专利名称：一种异养硝化菌的筛选方法
技术领域：
本发明属于污水处理领域，具体涉及一种异养硝化菌的筛选方法。
背景技术：
废水的生物脱氮是目前水处理领域中研究的热点问题，长期以来人们一直 认为硝化菌是由一些自养菌组成。但是，当环境条件不适合自养硝化菌生长时，
也会生长一些具有硝化活性的异养微生物。例如早在1894年Stutzer和Hartleb描述 过一株真菌的异养硝化现象(Stutzer H， Hartleb R.Uber nitrabildung zentralbl bakteriol parasitonkd infktionskr. Hyg Abt 1 Oring Reihe A, 1894， 22:701)。从那以 后，许多报道都证实了铵盐生成硝酸盐/亚硝酸盐的过程不仅存在于自养的氨氧 化菌(如M^wowowaO或亚硝酸盐氧化菌(如7Wto^cfe。中，许多真菌和异养 菌中也普遍存在这禾中ft谢路斗5 (Johnsrud S C., Heterotrophic nitrification in acid forest soil. Holarctic Ecology, L, 1978， 27-30; Robertson A. L,， Dalsgaard T" Revsbach N. R and Kuenen G. J. Confirmation of aerobic denitrification in batch cultures using gas chromatography and N mass spectrometry. FEMS Microbiology Ecology, 1995, 18， 113-120.)。对异养硝化菌脱氮作用的研究，是对传统硝化-反 硝化理论的丰富与突破(温东辉，唐孝炎.异养硝化及其在污水脱氮中的作用. 环境污染与防治,2003, 25 (5): 283-285;林燕，孔海南，何义亮，等.异养硝化细 菌的分离及其脱氮特性试验研究.环境科学,2006,27(2):324-328)。与传统的自 养硝化菌相比，虽然单位生物量的异养菌氧化铵盐的速率比自养菌要慢2-3个数 量级，但异养菌的生长速率快，对环境的适应能力也强，其总体的氧化铵盐的 速率并不比自养菌慢。在某些环境中异养硝化作用能与自养硝化作用相当甚至 超出(方苹，范伟平，沈珈琦，等.氨氮脱除的生物技术研究进展.南京工业大学学J艮，2003， 25(5): 107-110; Brierley EDR， Wood M. Heterotrophic nitrification in an acid forest soil: isolation and characterisation of a nitrifying bacterium. Soil Biol. Biochem,2001，33: 1403-1409)。虽然目前对异养硝化作用仍有很多机理未得到 揭示，但异养硝化作用的重要性日益受到关注，特别是具有好氧反硝化特性的 异养硝化细菌的发现，为污水脱氮引入了全新的概念，从理论上进一步增加了 污水硝化与反硝化在一个单元内同步进行的可能性，有望克服传统处理工艺在 处理效率与经济适用两方面的矛盾，实现废水高效而经济的脱氮。
中国专利CN1884480A描述了一种利用牛肉膏培养基进行富集，然后从牛肉 膏蛋白胨固体培养基中挑取单菌落，再顺序接种于氨化培养基和亚硝化培养基 中进行培养纯化获得异养硝化菌的过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选异养硝化菌的方法，用于高氨氮工业废水生 化处理过程，以解决传统废水生化处理过程中自养硝化菌生长缓慢带来的高氨 氮废水处理难的问题。
本发明异养硝化菌的筛选方法包括以下内容 (1 )通过逐步提高氨氮负荷的方法培养能够耐受高氨氮负荷的富集硝化菌 的活性污泥；
(2) 从富集硝化菌的活性污泥中分离纯化异养硝化菌。
对于步骤(2)分离纯化的异养硝化菌可以进行性能考察和种属鉴定
(3) 考察分离纯化的异养硝化菌的硝化作用；
(4) 分离纯化的异养硝化菌的种属鉴定。
其中步骤(1)富集硝化菌活性污泥的培养过程如下采用间歇式活性污泥 法，通过逐渐提高培养液氨氮浓度的方法来进行富集，所用富集培养液包括微 量元素Fe、 Mg、 Na和K及缓冲液，所述的富集培养液中还包括Ca^， C^+浓度 为0.01 0.05g/L， Ca2+是采用CaCl2的形式加入的。其中氨氮(NH3-N)初始浓度为50mg/L 200mg/L，最终浓度为300 mg/L 1200mg/L，优选为500 mg/L 1000mg/L;化学需氧量(COD铬法)^200mg/L。
