专利名称：：发酵生产木霉菌酯素的方法及所用的发酵培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及微生物领域，具体地说是一种用于紫杉木霉(7yc/70ctem7atex/')液体深层发酵生产木霉菌酯素的培养基及其工艺。
背景技术：
：由立枯丝核菌(尺A/zoctoA7/'aso/aA7/')引起的纹枯病和立枯病、由灰葡萄孢菌(8of:yf/sc/'nerea)引起的灰霉病是农业生产中的重要病害，目前生产上主要靠农业防治和化学防治控制其危害，如灰霉病化学防治主要依赖施佳乐、速克灵等化学药剂。由于抗药性问题等，从天然动植物、微生物中寻找新型生物活性物质，并进行新型生物农药的研究开发是现代农药工业的一个重要研究领域。从南方红豆杉分离得到的内生真菌菌株ZJUF0986(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号CGMCC1672)属于一种木霉属新种紫杉木霉，其产生的新结构化合物木霉菌酯素(trichodermisin)对重要植物病原真菌立枯丝核菌和灰葡萄孢菌有很强的抑制作用(申请号200610050963.5)。筛选配方简单、原料易得且价格便宜、产物量多的发酵培养基，是紫杉木霉菌株ZJUF0986能尽早应用于农业生产首先要解决的问题。不同菌种发酵培养需要的营养条件是不相同的，虽然所采用的原材料大同小异，哪怕是配比有极少的变化，其发酵结果也会不尽相同。在某一特定的场合，采用一种独特配方的培养基和一种特定的工艺，将会使发酵效果增强、产物成份含量稳定、有效成份显著增加。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种以紫杉木霉液体发酵生产木霉菌酯素的方法及所用的发酵培养基，该种发酵培养基原料易得且价格便宜，使用本发明的方法生产木霉菌酯素，具有产物量多的特点。为了解决上述技术问题，本发明提供一种发酵培养基，该发酵培养基的组成为葡萄糖15.816.2g/L、淀粉25.626.Qg/L、蛋白胨1.92.1g/L、硫酸镁0.91.1g/L、硝酸钠0.40.6g/L、磷酸氢二铵1.92.1g/L和氯化钾0.40.6g/L，其余为水。也就是说将葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硫酸镁、硝酸钠、磷酸氢二铵和氯化钾溶于水形成混合液，葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硫酸镁、硝酸钠、磷酸氢二铵和氯化钾在混合液中的浓度分别是15.816.2g/L、25.626.0g/L、1.92.1g/L、0.91.1g/L、0.40.6g/L、1.92.1g/L和0.40.6g/L。作为本发明的发酵培养基的改进，发酵培养基的组成为葡萄糖16.0g/L、淀粉25.8g/L、蛋白胨2.0g/L、硫酸镁1.0g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸氢二铵2.0g/L和氯化钾0.5g/L，其余为水。本发明还同时提供了利用上述发酵培养基发酵生产木霉菌酯素的方法，包括以下步骤1)、先将保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986在PDA培养基上进行活化；活化后，用打孔器切取菌落边缘菌饼；2)、将上述菌饼接种到内装液体种子培养基的培养容器中，于28'C3(TC、180r/min的条件下避光培养72小时，得种子液；3)、将种子液接入内装发酵培养基的发酵罐中依次进行以下发酵步骤，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:10:初期温度控制在28'C30'C，通气搅拌，培养时间为120小时，中期将温度降低到25'C，提高通气比；当还原糖浓度降到9.510.5g/L且溶解氧开始缓慢上升时，补加质量浓度为20%的淀粉溶液；所述淀粉溶液中的淀粉是发酵培养基中的淀粉重量的30%，控制发酵罐中的PH值为5.06.0，培养时间为48小时；后期降低通气比至初期状态，培养时间为72小时；得发酵液。在上述发酵步骤的初期pH自然调节；即不需要进行pH人工的调节，任其自然即可。在上述发酵步骤的中期可利用氢氧化钠人工调节的方式来控制发酵罐中的PH值。在上述发酵步骤的后期当还原糖降到1g/L以下时，镜检可知菌丝开始自溶，形成节孢子停止培养，得发酵液。作为本发明的发酵生产方法的改进将上述发酵液离心分离后得澄清液，再将澄清液依次经萃取、干燥和真空浓缩后得木霉菌酯素粗提物。作为本发明的发酵生产方法的进一步改进整个步骤3)的发酵过程中，发酵罐内的压力控制在0.03MPa0.05Mpa;步骤3)的初期通气比为1:0.5V/V/min，搅拌转速为200r/min;中期通气比为1:1V/V/min;后期通气比为1:0.5V/V/min。