tris/HCl、2mM EDTA、0.15M NaCl的pH值为9.0的检测缓冲液和10μl 29μM的鞘磷脂，并向检测缓冲液中加入3mM浓度的胆盐(TC、TDC、GC、GCDC)；7)在37℃下孵育1小时；8)吸取每种冷冻干燥的细菌鞘磷脂酶标准参照100μl和10μl神经鞘磷脂(29μM)，与样品一样在37℃下孵育1小时；9)1小时后，加入100μl包含50mM的pH值为7.4的Tris/HCl、10mM β-磷酸甘油、750μM ATP、5mM EDTA、5mM EGTA、100μM的Amplex Red、8U/ml碱性磷酸酶、0.2U/ml胆碱氧化酶、2U/ml辣根过氧化酶的反应缓冲液；10)在避光条件下于37℃孵育反应物1小时或更长时间；11)用荧光微板读取器检测荧光，其中激发波长为530-560nm，并在590nm处检测发射光；12)对每一个值，通过减去非鞘磷脂酶对照的值来对背景荧光进行校正。
2. 权利要求l的方法，其应用于生物学流体。
3. —种检测患者粪便或生物学流体中的碱性鞘磷脂酶的试剂盒， 其中含有分别包含以下试剂样品的检测管 a) 将被存在于粪便或生物学流体中的碱性鞘磷脂酶水解以生成 磷酸胆碱的鞘磷脂；b) 用于催化磷酸胆碱水解成胆碱的碱性磷酸酶；c) 用于氧化胆碱至过氧化氢的胆碱氧化酶；d) 用于辅助过氧化氢反应的辣根过氧化物酶；e) Ampler Red试剂(10-乙酰基-3，7-二羟基吩鳴"秦)，用于得到荧 光化合物试卣灵，其焚光为存在于粪便或生物学流体中的碱性SMase 的才示i己；以及f) 用作标准浓;l的冻干的细菌鞘磷脂酶。
4. 一种检测来自患者的生物学材料中的碱性鞘磷脂酶的方法，包 括以下步骤1) 收集生物学材料样品；2) 悬浮样品于包含0.24-0.26M蔗糖、0.14 - 0.16M的KCl、 45 -55mM的KH2P04的匀浆緩沖液中，该緩沖液的pH值调节至约7.4;3) 至少离心样品一次，回收上清液；4) 测量上清液的蛋白含量；5) 向上清液样品中加入包含44- 55mM Tris/HCl、 1.9 - 2.2 mM EDTA、 0.14-0.16M NaCl并且pH值为8.9-9.1的检测緩冲液和 28-30nM的鞘磷脂以及含有浓度为2.9-3.1mM的胆盐(TC、 TDC、 GC、 GCDC)的检测緩冲液；6) 在大约37。C下孵育检测混和物大约1小时；7) 步骤6)的样品与28-31jiM的鞘磷脂混和，在约WC下孵育 约1小时；8) 加入包含pH7.3-7.5的45- 55 mM Tris/HCl、 9一llmM卩-磷酸甘油、745- 755nMATP、 4 - 6 mM EDTA、 4 - 6 mM EGTA、 95 -105jiM的Amplex Red试剂、7 - 9U/ml碱性磷酸酶、0.1 - 0.3U/ml 胆碱氧化酶和1.5 - 2.5U/ml辣根过氧化酶的反应緩冲液；9) 在避光条件下于约37。C下孵育所述反应混和物至少1小时；10) 检测荧光，使用530-560nm的激发光，并在约590n'm下检测发射光。
5. 权利要求4的方法，其中对每一个样品，通过减去非鞘磷脂酶 对照的值使荧光读数对背景荧光进行校正。
6. 权利要求4或5中的方法，其中蛋白含量是通过Pierce Protein Assay检测的。
7. —种检测患者生物学样品中碱性鞘磷脂酶的试剂盒，其中包括a) 鞘磷脂；b) 碱性磷酸酶；c) 胆碱氧化酶；d) 辣根过氧化物酶；e) Ampler Red试剂；f) 冻干的细菌鞘礴脂酶。
8. —种检测碱性鞘磷脂酶的方法，其基本如此处参照附图的描述。
9. 一种检测碱性鞘磷脂酶的试剂盒，其基本如此处参照附图的描述，
全文摘要
本发明披露了一种荧光分析方法及用于该方法的检测试剂盒，该方法用于检测需要此种检测的患者粪便中的碱性鞘磷脂酶(SMase)，因为碱性SMase是重症病理状态，如结肠癌，的标记物。
文档编号C12Q1/44GK101126716SQ200710147169
公开日2008年2月20日 申请日期2002年12月19日 优先权日2001年12月21日
发明者西蒙 C·德 申请人:艾蒂尔药物有限公司