本发明方法步骤(1)中所述的富集培养液中，微量元素Fe、 Mg、 Na和K可 采用常规的用量和常用物质引入，优选如下Fe是以FeS04 7^0的形式加入的， Fe2+的浓度为2mg/L 14 mg/L，最好为3 11 mg/L; Mg是以MgS04 '7&0的形 式加入的，Mg"浓度为10 20m g/L; Na+是以NaCb、 Na2C03禾n^NaHC03的 形式加入，Na+浓度为200 1000mg/L; K是以KH2P04禾P^K2HP04的形式加入， K+浓度为20 70mg/L;所述的缓冲液为KH2 P04、 K2H P04和NaHC03中的一种 或多种，其浓度为50 300mg/L。
步骤(1)所述的富集培养液中所需的COD可通过加入葡萄糖或甲醇，以及 其它一些含碳有机化合物，具体的加入量可根据所处理废水中的COD来确定， 与废水COD值相适应。所述的活性污泥可以选取本领域常用的具有硝化作用的 活性污泥，优选取自炼油污水处理厂的活性污泥和催化剂污水处理厂的活性污 泥。所述硝化细菌富集培养的条件为温度为20 30。C; pH为6.0 9.0，优选 6.5~8.0; SV (污泥沉降比)为15% 25%; DO (溶解氧)为大于2mg'L一卜 优选为2 10 mg丄—、通过逐渐提高培养液氨氮浓度的方法培养富集硝化菌的活 性污泥，具体如下每次加入培养液后，当氨氮浓度降至10mg/L以下，最好是 用GB 7479蒸馏滴定法检测不出水中氨氮浓度，即低于0.2mg/L时，提高预加入 培养液中氨氮的浓度，其提高幅度为50 200mg/L，直至与所需处理废水中氨氮 浓度相适应。
步骤(2)所述从富集硝化菌的活性污泥中分离纯化异养硝化菌的培养基 (HNM)成分为每升含有氨氮0.4 1.5g/L，可以是一切可以作为微生物氮源的
化合物，如(NH4)2S04，尿素等，这里首选(NH4)2S04作为氮源；碳源与氮源重量
比为5 15，碳源可以选用一切微生物可以利用的含C有机化合物，如甘油，葡 萄糖，甲醇，琥珀酸钠等，这里首选甘油作为碳源。营养盐溶液20 90ml (固 体培养基加入1.2% 2%的琼脂)。营养盐溶液每升含有K2HP04 3 8 g，MgS04 *7H20 2 5 g， NaCl 2 5 g， Fe '7H20 0.02 0.08 g， MgS04 '4H20 0.02 0.08 g， EDTA2 5 g， EDTA作为避免产生沉淀的阳离子络合剂。操作过程如下: 从富集硝化菌的活性污泥中取泥水悬浮液5ml，利用超声细胞破碎仪把呈絮状的 活性污泥打散，静置30min，取上层液体0.5-2ml接种于100ml HNM培养基中 (30°C， 200rpm)培养24 96h，其间定期利用5-l(P/。(w/v)灭菌的NaHC03调 节培养物的pH为7.0 8.5。然后将培养物样品稀释103 108倍，将稀释液按 1% 5%的比例转接于新鲜的HNM培养基中，30°C ， 200rpm振荡培养24 96h， 检测氨氮浓度降低最明显的样品涂布于HNM固体培养平皿表面，3(TC培养24 96h，挑取单菌落，作为初筛菌划在斜面上保存在4。C冰箱备用。
步骤(3)所述考察分离纯化的异养硝化菌的硝化作用操作过程如下从冰 箱保存的菌种斜面上各挑取1环菌泥接种于100ml新鲜的HNM培养基中，30 °C， 200rpm振荡培养24 96h至对数末期，保持无菌状态下收集菌体(采用离 心或过滤等一切可以分离菌体的固液分离手段，这里首选离心)，重新悬浮于 200ml灭菌的HNM培养基中(可以选择加C源的HNM或不加C源的HNM)， 30°C， 200rpm振荡培养。每隔一定时间(如24h)换用新鲜的HNM培养基， 并对已处理的HNM检测氨氮浓度，亚硝酸盐氮浓度和硝酸盐浓度。对加C源 的HNM培养基，氨氮浓度下降最多，而且亚硝酸盐氮和硝酸盐浓度积累最少的 菌株为最优菌株；而对不加C源的HNM培养基，由于没有C源，不能实现同 步硝化与反硝化，氨氮降解的速率会相对较快，但亚硝酸盐氮浓度或硝酸盐浓 度会同步积累。
步骤(4)所述分离纯化的异养硝化菌的种属鉴定采用一切微生物学已知的 细菌或真菌鉴定的方法，如生理生化检测和16S/18S rDNA分析方法等。
所述的富集培养液中，加入适量的Ca2、 一方面为硝化细菌生长提供微量 元素，另一方面由于硝化细菌具有附着于固体颗粒表面生长的特性以及硝化细 菌的比重轻易浮于水面的特点，所以生成一定量的CaC03沉淀会增大硝化细菌的 附着表面，也减少了硝化细菌在换水过程中的流失。此外，以(^2+的形式加入，还可以在调节培养液pH值过程中起到缓冲作用。但C^+的加入量不能过高，否 则生成大量的CaC03破坏硝化细菌的生长环境。