作为本发明的发酵生产方法的进一步改进步骤2)将10粒直径为5mm的菌饼接入200ml液体种子培养基中，以1000ml种子瓶作为培养容器。作为本发明的发酵生产方法的进一步改进，该液体种子培养基组成为葡萄糖20.0g/L、淀粉15.0g/L、蛋白胨2.0g/L、尿素0.5g/L、硫酸镁1.0g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸氢二铵2.0g/L、氯化钾0.5g/L和碳酸钙0.4g/L，其余为水。作为本发明的发酵生产方法的进一步改进步骤i)在28'C30。C活化培养5天。本发明的发明人在发明过程中，对紫杉木霉菌株ZJUF0986在以往的研究基础上采用均匀设计，在并采用二项多次逐步回归建模，选取初步优化点进行验证，最后确定紫杉木霉液体深层发酵生产木霉菌酯素的最佳培养基配方。紫杉木霉菌株ZJUF0986液体深层发酵培养基的筛选，具体步骤如下1、在初步实验的基础上确定葡萄糖及淀粉这2个因子为重要的变量，设12个水平数；其余8个因子(即蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二铵、尿素、氯化钾、硝酸钠、硫酸镁、碳酸钙)设置6个水平数。按照方开泰等研究的均匀设计试验方法，利用唐启义等编制的DPS数据处理系统进行设计。由于试验中各因子的水平数不相等，应用混合水平均匀设计方法构造混合水平的均匀设计表。首先在DPS电子表格中输入、定义有关参数，然后在系统菜单方式下点击"试验设计"—"均匀设计"—"混合水平均匀设计"，然后在系统提示的对话框中输入试验次数及要求随机优化运行时间的限制，后点击"确认"按钮后即可运行。2、发酵生产木霉菌酯素，依次进行以下步骤1)、先将保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986在PDA培养基上进行活化；活化后，用打孔器切取菌落边缘菌饼。具体内容同以下实施例2的步骤1)。2)、将上述菌饼接种到内装液体种子培养基的培养容器中避光培养；得种子液。具体内容同以下实施例2的步骤2)。3)、将种子液以发酵培养基10%(体积比)的比例分别接入内装100mL不同配方的供试发酵培养基的500mL三角瓶中，依次进行以下发酵步骤初期温度控制在28i:3CrC，通气搅拌，转速为200r/min;pH自然调节；反应时间为120小时；中、后期将温度降低到25'C，培养一段时间后镜检菌丝开始自溶，形成节孢子后停止培养，得发酵液。发酵培养基在灭菌之前调节初始pH值为5.5，装瓶后按121'C/20min的条件进行蒸汽高压灭菌备用。这些不同配方的供试发酵培养基具体如表1所示。表1、供试发酵培养基(g/L)试验方案及产生的木霉菌酯素(pg/mL);<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>积的色谱纯乙腈，混匀后离心去除沉淀，用高效液相色谱检测木霉菌酯素含量。试验设计及结果如表1所示。此基础培养基配方为蔗糖10.8g/L、淀粉20.0g/L、蛋白胨0.93g/L、酵母粉0.86g/L、尿素0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、硝酸钠0.12g/L、磷酸氢二铵0.73g/L、氯化钾0.17g/L、碳酸钙0.43g/L。菌株ZJUF0986采用基础培养基液体深层发酵制备生产木霉菌酯素，所得的发酵液HPLC图谱具体如图2所示。我们将试验设计结果通过二次多项次回归建模分析，相关系数R-I.OOOOO、F值=22727.23864、显著水平p=0.0052、剩余标准差S=0.00435、调整后的相关系Ra=0.99998，得回归方程Y=249.3657508-77.67414990X4+4.154517113X5-102.75389793X7-218.13832655X10+16.941006108X6*X6-23116645668X9*X9+25.958161454X1*X7+9.514581383X1*X10+0.4416517784X2*X3+14.827696642X2*X8-203.21954043X3*X8+105,50280591X3*X9-26.027309738X4*X6-255.78291240X4*X7-146.49737981X4*X9+350.9823963X4*X10-45.44974055X5*X6-72.29890786X5*X10+108.45180454X6*X9-0.5115435996X6*X10+1166,9989311X8*X9-1210.1287644X8*X10因此所得的优化培养基配方为葡萄糖16.0g/L、淀粉25.8g/L、蛋白胨2.0g/L、磷酸氢二铵2.0g/L、硝酸钠0.5g/L、硫酸镁1.0g/L、氯化钾0.5g/L，其余为水。按优化配方进行验证，测试结果接近理论拟合值。本发明的关键是以淀粉为主要碳源，诱导菌体酶的分泌，促使淀粉快速分解为还原糖，提高碳源的利用率，从而促使菌体的快速生长。本发明所述的培养基原料为常见、廉价的农副产品，用量少，成本低，可以大规模的扩大生产。本发明的另一重要发明点是紫杉木霉利用本发明的培养基及其工艺进行液体深层发酵产物单一，副产物少；木霉菌酯素基本上都分泌在发酵液中，且产素水平比基础培养基明显提高，而且发酵液透明澄清，大大简化了提取工艺，提取简单、纯化容易。在以相同的紫杉木霉菌株ZJUF0986作为原料，且其余发酵生产方法步骤和内容相同的前提下，采用本发明的发酵培养基所得的产素量是基础培养基的2.4倍。在本发明中，高效液相色谱检测所用的方法同本申请人同一天申请的另一篇专利《木霉菌酯素的测定方法及用途》。具体内容如下1、色谱条件1)、WatersC18分析柱(sunfireC185|jm4.6X250mm)2)、Waters的二元高压梯度泵(1525binaryHPLCpump)3)、Waters2487检测器(Waters2487DualAAbsorbanceDetector)4)、77251手动进样器(KIT72251Manualinjector1500series)5)、流动相为乙腈水=3:2(V:V)6)、流速0.8ml_/min1.2mL/min，例如为1.0mL/min7)、进样量20iJL8)、检测波长为193nm9)、温度室温2、所用仪器设备1)、Waters液相色谱仪，配Waters的二元高压梯度泵(1525binaryHPLCpump)、Waters2487检测器(Waters2487DualAAbsorbanceDetector)、77251手动进样器(KIT72251Manualinjector1500series)2)、色谱工作站Breeze3)、高速台式离心机Sigma1-15K4)、电子天平METTLERAB204-E5)、旋转蒸发器RE-52AA6)、P關定仪METTLERTOLEDO3203、所用试剂1)、乙腈HPLC美国WestonScientific2)、水三蒸水(自帝!J)3)、其它所用试剂均为国产分析纯。'下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1为菌株ZJUF0986采用本发明的发酵培养基液体深层发酵制备生产木霉菌酯素的发酵液HPLC图谱；图2为菌株ZJUF0986采用基础培养基液体深层发酵制备生产木霉菌酯素的发酵液HPLC图谱(与实施例2的区别为以基础培养基替代了发酵培养基)；图3为利用本发明的发酵培养基发酵生产木霉菌酯素的工艺流程图。具体实施例方式实施例l、制作发酵培养基将葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硫酸镁、硝酸钠、磷酸氢二铵和氯化钾溶于水形成混合液，葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硫酸镁、硝酸钠、磷酸氢二铵和氯化钾在混合液中的浓度分别是16.0g/L、25.8g/L、2.0g/L、1.0g/L、0.5g/L、2.0g/L和0.5g/L。即所得的发酵培养基的组成为葡萄糖16.0g/L、淀粉25.8g/L、蛋白胨2.0g/L、硫酸镁1.0g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸氢二铵2.0g/L和氯化钾0.5g/L，其余为水。实施例2、一种发酵生产木霉菌酯素的方法，依次进行以下步骤(如图3所示)1)、先将低温(即-20'C)保存的编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986接种在PDA培养基上，于28'C3(TC活化培养5天，活化处理后，用打孔器切取菌落边缘菌饼；2)、将上述直径为5mm的菌饼10粒接入到内装液体种子培养基的1000mL三角瓶中(1000mL的三角瓶装200mL液体种子培养基)，28。C30。C、180r/min避光培养72小时，得种子液。液体种子培养基组成葡萄糖20.0g/L、淀粉15.0g/L、蛋白胨2.0g/L、尿素0.5g/L、硫酸镁1.0g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸氢二铵2.0g/L、氯化钾0.5g/L、碳酸钙0.4g/L，其余为水。3)、选用10升机械通气发酵罐(FJG-10，江苏格瑞生物技术有限公司)作为发酵罐，选用实施例1所得的发酵培养基。将上述步骤2)所得的种子液以发酵培养基10%(体积比)的比例接入内装发酵培养基的发酵罐中，依次进行以下发酵步骤(在整个发酵过程中罐压控制在0.03MPa0.05MPa之间，培养时间共为240小时)初期温度控制在28'C3(TC，通入空气进行搅拌，通气比1:0.5V/V/min，搅拌转速为200r/min,pH自然调节；培养时间为120小时，中期将温度降低到25'C，提高通气比，使通气比为1:1V/V/min，当还原糖浓度降到10g/L左右、溶解氧(DO)开始缓慢上升时补加质量浓度为20%的淀粉溶液，一次性补加量为淀粉溶液中的淀粉是发酵培养基中的淀粉重量的30%，用氢氧化钠人工调节的方式来控制发酵罐中的PH值为5.06.0，培养时间为48小时；后期温度保持在25"C，停止补加碳源，降低通气比，使通气比为1:0.5V/V/min;当还原糖降到1g/L以下时，镜检发现菌丝开始自溶，形成节孢子后将所得的发酵液放罐;培养时间为72小时。