本发明针对氨氮含量高(NH3-N含量2200mg/L)、有机物含量少(COD 含量低于200mg/L)的废水的特点，通过逐渐提高基质氨氮质量浓度的方法，并 采用适宜的以无机盐为主要组分的培养液，在不加入其它碳源或只加入少量有 机物的情况下，使污泥中的原生动物、后生动物、真菌以及碳化菌等杂菌的生 长明显受到抑制，有利于硝化细菌成为优势菌群，并耐受越来越高的氨氮浓度， 最终达到处理浓度高达1200mg/L、容积负荷高达卯OgNH3-N/m^d的氨氮废水， 使污水中高浓度氨氮能够降到10mg/L以下。本发明方法可以获得纯的异养硝化 菌，有利于提高氨氮污水的有效处理，具有良好的应用前景。
图1为实施例1硝化污泥富集培养过程脱氨氮情况。 图2为实施例3废水脱氮处理效果情况。 图3为实施例4高氨氮废水处理效果情况。 其中图2和图3中
- -为残留的NH3-N -參-为产生的N02-N
-■-为产生的N03-N -▲-为NH3-N去除率
具体实施例方式
实施例l硝化污泥富集
采用的硝化菌富集装置反应池底设曝气头，气升式搅拌；反应体系有效体 积2.2L，每24h停止曝气静置30min，换1.5L新水；活性污泥来自抚顺石油三 厂废水处理车间曝气池，初始SV30为30。/。；培养参数T (温度)25 3(TC; pH:6.5 8.5;溶氧DO2.0 mg/l;缓慢加入卯g/L的NaHC03溶液补充硝化菌降 氨氮消耗的碱度。氨氮进水为人工配制的富集培养液，逐渐提高富集培养液中的NHs-N浓度，富集能够耐受高浓度氨氮的硝化菌。所用的富集培养液组成为
(NH4)2S04、 FeS04-7H20、 MgS04-7H20 、 NaCl、 CaCl2禾QKH2P04，浓度如 下NH3-N净顶g被为86.9mg/L，最终浓度为1400 mg/L; Fe"浓度为12mg/L; Mg"浓度为18mg/L; Na+浓度为800mg/L; Ca2+浓度为16mg/L; 1012 04浓度 为260mg/L。经过7个月的试验，NH3-N负荷从0.054 kgNH3-N/(mM)增加至1.02 kgNH3-N/(m3d)，处理效果见图l。
在进水氨氮浓度低于1000mg/L时，每天氨氮去除率>80%，而且大部分时 间氨氮去除率在90%以上。氨氮浓度越高，脱除越困难，特别是每次增加氨氮负 荷，都会降低体系的氨氮去除率，但是经过驯化培养，最后都能恢复，而且恢 复之后比较稳定，最终得到能够耐受1400mg/L氨氮的硝化菌群。
实施例2从富集硝化菌的活性污泥中分离纯化异养硝化菌
从富集硝化菌的活性污泥中分离纯化异养硝化菌的培养基(HNM)采用每 升含有(NH4)2S04 2.4g/L，甘油16g/L，营养盐溶液40 ml (固体培养基加入2% 的琼脂)。营养盐溶液每升含有K2HP04 6.4 g， MgS04 7H20 3 g， NaCl 2.5 g， Fe 7H20 0.04 g， MgS04 4H20 0.05 g， EDTA 4 g。操作过程如下从富集硝 化菌的活性污泥中取泥水悬浮液5ml，利用超声细胞破碎仪把呈絮状的活性污泥 打散，静置30min，取上层液体0.5ml接种于100ml HNM培养基中(3(TC ， 200rpm) 培养48h，其间定期利用9W(w/v)灭菌的NaHC03调节培养物的pH为8.0。然后 将培养物样品稀释105倍，将稀释液按5。/。的比例转接于新鲜的HNM培养基中， 30°C， 200rpm振荡培养48h，检测氨氮浓度降低最明显的样品涂布于HNM固 体培养平皿表面，3(TC培养96h，挑取单菌落，获得一株异养菌FN-4，划斜面 保藏于4"C冰箱中备用。
实施例3 FN-4菌体对高COD高氨氮废水的同步硝化与反硝化
把FN-4接种于含C的HNM培养基中3(TC， 200rpm振荡培养48h，离心收集细 胞，重新悬浮于200ml含有300mg/mL氨氮、24 g/L甲醇的人工配水(模拟高COD，高氨氮废水)中，30°C， 200rpm振荡培养，每24h离心收集菌体换新鲜的HNM 培养基，其间定期利用碱溶液调节反应体系中因降解氨氮消耗的碱度。出水检 测氨氮，亚硝氮和硝氮浓度，结果见图2。同时设置未加菌的摇瓶加入人工配水 空摇作为初始氨氮浓度的对照， 一共做了16次对照，取平均值为278mg/L氨氮。
氨氮去除率在35%到50%之间，但是能够同时硝化与反硝化把氨氮直接降解
成Ny
实施例4 FN-4菌体对低COD高氨氮废水的硝化作用
把FN-4接种于含C的HNM培养基中3(TC， 200rpm振荡培养48h，离心收集细 胞，重新悬浮于200ml含有300mg/mL氨氮的人工配水(模拟低COD，高氨氮废 水)中，3CTC， 200rpm振荡培养，每24h离心收集菌体换新鲜的HNM培养基，
其间定期利用碱溶液调节反应体系中因降解氨氮消耗的碱度。出水检测氨氮， 亚硝氮和硝氮浓度，结果见图3。初始氨氮浓度对照与实施例3同。
从图3可知，菌株FN-4对人工配制的不含有机物(COD)的氨氮废水(主要 模拟催化剂废水)具有很强的降解能力，经过一个星期左右的适应，脱除率即 达到100%。
权利要求
1、一种异养硝化菌的筛选方法，包括以下内容(1)通过逐步提高氨氮负荷的方法培养能够耐受高氨氮负荷的富集硝化菌的活性污泥；(2)从富集硝化菌的活性污泥中分离纯化异养硝化菌。
2、 按照权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(1)富集硝化菌活性 污泥的培养过程如下采用间歇式活性污泥法，通过逐渐提高培养液氨氮浓度 的方法来进行富集，所用富集培养液包括微量元素Fe、 Mg、 Na和K及缓冲液， 所述的富集培养液中还包括Ca2、 Ca^浓度为0.01 0.05g/L， Ca^是采用CaCl2 的形式加入的。
3、 按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的培养液的氨氮初始浓 度为50mg/L 200mg/L，最终浓度为300 mg/L 1200mg/L，化学需氧量^200 mg/Lc
4、 按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的培养液中，微量元素以 FeS04'7H20的形式加入，Fe2+的浓度为2mg/L 14 mg/L; Mg以MgS04 7&0的 形式加入，Mg2+浓度为10 20m g/L; Na+以NaCl2、 Na2C03禾喊NaHC03的形 式加入，Na+浓度为200 1000mg/L; K以KH2P04禾喊K2HP04的形式加入，K+ 浓度为20 70mg/L;所述的缓冲液为KH2P04、 K2HP04和NaHC03中的一种或多 种，其浓度为50 300mg/L。
5、 按照权利要求l所述的方法，其特征在于所述的活性污泥选取自炼油污 水处理厂的活性污泥或催化剂污水处理厂的活性污泥。
6、 按照权利要求l所述的方法，其特征在于所述的硝化细菌富集培养的条 件为温度为20 3(TC; pH为6.0 9.0; 污泥沉降比为15 % 25 %;溶解氧 为大于2 mg丄—、
7、 按照权利要求6所述的方法，其特征在于所述的硝化细菌富集培养pH为,6.5 8.0， i容解氧为2 10mg丄—、
8、按照权利要求l所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)所述从富集硝 化菌的活性污泥中分离纯化异养硝化菌的培养基成分为每升含有氨氮0.4 1.5g/L，碳源与氮源重量比为5 15;操作方法为从富集硝化菌的活性污泥中 取泥水悬浮液5ml，把呈絮状的活性污泥打散，静置后取上层液体0.5-2ml接种于 在培养基中培养24 96h，用NaHC03调节培养物的pH为7.0 8.5，然后将培养物 样品稀释103 108倍，将稀释液按1% 5%的比例转接于新鲜的培养基中培养 24 96h，检测氨氮浓度降低最明显的样品涂布于固体培养平皿表面，培养24 96h，挑取单菌落，划在斜面上保存备用。
全文摘要
本发明涉及一种异养硝化菌的筛选方法。本发明包括以下内容(1)通过逐步提高氨氮负荷的方法培养能够耐受高氨氮负荷的富集硝化菌的活性污泥；(2)从富集硝化菌的活性污泥中分离纯化异养硝化菌；(3)考察分离纯化的异养硝化菌的硝化作用；(4)分离纯化的异养硝化菌的种属鉴定。利用本发明方法筛选的异养硝化菌生长速率快，既能对高COD高氨氮工业废水进行同步硝化与反硝化，还能对低COD高氨氮废水进行高效的硝化作用。
文档编号C12N1/00GK101434905SQ20071015837
公开日2009年5月20日 申请日期2007年11月15日 优先权日2007年11月15日
发明者佟明友, 唐似茵, 全 张, 高会杰, 黎元生 申请人:中国石油化工股份有限公司;中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院