所得的发酵液HPLC图谱如图1所示。4)、收集上述发酵液，离心分离后得澄清液5升，再将澄清液用5升石油醚分三次萃取，将有机相用无水硫酸钠干燥后，50°C真空浓縮得淡黄色粗提物6.0克。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。权利要求1、一种发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基的组成为葡萄糖15.8～16.2g/L、淀粉25.6～26.0g/L、蛋白胨1.9～2.1g/L、硫酸镁0.9～1.1g/L、硝酸钠0.4～0.6g/L、磷酸氢二铵1.9～2.1g/L和氯化钾0.4～0.6g/L，其余为水。2、根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基的组成为葡萄糖16.0g/L、淀粉25.8g/L、蛋白胨2.0g/L、硫酸镁1.0g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸氢二铵2.0g/L和氯化钾0.5g/L，其余为水。3、一种利用权利要求1或2所述的发酵培养基发酵生产木霉菌酯素的方法，其特征在于包括以下步骤1)、先将保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986在PDA培养基上进行活化；活化后，用打孔器切取菌落边缘菌饼；2)、将上述菌饼接种到内装液体种子培养基的培养容器中，于28'C3(TC、180r/min的条件下避光培养72小时，得种子液；3)、将种子液接入内装发酵培养基的发酵罐中依次进行以下发酵步骤，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:10:初期温度控制在28'C30'C，通气搅拌，培养时间为120小时，中期将温度降低到25'C，提高通气比；当还原糖浓度降到9.510.5g/L且溶解氧开始缓慢上升时，补加质量浓度为20%的淀粉溶液；所述淀粉溶液中的淀粉是发酵培养基中的淀粉重量的30%，控制发酵罐中的PH值为5.06.0，培养时间为48小时；后期降低通气比至初期状态，培养时间为72小时；得发酵液。4、根据权利要求3所述的发酵生产木霉菌酯素的方法，其特征是将所述发酵液离心分离后得澄清液，再将澄清液依次经萃取、干燥和真空浓縮后得木霉菌酯素粗提物。5、根据权利要求3或4所述的发酵生产木霉菌酯素的方法，其特征是整个步骤3)的发酵过程中，发酵罐内的压力控制在0.03MPa0.05Mpa;步骤3)的初期通气比为1:0.5V/V/min，搅拌转速为200r/min;中期通气比为1:1V/V/min;后期通气比为1:0.5V/V/min。6、根据权利要求5所述的发酵生产木霉菌酯素的方法，其特征是所述步骤2)将10粒直径为5mm的菌饼接入200ml液体种子培养基中，以1000m附子瓶作为培养容器。7、根据权利要求6所述的发酵生产木霉菌酯素的方法，其特征是所述液体种子培养基组成为葡萄糖20.0g/L、淀粉15.0g/L、蛋白胨2.0g/L、尿素0.5g/L、硫酸镁1.0g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸氢二铵2.0g/L、氯化钾0.5g/L和碳酸钙0.4g/L，其余为水。8、根据权利要求7所述的发酵生产木霉菌酯素的方法，其特征是所述步骤1)在28'C30'C活化培养5天。全文摘要本发明公开了一种发酵培养基，其组成为葡萄糖15.8～16.2g/L、淀粉25.6～26.0g/L、蛋白胨1.9～2.1g/L、硫酸镁0.9～1.1g/L、硝酸钠0.4～0.6g/L、磷酸氢二铵1.9～2.1g/L和氯化钾0.4～0.6g/L，其余为水。本发明还公开了利用上述发酵培养基发酵生产木霉菌酯素的方法，包括以下步骤1)先将保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986在PDA培养基上进行活化；2)将活化所得的菌饼接种到内装液体种子培养基的培养容器中培养，得种子液；3)将种子液接入内装发酵培养基的发酵罐中进行发酵。使用本发明的方法生产木霉菌酯素，具有产物量多的特点。文档编号C12P7/62GK101168757SQ20071015639公开日2008年4月30日申请日期2007年11月2日优先权日2007年11月2日发明者林福呈,王国平,章初龙,郑必强申请人:建德市大洋化工有限公司